Estabelecimento de Parada Circulatória Hipotérmica Profunda em Ratos

A parada circulatória hipotérmica profunda (DHCA) tem sido utilizada em cirurgia cardíaca desde 1953¹_. A DHCA envolve a redução da temperatura central do paciente para níveis profundamente hipotérmicos (15-22 °C) antes de interromper globalmente o fluxo sanguíneo para o corpo². A parada circulatória pode fornecer um campo operacional relativamente sem sangue. A hipotermia profunda diminui o metabolismo, principalmente no cérebro e no miocárdio, que é um método eficaz de proteção contra isquemia³. O DHCA é comumente aplicado durante cirurgias para cardiopatia congênita complexa, doença do arco aórtico e até mesmo tumores renais ou adrenais com trombo de veia cava ^4,5. Portanto, o estabelecimento de modelos animais DHCA fornece uma referência importante para o refinamento do procedimento e a prevenção de complicações em ambientes clínicos.

Embora modelos possam ser estabelecidos com caninos⁶, coelhos⁷ e outros animais, é preferível o uso de ratos devido à sua operacionalidade e baixo custo. O modelo DHCA em ratos foi descrito pela primeira vez em 2006 por Jungwirth et ^al.8. Verificou-se que a duração da parada circulatória teve impacto nos desfechos neurológicos. Desde então, os modelos de ratos DHCA têm sido investigados amplamente. Esclareceu-se que o DHCA poderia provocar a síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SRIS)⁹. Em estudos subsequentes, farmacologistas descobriram que a neuroinflamação relacionada ao DHCA induzida pela SIRS poderia ser atenuada pelo resveratrol¹⁰ e triptolide¹¹. Nossa equipe também descobriu que a neuroinflamação relacionada ao DHCA poderia ser atenuada inibindo a proteína de ligação ao RNA induzível a frio¹². No sistema cardiovascular, a superóxido dismutase tem efeito cardioprotetor nas lesões de isquemia/reperfusão (I/R) durante a DHCA¹³. Esses resultados expandiram a compreensão dos processos fisiopatológicos relacionados ao DHCA e ofereceram novas direções para melhorar os resultados do DHCA. No entanto, os resultados em relação à endotoxemia, estresse oxidativo e autofagia após DHCA são inconclusivos. A DHCA utiliza a mesma tecnologia operacional da circulação extracorpórea (CEC)¹⁴, mas sua estratégia de manejo é diferente, e as etapas para gerar a DHCA diferem entre as várias equipes 8,9,10,11. O presente estudo tem como objetivo fornecer um método para estabelecer o procedimento DHCA em ratos.

Os protocolos passaram por uma revisão institucional e receberam aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais, Hospital Fuwai, Academia Chinesa de Ciências Médicas (FW-2021-0005). Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicado pelos Institutos Nacionais de Saúde.

NOTA: Ratos Sprague-Dawley machos (peso: 500-600 g, idade: 12-14 semanas) foram mantidos em condições laboratoriais padrão com livre acesso a alimentos e água. Os ratos foram alocados aleatoriamente em dois grupos (n = 6, cada grupo): o grupo DHCA e o grupo CEC em temperatura normal (grupo NtCPB).

1. Trabalhos preparatórios

1. Esterilizar os instrumentos cirúrgicos (fórceps, tesoura, micropinça, eletrocoagulador, barbeador, etc.) antes do experimento (Figura 1).
2. Garantir a disponibilidade dos consumíveis, que incluem seda 2-0, uma cânula 16 G (cateter endotraqueal), uma cânula 22 G, uma cânula caseira 16-G (cateter intravenoso multi-orifício), seringas de injeção, gaze e fita adesiva.
   NOTA: Para a cânula caseira 16 G, use um bisturi para cortar dois ou três orifícios de 2 mm de diâmetro na ponta da cânula, o que ajudará a tornar a drenagem venosa mais suave.
3. Garantir a disponibilidade de sevoflurano, lidocaína a 2%, solução salina, heparina (5 UI/mL, 250 UI/mL), epinefrina (40 μg/mL), norepinefrina (20 μg/mL), hidroxietil amido e bicarbonato.
4. Certifique-se de que os circuitos DHCA contenham um reservatório (modificado a partir do conta-gotas de Murphy), uma bomba de rolos, um trocador de calor, um oxigenador de membrana, tubos de conexão e um tanque de água (Figura 2). Conecte o circuito e misture 12 mL de hidroxietilamido com 1 mL de heparina sódica (250 UI) e 1 mL de solução salina. Pressione o circuito com 14 mL da solução de escorva com a bomba de roletes girando suavemente (10-40 mL/min).
   NOTA: O reservatório é remoldado a partir de um dispositivo de transfusão de sangue com conta-gotas de Murphy. A parte de entrada venosa do conta-gotas permanece a 10-15 cm e a parte de saída venosa permanece a 10 cm.

2. Anestesia e canulação

1. Anestesiar os ratos com sevoflurano a 2% a 3% e, em seguida, testar a falta do reflexo conjuntival e relaxamento muscular após o rato perder a consciência.
   NOTA: O reflexo conjuntival refere-se ao fechamento instantâneo da pálpebra sempre que a córnea é tocada. Use um cotonete para tocar ligeiramente a córnea. Quando a profundidade da anestesia é suficiente, as pálpebras não se fecham.
2. Realizar a intubação endotraqueal com cânula de 16 G após o desaparecimento do reflexo conjuntival e não se observar resistência muscular. Conecte o tubo a um ventilador e defina os parâmetros clicando nos botões do ventilador (volume corrente: 1,0-1,2 mL/100g, frequência cardíaca: 80 batimentos por minuto [bpm], I:E = 1:1, fração inspirada de oxigênio: 60%).
3. Coloque um cobertor de aquecimento elétrico sob o rato e fixe o rato com fita adesiva. Aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar a secura. Raspe o cabelo na região inguinal esquerda, região cervical direita e cauda com um barbeador. Em seguida, desinfete a pele três vezes com iodo e álcool.
4. Verifique a profundidade da anestesia antes de passar para os próximos passos. Se a frequência respiratória for maior do que a definida pelo ventilador (80 bpm), ou se houver rigidez muscular, aumente a concentração de saída de sevoflurano.
   NOTA: Quando a profundidade da anestesia é adequada, o ritmo respiratório deve ser sincronizado com o ventilador, e os músculos devem estar completamente relaxados sem tensão. Verifique a profundidade da anestesia a cada 30 minutos para garantir que o rato não esteja experimentando nenhum retorno de consciência durante todo o procedimento.
5. Use um bisturi para cortar a pele na região inguinal esquerda (aproximadamente 1 cm) e dissecar o músculo e o tecido suavemente para expor a veia e artéria femoral esquerda. Separe a artéria com cuidado.
6. Cânule um cateter intravenoso 22 G na artéria femoral esquerda. Ligue a artéria e o cateter com uma seda 2-0 (na região da canulação). Use heparina contendo solução salina (5 UI/mL) para lavar a cânula para evitar a coagulação. Conecte o cateter com o sensor de pressão para monitorar a pressão arterial.
7. Corte a pele da cauda (aproximadamente 1,5 cm) e, em seguida, use um bisturi para cortar a fáscia superficial da artéria da cauda para expor a artéria da cauda, que está no meio do campo cirúrgico.
8. Cânule a artéria caudal com um cateter intravenoso 22 G. Ligue a artéria e o cateter com uma seda 2-0 (na região da canulação). Use heparina contendo solução salina (5 UI/mL) para lavar o cateter para evitar a coagulação.
   NOTA: Ao canular o cateter intravenoso, a mão esquerda segura a artéria/veia com pinça, e a mão direita perfura a artéria/veia com a agulha dentro do cateter e, em seguida, coloca a cânula na artéria.
9. Corte a pele na veia jugular direita (aproximadamente 2 cm) e, em seguida, separe o músculo e o tecido para expor a veia. Insira um cateter intravenoso multi-orifício caseiro de 16 G na veia jugular externa direita e coloque-o na veia cava inferior direita ou no átrio direito com cuidado.
   NOTA: A veia e artéria femoral esquerda estão sob a superfície da região inguinal esquerda. A veia é mais espessa que a artéria, e a cor do sangue das artérias é vermelha brilhante. A veia jugular direita está no meio da região cervical direita; quando a pele é cortada e os músculos são separados, a veia pode ser vista (aproximadamente 0,3-0,4 cm de largura). Quando a ponta do cateter toca o átrio direito, a onda de pressão arterial flutuará. Então, depois de puxar o cateter para trás um pouco, a ponta do cateter estará na veia cava superior.
10. Administrar heparina sódica (500 UI/kg) através da veia externa direita. Cubra cada região canulada com gaze úmida para evitar a contaminação.
    NOTA: Coloque uma caixa sob a mesa de operação para elevá-la cerca de 40 cm.

3. Início do DHCA

1. Conecte o circuito DHCA com o cateter na artéria caudal primeiro e mantenha a taxa de fluxo da bomba em 1-2 mL/min. Em seguida, conecte o reservatório com o cateter na veia jugular externa direita. Certifique-se de que há sempre um nível sanguíneo de cerca de 1 cm no reservatório.
2. Ligue o tanque de água e defina a temperatura da água em 37 °C primeiro.
3. Depois que a pressão arterial estiver estável, aumente suavemente o fluxo da bomba até 80-100 mL / kg / min para bombear o sangue.

4. Arrefecimento

1. Ajuste a temperatura ambiente para cerca de 20 °C. Coloque cubos de gelo em luvas descartáveis e, em seguida, coloque-os na cabeça e nos lados do rato. Ajuste a temperatura do tanque em tempo real de acordo com a temperatura retal dos ratos.
2. Colete 0,1 mL de sangue da artéria femoral esquerda e coloque-o na máquina de gases sanguíneos para análise de gases sanguíneos. Altere adequadamente os parâmetros relevantes do ventilador de acordo com os resultados da gasometria (por exemplo, PaCO₂).
   NOTA: A frequência cardíaca e a pressão arterial podem mudar, e a taxa de fluxo da bomba deve ser ajustada de acordo. O gradiente de temperatura entre o tanque de água e o rato precisa ser inferior a 10 °C. Certifique-se de que a temperatura pode ser reduzida para 15-20 °C dentro de 30 min. A faixa normal de PaCO₂ é de 35-45 mmHg. Se os resultados da gasometria sanguínea mostrarem uma menor PaCO₂, pode-se diminuir o volume corrente e vice-versa.

5. Parada circulatória hipotérmica profunda

1. Quando a temperatura retal cair para 15-20 °C, troque as luvas descartáveis (contendo gelo) para garantir a manutenção da hipotermia profunda durante a parada circulatória.
2. Pare a bomba de roletes, mantenha o reservatório em contato com o ambiente e drene o sangue lentamente da veia jugular externa para o reservatório.
3. Preste atenção à forma de onda da pressão arterial. Quando a pressão arterial e a frequência cardíaca forem 0, pare a drenagem e mantenha o reservatório fechado. Desligue o ventilador.
   NOTA: A duração da parada circulatória varia de acordo com o objetivo do experimento.

6. Aquecimento e reperfusão

1. Retire todas as luvas descartáveis e aumente a temperatura ambiente para 25 °C. Restaure a ventilação do oxigenador de membrana, mantendo o corte do tubo de drenagem venosa. Ligue a bomba de rolos para se certificar de que o sangue no reservatório volta lentamente para o corpo do rato.
2. Ligue o ventilador. Uma vez que o nível sanguíneo no reservatório permaneça em 1 cm, solte o tubo de drenagem e drene o sangue do átrio direito para o reservatório lentamente.
3. Ligue a lâmpada de aquecimento, a almofada de aquecimento e o tanque de água. Ajuste a temperatura do tanque de água para 25 °C em primeiro lugar e, em seguida, ajuste sua temperatura de saída em tempo hábil de acordo com a temperatura retal do rato.
   NOTA: A lâmpada de aquecimento deve ser direcionada para os grandes vasos sanguíneos na cavidade torácica do rato, e deve ser mantida a uma certa distância para evitar a queima dos tecidos. Preste atenção à diferença de temperatura entre a temperatura de saída e a temperatura retal do rato (<10 °C). Se necessário, teste a gasometria e, em seguida, ajuste os parâmetros do ventilador de acordo e administre bicarbonato, eletrólitos, etc.
4. Remova a lâmpada de aquecimento depois de a temperatura retal regressar a 34 °C.
   NOTA: Esta etapa, como uma continuação do rápido processo de reaquecimento, deve ser lenta. Nesta fase, os parâmetros do equipamento do vaporizador de sevoflurano, ventilador mecânico e bomba de rolos podem ser restaurados aos níveis no início da CEC.

7. Desmame da CEC

1. Reduza lenta e gradualmente a taxa de fluxo da bomba de roletes e ajuste a velocidade de drenagem venosa até que a taxa de fluxo reduza para 1 mL/min.
   NOTA: Cada ajuste da taxa de fluxo deve ser observado por 3-5 min.
2. Mantenha o reservatório em contato com o meio ambiente (retirando a tampa do reservatório). Infundir o sangue restante no circuito com uma taxa de fluxo de 1 mL/min.
3. Pare a oxigenação por membrana e a bomba de roletes.
4. Eutanasiar o rato após um período de ventilação mecânica sob anestesia profunda.
   NOTA: Este é um procedimento terminal. A duração entre o desmame da CEC e a eutanásia varia de acordo com os diferentes protocolos do estudo. Lembre-se de desinfetar as feridas com iodo e álcool e, em seguida, cobrir cada região canulada com gaze úmida para evitar a contaminação antes da eutanásia. Aumente a concentração de saída de sevoflurano para aumentar a profundidade da anestesia.

Como grupo controle, os ratos CEC de temperatura normal (NtCPB) sem parada circulatória apresentaram pressão arterial (PAM) média estável e temperatura corporal durante todo o procedimento, enquanto a PAM dos ratos DHCA diminuiu durante a parada cardíaca (p < 0,01, Figura 3A). A temperatura dos ratos DHCA caiu rapidamente durante a fase de resfriamento e se recuperou gradualmente durante a fase de reaquecimento. Ao desmamar os ratos dos circuitos DHCA, a temperatura dos ratos DHCA voltou ao normal (Figura 3B).

O efeito do processo DHCA em ratos foi investigado por meio de gasometria. Após o contato do sangue total com a solução de priming, a concentração de hemoglobina (Hb) foi superior a 6 g/dL em ambos os grupos (Figura 4A). Ao desmamar os ratos do circuito DHCA, a concentração aumentou para 9 g/dL devido à infusão do sangue restante no circuito de CEC no rato. O hematócrito (HCT) apresentou tendência semelhante à Hb (Figura 4B). No início do procedimento de CEC, as diferenças na Hb e na HCT podem ter sido devidas aos diferentes pesos dos ratos. O peso médio dos ratos DHCA foi de 571,1 g ± 7,254 g, enquanto o peso médio dos ratos no grupo NtCPB foi de 535,0 g ± 8,317g (p = 0,075). Embora as diferenças na concentração de Hb levassem a diferenças na capacidade do sangue de transportar oxigênio, as tendências de mudança dos dois grupos foram as mesmas, indicando que o DHCA não influenciou adicionalmente a concentração de Hb. Após DHCA e reperfusão, o nível de ácido lático aumentou rapidamente, sendo mais pronunciado no grupo DHCA (Figura 4C). O pH diminuiu após o procedimento de DHCA, que provavelmente foi o resultado do acúmulo de ácido lático (Figura 4D). Durante todo o experimento, as concentrações de Na+, Cl−, K+ e glicose não apresentaram diferenças significativas em nenhum momento (Figura 5). Esses resultados sugerem que o DHCA causou apenas aumento do ácido lático, mas não influenciou o pH sanguíneo e a concentração de hemoglobina, hematócrito, Na+, Cl−, K+ e glicose.

A autofagia é um processo no qual as células eucarióticas utilizam lisossomos para degradar suas proteínas citoplasmáticas e organelas danificadas15. Em condições fisiológicas e algumas condições patológicas, um nível leve de autofagia é essencial para a manutenção da homeostase celular. No entanto, a autofagia excessiva pode levar ao estresse metabólico, à degradação dos componentes celulares e até à morte celular16. Para avaliar o impacto do DHCA na autofagia neural, utilizamos microscopia eletrônica de transmissão e, surpreendentemente, encontramos um aumento do número de autofagossomos nos hipocampos dos ratos DHCA (Figura 6). Com base nas funções bidirecionais dos autofagossomos, se os autofagossomos aumentados desempenham um papel neuroprotetor e compensatório ou patológico durante a DHCA ainda precisa de mais pesquisas.

Figura 1: Instrumentos cirúrgicos utilizados no modelo DHCA. (a) Iodo, (b) seringas de injeção, (c) fita adesiva, (d) gaze úmida, (e) pinça, (f) tesoura, (g,h) micropinças, (i) um eletrocoagulador, (j) um barbeador e (k) seda. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Circuito de circulação extracorpórea do modelo DHCA de ratos. (A) a: Oxigenador de membrana; b: Trocador de calor; c: Reservatório; d1: O tubo que liga a bomba de rolos (diâmetro externo [OD], 6 mm; diâmetro interno [ID], 4 mm; comprimento, 15 cm); d2: O tubo que liga o permutador de calor e o oxigenador de membrana (OD, 6 mm; ID 4 mm; comprimento, 8 cm); d3: A linha de saída da artéria (OD, 2,5 mm; ID, 1,5 mm; comprimento, 20 cm). (B) a: Reservatório; b: Oxigenador de membrana; c: Trocador de calor; d: Bomba de roletes. A seta amarela mostra a direção do fluxo sanguíneo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Sinais vitais dos ratos DHCA e ratos CEC de temperatura normal. (A) A pressão arterial média e (B) a temperatura retal foram monitoradas continuamente durante todo o procedimento. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (EPM), n = 6 por grupo. DHCA = 30 min. As diferenças entre os dois grupos em cada ponto de tempo foram comparadas por meio do teste t de Student não pareado. Abreviaturas: DHCA = parada circulatória hipotérmica profunda; NtCPB = circulação extracorpórea em temperatura normal; PAM = pressão arterial média. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; p > 0,05 não mostrado. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: O pH e as concentrações de hemoglobina, hematócrito e ácido láctico em ratos. Amostras de sangue da artéria para análise de (A) hemoglobina, (B) hematócrito, (C) ácido lático, (D) e pH foram coletadas através da artéria femoral em três momentos: início da CEC, antes da DHCA, e desmame da CEC. DHCA = 30 min. Os dados são apresentados como média ± EPM, n = 6 por grupo. A diferença entre os dois grupos em cada ponto de tempo foi comparada por meio do teste t de Student não pareado. Abreviaturas: DHCA = parada circulatória hipotérmica profunda; NtCPB = circulação extracorpórea em temperatura normal; Hb = hemoglobina; Hct = hematócrito; Lac = ácido láctico. * p < 0,05. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: A concentração de Na+, Cl−, K+ e glicose em ratos. Amostras de sangue de artéria para análise de glicose (A) Na+, (B) Cl−, (C) K+ e (D) foram coletadas através da artéria femoral em três momentos: início da CEC, antes da DHCA, e desmame da CEC. DHCA = 30 min. Os dados são apresentados como média ± EPM, n = 6 por grupo. As diferenças entre os dois grupos em cada ponto de tempo foram comparadas por meio do teste t de Student não pareado. Abreviaturas: DHCA = parada circulatória hipotérmica profunda; NtCPB = circulação extracorpórea em temperatura normal; Glu = glicose. p > 0,05 não mostrado. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Autofagossomos no hipocampo de ratos. Os ratos foram sacrificados 30 min após o desmame do circuito de CEC, e os hipocampos foram colhidos imediatamente. Em seguida, os hipocampos foram fixados em glutaraldeído para posterior microscopia eletrônica de transmissão para investigar a expressão de autofagossomos nos hipocampos de ratos (A) NtCPB e (B) DHCA. DHCA = 30 min. Barras de escala: 1 μm e 250 nm. As setas apontam para autofagossomos. Abreviaturas: DHCA = parada circulatória hipotérmica profunda; NtCPB = circulação extracorpórea de temperatura normal. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a revelar.