Estabelecimento de Parada Circulatória Hipotérmica Profunda em Ratos

Resumo

Este protocolo apresenta o estabelecimento de parada circulatória hipotérmica profunda em ratos, que pode ser aplicada para investigar a síndrome da resposta inflamatória sistêmica, lesão de isquemia/reperfusão, estresse oxidativo, neuroinflamação, etc.

Resumo

A parada circulatória hipotérmica profunda (DHCA) é rotineiramente aplicada durante cirurgias para cardiopatia congênita complexa e doença do arco aórtico. O presente estudo tem como objetivo fornecer um método para o estabelecimento de DHCA em ratos. Para avaliar o impacto do processo DHCA sobre os sinais vitais, foi utilizado como controle um modelo de revascularização miopulmonar (CEC) de temperatura normal sem parada circulatória. Como esperado, o DHCA levou a uma diminuição significativa da temperatura corporal e da pressão arterial média. A gasometria indicou que o DHCA aumentou os níveis de ácido láctico, mas não influenciou o pH sanguíneo e as concentrações de hemoglobina, hematócrito, Na⁺, Cl⁻, K⁺ e glicose. Além disso, em comparação com os ratos CEC de temperatura normal, os resultados da microscopia eletrônica de transmissão mostraram um leve aumento nos autofagossomos hipocampais nos ratos DHCA.

Introdução

A parada circulatória hipotérmica profunda (DHCA) tem sido utilizada em cirurgia cardíaca desde 1953¹_. A DHCA envolve a redução da temperatura central do paciente para níveis profundamente hipotérmicos (15-22 °C) antes de interromper globalmente o fluxo sanguíneo para o corpo². A parada circulatória pode fornecer um campo operacional relativamente sem sangue. A hipotermia profunda diminui o metabolismo, principalmente no cérebro e no miocárdio, que é um método eficaz de proteção contra isquemia³. O DHCA é comumente aplicado durante cirurgias para cardiopatia congênita complexa, doença do arco aórtico e até mesmo tumores renais ou adrenais com trombo de veia cava ^4,5. Portanto, o estabelecimento de modelos animais DHCA fornece uma referência importante para o refinamento do procedimento e a prevenção de complicações em ambientes clínicos.

Embora modelos possam ser estabelecidos com caninos⁶, coelhos⁷ e outros animais, é preferível o uso de ratos devido à sua operacionalidade e baixo custo. O modelo DHCA em ratos foi descrito pela primeira vez em 2006 por Jungwirth et ^al.8. Verificou-se que a duração da parada circulatória teve impacto nos desfechos neurológicos. Desde então, os modelos de ratos DHCA têm sido investigados amplamente. Esclareceu-se que o DHCA poderia provocar a síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SRIS)⁹. Em estudos subsequentes, farmacologistas descobriram que a neuroinflamação relacionada ao DHCA induzida pela SIRS poderia ser atenuada pelo resveratrol¹⁰ e triptolide¹¹. Nossa equipe também descobriu que a neuroinflamação relacionada ao DHCA poderia ser atenuada inibindo a proteína de ligação ao RNA induzível a frio¹². No sistema cardiovascular, a superóxido dismutase tem efeito cardioprotetor nas lesões de isquemia/reperfusão (I/R) durante a DHCA¹³. Esses resultados expandiram a compreensão dos processos fisiopatológicos relacionados ao DHCA e ofereceram novas direções para melhorar os resultados do DHCA. No entanto, os resultados em relação à endotoxemia, estresse oxidativo e autofagia após DHCA são inconclusivos. A DHCA utiliza a mesma tecnologia operacional da circulação extracorpórea (CEC)¹⁴, mas sua estratégia de manejo é diferente, e as etapas para gerar a DHCA diferem entre as várias equipes 8,9,10,11. O presente estudo tem como objetivo fornecer um método para estabelecer o procedimento DHCA em ratos.

Protocolo

Os protocolos passaram por uma revisão institucional e receberam aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais, Hospital Fuwai, Academia Chinesa de Ciências Médicas (FW-2021-0005). Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicado pelos Institutos Nacionais de Saúde.

NOTA: Ratos Sprague-Dawley machos (peso: 500-600 g, idade: 12-14 semanas) foram mantidos em condições laboratoriais padrão com livre acesso a alimentos e água. Os ratos foram alocados aleatoriamente em dois grupos (n = 6, cada grupo): o grupo DHCA e o grupo CEC em temperatura normal (grupo NtCPB).

1. Trabalhos preparatórios

1. Esterilizar os instrumentos cirúrgicos (fórceps, tesoura, micropinça, eletrocoagulador, barbeador, etc.) antes do experimento (Figura 1).
2. Garantir a disponibilidade dos consumíveis, que incluem seda 2-0, uma cânula 16 G (cateter endotraqueal), uma cânula 22 G, uma cânula caseira 16-G (cateter intravenoso multi-orifício), seringas de injeção, gaze e fita adesiva.
   NOTA: Para a cânula caseira 16 G, use um bisturi para cortar dois ou três orifícios de 2 mm de diâmetro na ponta da cânula, o que ajudará a tornar a drenagem venosa mais suave.
3. Garantir a disponibilidade de sevoflurano, lidocaína a 2%, solução salina, heparina (5 UI/mL, 250 UI/mL), epinefrina (40 μg/mL), norepinefrina (20 μg/mL), hidroxietil amido e bicarbonato.
4. Certifique-se de que os circuitos DHCA contenham um reservatório (modificado a partir do conta-gotas de Murphy), uma bomba de rolos, um trocador de calor, um oxigenador de membrana, tubos de conexão e um tanque de água (Figura 2). Conecte o circuito e misture 12 mL de hidroxietilamido com 1 mL de heparina sódica (250 UI) e 1 mL de solução salina. Pressione o circuito com 14 mL da solução de escorva com a bomba de roletes girando suavemente (10-40 mL/min).
   NOTA: O reservatório é remoldado a partir de um dispositivo de transfusão de sangue com conta-gotas de Murphy. A parte de entrada venosa do conta-gotas permanece a 10-15 cm e a parte de saída venosa permanece a 10 cm.

2. Anestesia e canulação

1. Anestesiar os ratos com sevoflurano a 2% a 3% e, em seguida, testar a falta do reflexo conjuntival e relaxamento muscular após o rato perder a consciência.
   NOTA: O reflexo conjuntival refere-se ao fechamento instantâneo da pálpebra sempre que a córnea é tocada. Use um cotonete para tocar ligeiramente a córnea. Quando a profundidade da anestesia é suficiente, as pálpebras não se fecham.
2. Realizar a intubação endotraqueal com cânula de 16 G após o desaparecimento do reflexo conjuntival e não se observar resistência muscular. Conecte o tubo a um ventilador e defina os parâmetros clicando nos botões do ventilador (volume corrente: 1,0-1,2 mL/100g, frequência cardíaca: 80 batimentos por minuto [bpm], I:E = 1:1, fração inspirada de oxigênio: 60%).
3. Coloque um cobertor de aquecimento elétrico sob o rato e fixe o rato com fita adesiva. Aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar a secura. Raspe o cabelo na região inguinal esquerda, região cervical direita e cauda com um barbeador. Em seguida, desinfete a pele três vezes com iodo e álcool.
4. Verifique a profundidade da anestesia antes de passar para os próximos passos. Se a frequência respiratória for maior do que a definida pelo ventilador (80 bpm), ou se houver rigidez muscular, aumente a concentração de saída de sevoflurano.
   NOTA: Quando a profundidade da anestesia é adequada, o ritmo respiratório deve ser sincronizado com o ventilador, e os músculos devem estar completamente relaxados sem tensão. Verifique a profundidade da anestesia a cada 30 minutos para garantir que o rato não esteja experimentando nenhum retorno de consciência durante todo o procedimento.
5. Use um bisturi para cortar a pele na região inguinal esquerda (aproximadamente 1 cm) e dissecar o músculo e o tecido suavemente para expor a veia e artéria femoral esquerda. Separe a artéria com cuidado.
6. Cânule um cateter intravenoso 22 G na artéria femoral esquerda. Ligue a artéria e o cateter com uma seda 2-0 (na região da canulação). Use heparina contendo solução salina (5 UI/mL) para lavar a cânula para evitar a coagulação. Conecte o cateter com o sensor de pressão para monitorar a pressão arterial.
7. Corte a pele da cauda (aproximadamente 1,5 cm) e, em seguida, use um bisturi para cortar a fáscia superficial da artéria da cauda para expor a artéria da cauda, que está no meio do campo cirúrgico.
8. Cânule a artéria caudal com um cateter intravenoso 22 G. Ligue a artéria e o cateter com uma seda 2-0 (na região da canulação). Use heparina contendo solução salina (5 UI/mL) para lavar o cateter para evitar a coagulação.
   NOTA: Ao canular o cateter intravenoso, a mão esquerda segura a artéria/veia com pinça, e a mão direita perfura a artéria/veia com a agulha dentro do cateter e, em seguida, coloca a cânula na artéria.
9. Corte a pele na veia jugular direita (aproximadamente 2 cm) e, em seguida, separe o músculo e o tecido para expor a veia. Insira um cateter intravenoso multi-orifício caseiro de 16 G na veia jugular externa direita e coloque-o na veia cava inferior direita ou no átrio direito com cuidado.
   NOTA: A veia e artéria femoral esquerda estão sob a superfície da região inguinal esquerda. A veia é mais espessa que a artéria, e a cor do sangue das artérias é vermelha brilhante. A veia jugular direita está no meio da região cervical direita; quando a pele é cortada e os músculos são separados, a veia pode ser vista (aproximadamente 0,3-0,4 cm de largura). Quando a ponta do cateter toca o átrio direito, a onda de pressão arterial flutuará. Então, depois de puxar o cateter para trás um pouco, a ponta do cateter estará na veia cava superior.
10. Administrar heparina sódica (500 UI/kg) através da veia externa direita. Cubra cada região canulada com gaze úmida para evitar a contaminação.
    NOTA: Coloque uma caixa sob a mesa de operação para elevá-la cerca de 40 cm.

3. Início do DHCA

1. Conecte o circuito DHCA com o cateter na artéria caudal primeiro e mantenha a taxa de fluxo da bomba em 1-2 mL/min. Em seguida, conecte o reservatório com o cateter na veia jugular externa direita. Certifique-se de que há sempre um nível sanguíneo de cerca de 1 cm no reservatório.
2. Ligue o tanque de água e defina a temperatura da água em 37 °C primeiro.
3. Depois que a pressão arterial estiver estável, aumente suavemente o fluxo da bomba até 80-100 mL / kg / min para bombear o sangue.

4. Arrefecimento

1. Ajuste a temperatura ambiente para cerca de 20 °C. Coloque cubos de gelo em luvas descartáveis e, em seguida, coloque-os na cabeça e nos lados do rato. Ajuste a temperatura do tanque em tempo real de acordo com a temperatura retal dos ratos.
2. Colete 0,1 mL de sangue da artéria femoral esquerda e coloque-o na máquina de gases sanguíneos para análise de gases sanguíneos. Altere adequadamente os parâmetros relevantes do ventilador de acordo com os resultados da gasometria (por exemplo, PaCO₂).
   NOTA: A frequência cardíaca e a pressão arterial podem mudar, e a taxa de fluxo da bomba deve ser ajustada de acordo. O gradiente de temperatura entre o tanque de água e o rato precisa ser inferior a 10 °C. Certifique-se de que a temperatura pode ser reduzida para 15-20 °C dentro de 30 min. A faixa normal de PaCO₂ é de 35-45 mmHg. Se os resultados da gasometria sanguínea mostrarem uma menor PaCO₂, pode-se diminuir o volume corrente e vice-versa.

5. Parada circulatória hipotérmica profunda

1. Quando a temperatura retal cair para 15-20 °C, troque as luvas descartáveis (contendo gelo) para garantir a manutenção da hipotermia profunda durante a parada circulatória.
2. Pare a bomba de roletes, mantenha o reservatório em contato com o ambiente e drene o sangue lentamente da veia jugular externa para o reservatório.
3. Preste atenção à forma de onda da pressão arterial. Quando a pressão arterial e a frequência cardíaca forem 0, pare a drenagem e mantenha o reservatório fechado. Desligue o ventilador.
   NOTA: A duração da parada circulatória varia de acordo com o objetivo do experimento.

6. Aquecimento e reperfusão

1. Retire todas as luvas descartáveis e aumente a temperatura ambiente para 25 °C. Restaure a ventilação do oxigenador de membrana, mantendo o corte do tubo de drenagem venosa. Ligue a bomba de rolos para se certificar de que o sangue no reservatório volta lentamente para o corpo do rato.
2. Ligue o ventilador. Uma vez que o nível sanguíneo no reservatório permaneça em 1 cm, solte o tubo de drenagem e drene o sangue do átrio direito para o reservatório lentamente.
3. Ligue a lâmpada de aquecimento, a almofada de aquecimento e o tanque de água. Ajuste a temperatura do tanque de água para 25 °C em primeiro lugar e, em seguida, ajuste sua temperatura de saída em tempo hábil de acordo com a temperatura retal do rato.
   NOTA: A lâmpada de aquecimento deve ser direcionada para os grandes vasos sanguíneos na cavidade torácica do rato, e deve ser mantida a uma certa distância para evitar a queima dos tecidos. Preste atenção à diferença de temperatura entre a temperatura de saída e a temperatura retal do rato (<10 °C). Se necessário, teste a gasometria e, em seguida, ajuste os parâmetros do ventilador de acordo e administre bicarbonato, eletrólitos, etc.
4. Remova a lâmpada de aquecimento depois de a temperatura retal regressar a 34 °C.
   NOTA: Esta etapa, como uma continuação do rápido processo de reaquecimento, deve ser lenta. Nesta fase, os parâmetros do equipamento do vaporizador de sevoflurano, ventilador mecânico e bomba de rolos podem ser restaurados aos níveis no início da CEC.

7. Desmame da CEC

1. Reduza lenta e gradualmente a taxa de fluxo da bomba de roletes e ajuste a velocidade de drenagem venosa até que a taxa de fluxo reduza para 1 mL/min.
   NOTA: Cada ajuste da taxa de fluxo deve ser observado por 3-5 min.
2. Mantenha o reservatório em contato com o meio ambiente (retirando a tampa do reservatório). Infundir o sangue restante no circuito com uma taxa de fluxo de 1 mL/min.
3. Pare a oxigenação por membrana e a bomba de roletes.
4. Eutanasiar o rato após um período de ventilação mecânica sob anestesia profunda.
   NOTA: Este é um procedimento terminal. A duração entre o desmame da CEC e a eutanásia varia de acordo com os diferentes protocolos do estudo. Lembre-se de desinfetar as feridas com iodo e álcool e, em seguida, cobrir cada região canulada com gaze úmida para evitar a contaminação antes da eutanásia. Aumente a concentração de saída de sevoflurano para aumentar a profundidade da anestesia.

Resultados

Como grupo controle, os ratos CEC de temperatura normal (NtCPB) sem parada circulatória apresentaram pressão arterial (PAM) média estável e temperatura corporal durante todo o procedimento, enquanto a PAM dos ratos DHCA diminuiu durante a parada cardíaca (p < 0,01, Figura 3A). A temperatura dos ratos DHCA caiu rapidamente durante a fase de resfriamento e se recuperou gradualmente durante a fase de reaquecimento. Ao desmamar os ratos dos circuitos DHCA, a temperatura dos ratos DHC...

Discussão

A canulação é o procedimento mais fundamental para o estabelecimento de DHCA em ratos. Antes da canulação, a imersão da artéria com 0,5 mL de lidocaína a 2% facilitará a canulação. Após a canulação, a heparinização com 500 UI/kg de heparina via veia jugular externa é necessária para evitar a formação de microtrombos¹⁷. Descobrimos repetidamente que esta dose de heparina pode atingir o objetivo de um tempo de coagulação ativado (TCA) >480 s. O período de reaquecimento é a parte mais difíci...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Trocador de calor	Xi' um aparelho médico Co. de Xijing, instrumento	de Dongguan
	, Ltd.	Micro-M
Monitor	Chengdu Techman Co., Ltd	BL-420s
Bomba de Rolo	Changzhou Prefluid Technology Co., Ltd	BL100
SD Rato	HFK Bioscience Co., Ltd.	/
Sevoflurano	Maruishi Pharmaceutical Co., Ltd	H20150020
Shaver	Hangzhou Huayuan Pet Products Co., Ltd.	/
Vaporizador	SPACECABS	/
Ventilador	Shanghai Alcott Biotech Co., Ltd	ALC-V8S
Tanque de Água	Maquet Critical Care AB	Jostra HCU20-600

médico Co. Kewei do oxigenador da membrana de Animal-M