Artigo de método

Lesão Traumática de Nervos Periféricos em Camundongos

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DOI:

10.3791/63551

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25 de março de 2022

 ,  ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, Korea University Guro Hospital, 2Department of Orthopaedics and Rehabilitation, Center for Orthopaedics and Translational Science, The Pennsylvania State University College of Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

O presente protocolo descreve lesões traumáticas de nervos periféricos (TPNIs), incluindo esmagamento precisamente calibrado, laceração estritamente alinhada e desalinhada, bem como lacunas enxertadas e não enxertadas do nervo ciático em camundongos. Sensores personalizados são desenvolvidos para avaliar o trauma nervoso, induzido com ferramentas comumente disponíveis para garantir resultados pós-TPNI reprodutíveis.

Resumo

A lesão traumática do nervo periférico (TPNI) é uma causa comum de morbidade após trauma ortopédico. Métodos reprodutíveis e precisos de lesão nervosa e desnervação muscular têm sido um objetivo na pesquisa musculoesquelética. Muitos membros traumaticamente lesionados têm trauma nervoso que define o resultado a longo prazo do paciente. Ao longo de vários anos, métodos precisos de produção de lesões nervosas microcirúrgicas foram desenvolvidos, incluindo esmagamento, lacerações e enxerto de lacuna nervosa, permitindo avaliações de resultados reprodutíveis. Além disso, novos métodos são criados para lesões por esmagamento calibradas que oferecem correlações clinicamente relevantes com os resultados usados para avaliar pacientes humanos. Os princípios de manipulação mínima para garantir baixa variabilidade na lesão nervosa permitem adicionar ainda mais lesões teciduais associadas a esses modelos. Isso inclui esmagamento muscular direto e outros componentes de lesões nos membros. Finalmente, a avaliação da atrofia e a análise precisa dos resultados comportamentais tornam esses métodos um pacote completo para estudar o trauma musculoesquelético que incorpora de forma realista todos os elementos da lesão traumática humana do membro.

Introdução

A lesão traumática de nervos periféricos (TPNI) é uma causa comum de morbidade após trauma ortopédico1,2,3. Anualmente, aproximadamente 3% dos pacientes traumatizados sofrem lesão nervosa 1,4, com incidência de 3,50.000 casos5, resultando em 50.000 reparos cirúrgicos6. As NPTs ocorrem em uma ampla faixa de gravidade, e a recuperação funcional depende diretamente do tipo e da gravidade dessas lesões 7,8,9. Traumas menos graves (por exemplo, esmagamento leve, laceração incompleta, etc.) lesionarão primeiro a bainha de mielina e os axônios, enquanto forças mais graves (por exemplo, esmagamento grave, lacerações completas, etc.) romperão os tecidos nervosos conjuntivos; por exemplo, o endoneuro, perineuro e epineuro, além da mielina e axônios 1,10. Pacientes com TPNI esperam que a função nervosa eventualmente retorne e a atrofia muscular seja revertida. Décadas de pesquisa não forneceram tratamentos precisos para melhorar ou garantir a recuperação completa, apesar dos avanços nos procedimentos de tratamento11,12.

As transecções nervosas não cicatrizam sem reparo cirúrgico, que geralmente é realizado ao microscópio. Os reparos são normalmente realizados de ponta a ponta, fazendo um esforço para garantir que o local do reparo não esteja sob tensão. O enxerto de nervo é usado para garantir que os reparos sejam sem tensão13,14. Apesar dos métodos aparentemente avançados utilizados nesses reparos, a recuperação funcional geralmente é inexpressiva11,12. A reabilitação é muitas vezes incompleta e insatisfatória. A recuperação funcional ideal requer que os axônios regeneradores atravessem o local da lesão (ponte nervosa) e inervam o órgão-alvo. Esses processos são complicados por desvio axonal ou retardo de crescimento, resultando em atrofia muscular e eventual falha na recuperação 15,16,17,18. Foi demonstrado que os resultados funcionais após o reparo do nervo (por exemplo, sutura término-terminal, isoenxerto, etc.) dependem da precisão da aposição fascicular19,20. A direcionalidade adequada dos cotos nervosos seccionados e seus fascículos é, portanto, crítica no reparo do nervo, sem a qual uma recuperação funcional deficiente pode ser esperada, mesmo com a regeneração axonal ideal. O reparo da sutura microcirúrgica em si é um processo traumático e pouco ocorreu em termos de novos métodos para melhorar drasticamente os resultados. O campo carece de modelos animais de transecção nervosa reprodutíveis, que resultam em lacunas previsíveis que permitem medições confiáveis de recuperação em nível funcional e tecidual. Tais métodos, se disponíveis, permitiriam a caracterização da regeneração nervosa sem os problemas de alterações variáveis na vascularização neural e atrofia pós-desnervação 21,22. Muitos grupos se esforçam para usar modelos melhores que limitam esse tipo de variabilidade. Uma maneira é garantir que os reparos nervosos sejam minimamente manipulados e os cotos nervosos sejam perfeitamente opostos.

Isso é melhor realizado usando uma técnica padronizada de transecção de nervos periféricos chamada corte gradual e cola de fibrina (STG). Os reparos neste modelo STG são fixados com cola de fibrina e as distâncias dos folgas são padronizadas e minimizadas21,22. A própria cola de fibrina é empregada em humanos para esses reparos, provavelmente pelos mesmos motivos, juntamente com seus efeitos benéficos na formação de cicatrizes pós-reparo23,24. A chave para o presente método é que o reparo do nervo comece antes que a laceração seja concluída, garantindo um padrão fixo de lesão. Este método atual exibiu uma semelhança próxima com a fisiopatologia característica da transecção nervosa com a sutura epineural padrão-ouro, e o impacto negativo da cola de fibrina não foi observado na regeneração nervosa. O reparo da transecção do nervo ciático com cola de fibrina em camundongos melhora o alongamento do axônio em comparação com a regeneração precoce do nervo por meio de sutura, e esses achados são consistentes com o STG. O STG também se beneficia do princípio da manipulação mínima, onde o nervo nunca é tocado para o posicionamento da sutura21. Isso padroniza efetivamente o trauma nervoso associado ao reparo no modelo. Princípios semelhantes foram usados para investigar o desalinhamento, invertendo o nervo antes da colagem22. Isso permitiu a comparação direta de lesões nervosas, onde quase a mesma quantidade de manipulação contribuiu para diferenças no alinhamento sem aumento de lacuna ou trauma. Isso facilitou o exame direto do efeito do alinhamento nas alterações neurovasculares induzidas por lesão nervosa21,22, atrofia muscular21,22 e recuperação funcional21,22. A presente investigação é tudo o que permite o estudo de cotos nervosos desalinhados propositalmente e com precisão.

A maioria dos nervos no TPNI não é cortada, não tem lacuna ou defeito e parece ser capaz de recuperação e, no entanto, em muitos desses casos, os membros permanecem permanentemente disfuncionais devido a lesões nervosas e intervenções confusas. Os TPNIs experimentais são habitualmente realizados em lesões por esmagamento do nervo ciático de roedores (SNCIs) usando chaves de agulha de bloqueio (NDs), fórceps ou dispositivos semelhantes e um cirurgião experiente para criar uma lesão por esmagamento precisa e reprodutível 25,26,27,28,29,30 . Os modelos animais SNCI dependem da precisão inata do operador para limitar a variação da pressão, mas isso nunca é medido explicitamente. Isso resulta em variabilidade entre animais e estudos, sem orientação clara sobre a pressão padronizada. Prevê-se, portanto, que a capacidade de fornecer e relatar com precisão uma série coerente e precisa de lesões com várias intensidades conhecidas pode beneficiar o campo TPNI. Um modelo perfeito pode fornecer um SNCI de uma gravidade conhecida da lesão nervosa de cada animal por qualquer laboratório ou pesquisador para uma autêntica replicabilidade entre estudos e dispositivos. Para resolver essa deficiência, um dispositivo digital calibrado exclusivo foi construído contendo um resistor sensível à força (FSR), proficiente em relatar a pressão (em tempo real) aplicada a um nervo. Este dispositivo foi então testado quanto à replicabilidade de várias pressões de lesão por esmagamento implantadas por diversos tipos de fórceps e NDs31.

Finalmente, um método específico foi desenvolvido para abordar lacunas no nervo32. As lacunas nervosas na literatura são induzidas pela remoção de uma seção nervosa e, em seguida, reparando-a de volta ao defeito 13,33,34. A manipulação necessária para esse procedimento cirúrgico é frequentemente combinada com sutura, e os cotos do nervo se retraem de forma variável 21,32,34. Baseou-se no raciocínio de que, usando enxertos de nervo superdimensionados isogênicos, a retração do coto nervoso nunca será um problema32. O método exigia a operação simultânea em dois ou três animais ao mesmo tempo, retomando um enxerto de 7 mm para colocar em um defeito de 5 mm induzido em outro animal. O tamanho do defeito do segundo animal foi então usado para enxertar um defeito ainda menor em outro animal, se necessário. Isso resultou em um método abrangente de cirurgia simultânea para enxertar defeitos com nervos doadores que são sempre maiores que o defeito nervoso para garantir o reparo sem tensão. Ao combinar com a exigência de manipulação mínima, isso oferece um caminho para estudar o comprimento do enxerto diretamente em animais singênicos sem lacunas assimétricas do enxerto que são onipresentes na literatura 20,32,34.

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Protocolo

O desenho experimental e os protocolos dos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Faculdade de Medicina da Universidade Estadual da Pensilvânia. Camundongos machos C57BL/6J adultos, com 10 semanas de idade, pesando 20-25 g, foram usados para os estudos. Os animais foram alojados no biotério em condições de manejo estéril e aclimatados pelo menos 5 dias antes da realização dos estudos.

1. Preparação animal

  1. Anestesiar profundamente os animais com um coquetel de cetamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) por injeção intraperitoneal com agulha 26 G.
  2. Raspe o membro traseiro direito e a região lombar dos animais usando um aparador e, em seguida, limpe com álcool preparado com solução de iodopovidona a 10% usando aplicadores estéreis com ponta de algodão (consulte a Tabela de Materiais).
  3. Aplique pomada lubrificante oftálmica nos olhos usando aplicadores estéreis com ponta de algodão para evitar o ressecamento dos olhos.
  4. Após a preparação, coloque os animais em uma almofada de aquecimento homeotérmica (consulte a Tabela de Materiais) para manter a temperatura corporal a 37 °C.
  5. Cole os membros posteriores dos camundongos na almofada de aquecimento e posicione-os cuidadosamente simetricamente para que a articulação do joelho faça um ângulo reto com o corpo.
  6. Esterilize todas as ferramentas cirúrgicas em autoclave e coloque-as na almofada estéril.
    NOTA: O cirurgião deve usar máscara, avental e luvas estéreis antes de realizar cirurgias.

2. Geração de modelo de lesão traumática do nervo periférico (TPNI)

  1. Após a preparação, faça uma incisão lateral na pele (~ 2 cm) ao longo do comprimento do fêmur usando uma tesoura e um microscópio binocular de zoom estéreo de precisão (consulte a Tabela de Materiais).
  2. Exponha bruscamente o nervo ciático (NS) através da banda iliotibial usando tesouras de dissecação e pinças microcirúrgicas. Evitar qualquer dano mecânico iatrogênico ao SN.
  3. Feche a pele com grampos cirúrgicos após cirurgias de TPNI (etapas 4-9). Administrar buprenorfina de libertação lenta (0,05 mg/kg) (ver Tabela de Materiais) por via subcutânea a todos os animais como analgésico.
  4. Realize a lesão por esmagamento do nervo ciático (SNCI) seguindo as etapas abaixo.
    1. Posicione o SN aproximadamente 3 mm proximal à trifurcação na forma plana entre as pontas da pinça (Figura 1A).
      NOTA: Deve-se tomar extremo cuidado para evitar posições deformadas, o que traz variações nos resultados experimentais entre animais/grupos.
    2. Execute o SNCI usando pinças calibradas e gabaritos de alumínio personalizados (Figura 1C)31,35 para resultar em uma pressão específica em uma largura fixa (3,5 mm).
      NOTA: Os detalhes do dispositivo sensor de pressão digital para SNCI usando pinças calibradas e gabaritos de mandrilamento personalizados são mencionados em nossos relatórios publicados anteriormente31,35. Gabaritos personalizados foram feitos fazendo furos em pequenos pedaços de alumínio. Confirma-se que esses gabaritos produzem pressões específicas usando um sensor de pressão digital, usando peças e especificações disponíveis publicamente e descritas anteriormente31,35.
    3. Após o posicionamento, empurre o gabarito suavemente para alcançar o bloco na pinça e, após 30 s, solte lentamente o gabarito e confirme a lesão pela estrutura alterada do nervo (Figura 1B).
      NOTA: As alterações estruturais do nervo confirmam o grau de gravidade da lesão. Isso pode ser verificado usando microscopia em casos de julgamento.
    4. Após o SNCI, enterre o nervo entre os músculos com cuidado para evitar lesão iatrogênica por um cirurgião.
      NOTA: As lesões por esmagamento causadas por pinças calibradas foram exatas, confiáveis e reprodutíveis, o que foi estabelecido usando o dispositivo sensor de pressão de aperto de precisão31 (Figura 1D). O curso de tempo da pressão de lesão por esmagamento em tempo real por diferentes gabaritos com fórceps é representado na Figura 2A, B.
  5. Realize a transecção e a cola (TG).
    1. Passe o SN completamente ~ 3 mm proximal à trifurcação do SN usando uma tesoura de dissecação.
    2. Após a transecção, repare a lacuna nervosa instantaneamente aplicando 10 μL de cola de fibrina (ver Tabela de Materiais) ao redor do local da transecção para limitar o deslocamento adicional das terminações nervosas cortadas. O tempo de coagulação da cola de fibrina foi de ~ 15 s.
      NOTA: O SN gap foi descontrolado e aleatório após a transecção devido à retração, o que pode ser uma variável para o resultado resultante.
  6. Execute a transecção e cola passo a passo (STG).
    1. Passe o SN incompletamente (80% de sua largura) ~ 3 mm proximal à trifurcação do SN usando uma tesoura de dissecação, evitando a formação de lacunas.
    2. Em seguida, aplique 10 μL de cola de fibrina ao redor do local do corte e corte completamente os 20% restantes do nervo antes da coagulação completa (~ 10 s) da cola.
      NOTA: Este método diminuiu efetivamente a formação de lacunas causadas pela retração elástica das extremidades nervosas cortadas, mas também foi livre de manipulação cirúrgica adicional ao nervo, ao contrário do modelo TG (Figura 3A).
  7. Execute Flip e Transection com Glue (FTG).
    1. Primeiro, transeccione o SN para 40% de sua largura de cada lado (Figura 3B).
    2. Vire transversalmente o coto distal e aplique 10 μL de cola de fibrina ao redor do local da transecção.
    3. Em seguida, faça uma secção completa do nervo central de 20% antes da coagulação completa (~ 10 s) da cola de fibrina.
    4. Confirmar a transecção completa ao microscópio directo.
  8. Realize a lacuna e o enxerto de nervo seguindo as etapas abaixo.
    1. Em um modelo graduado de lacuna nervosa e enxerto, use pares de camundongos em série para enxerto de nervo singênico em cascata32 em 1 conjunto de experimentos.
    2. Em um camundongo (digamos, camundongo # 1), crie uma lacuna nervosa de 7 mm (G-7 / 0) no SN direito, onde o nervo foi dissecado ~ 3 mm proximal à trifurcação SN e a 7 mm de distância dela usando uma escala graduada estéril ( Figura 3C ).
      NOTA: Uma lacuna nervosa irreparável foi criada pela dissecação de um nervo ciático de 7 mm sem enxerto. Este mouse é rotulado como G-7/0 porque um enxerto de 7 mm é retirado, mas nenhum reparo é realizado.
    3. Após a dissecção, transfira imediatamente o nervo seccionado para a condição estéril da placa de Petri contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS) e enterre o coto proximal do SN (camundongo # 1) sob o músculo com 10 μL de cola de fibrina.
    4. Em seguida, no camundongo # 2, crie uma lacuna nervosa de 5 mm no SN direito e enxerte a seção do nervo dissecado de 7 mm do camundongo # 1 usando cola de fibrina (10 μL, ~ 10 s) em ambas as extremidades (G-5/7) ( Figura 3C ).
      NOTA: Durante o enxerto, cuidados especiais devem ser tomados para evitar desalinhamentos e outras lesões iatrogênicas do NS pelo cirurgião.
  9. Realize transecção e suturas passo a passo (STS).
    1. Grave o nervo ciático em 80% de sua largura (Figura 3D) e repare os cotos com pontos epineurais de náilon 9-0.
    2. Após a conclusão, corte a porção restante do nervo e repare usando um único ponto de náilon 9-0.
    3. Inverta o nervo para expor a parte de trás da laceração e use dois pontos de náilon 9-0 para completar o reparo.

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Resultados

O dispositivo sensor de pressão digital feito sob medida (Figura 1D) opera detectando a mudança na resistência do FSR quando uma força é aplicada. Este dispositivo detecta e registra as quantidades de pressão mais modestas aplicadas a ele com um tempo de resposta de <5 μs, uma taxa de amostragem de 20 Hz e uma faixa de pressão de 2,5-25 lbs31. As diferenças na pressão do SNCI induzida pelo fórceps (Figura 1C) (Figu...

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Discussão

A história da pesquisa em TPNI se estende por várias décadas11,12. Os primeiros experimentos com cães e espécies maiores estabeleceram a importância dos modelos animais no estudo dos resultados do TPNI 36,37,38. Com o tempo, esses modelos mudaram para roedores menores, com suas medidas de resultados validadas estabelecidas e comumente us...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por doações do NIH (K08 AR060164-01A) e DOD (W81XWH-16-1-0725; W81XWH-19-1-0773), além do apoio institucional da Faculdade de Medicina da Universidade Estadual da Pensilvânia, Hershey, PA 17033, EUA.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Preparação de álcoolCOVIDIEN5110
BuprenorfinaZooPharmBSRLAB0.5-211706
C57BL/6JJackson Laboratories, Bar HarborN/A
Aplicadores com ponta de algodãoPuritan25-8062WC
Tesoura de dissecaçãoASSIASSI.
Cola de fibrina-TISSEELBaxter1501263
Resistor sensível à força (FSR)N / AFlexiForce A301
FórcepsFST-Dumont5SF Inox, 11252-00
GraphPad PrismGraphPad Software Inc.Versão 8.4.3.
Almofada de aquecimento homeotérmicaKent ScientificRJ1675
Cetamina/KetavedVEDCOVED1220
Pinça MicrocirúrgicaMiltex Instrumentos PremiumBL1901
Pomada lubrificante oftálmicaAkorn Saúde AnimalNDC 59399-162-35
Placa de PetriVWR25384-092
Solução salina tamponada com fosfatoGibco14190-144
IodopovidonaSolimoL0017765SA
Dispositivo sensor de pressão de aperto de precisãoTesoura N/A
estéreo Miltex Premium21-536
World Precision InstrumentsModelo PZMIII
Luvas estéreisCardinal Health9L19E511
Grampos cirúrgicos3M-PreciseDS-25
Fita cirúrgica3M-Microphore1530-0
SuturasEthiconBV130-5
SeringaBD309597
aparadorPhilips ElectronicsMG3750
xilazina / anasedAkorn Saúde Animal, Inc.
SDC18R8personalizada Microscópio binocular com zoom VAM4811

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