Proteômica por Espectrometria de Massas Guiada por Linhagem Celular no Embrião em Desenvolvimento (Rã)

Resumo

Descrevemos aqui uma caracterização proteômica baseada em espectrometria de massa de linhagens celulares com destino tecidual conhecido no embrião do vertebrado Xenopus laevis .

Resumo

A caracterização de eventos moleculares à medida que as células dão origem a tecidos e órgãos aumenta o potencial para entender melhor o desenvolvimento normal e projetar remédios eficientes para doenças. Tecnologias que permitam a identificação e quantificação precisas de diversos tipos e grande número de proteínas forneceriam informações ainda escassas sobre os mecanismos moleculares que orquestram o desenvolvimento de tecidos e organismos no espaço e no tempo. Aqui, apresentamos um protocolo baseado em espectrometria de massas que permite a medição de milhares de proteínas em linhagens celulares identificadas em embriões de Xenopus laevis (rã). A abordagem baseia-se em mapas reprodutíveis de destino celular e métodos estabelecidos para identificar, marcar fluorescentemente, rastrear e amostrar células e suas progênies (clones) a partir deste modelo de desenvolvimento de vertebrados. Após a coleta do conteúdo celular por microamostragem ou isolamento de células por dissecção ou classificação celular ativada por fluorescência, as proteínas são extraídas e processadas para análise proteômica ascendente. Cromatografia líquida e eletroforese capilar são usadas para fornecer separação escalável para detecção e quantificação de proteínas com espectrometria de massas de alta resolução (EMAR). Exemplos representativos são fornecidos para a caracterização proteômica de células adiposas do tecido neural. A proteômica da HRMS guiada por linhagem celular é adaptável a diferentes tecidos e organismos. É suficientemente sensível, específico e quantitativo para perscrutar a dinâmica espaço-temporal do proteoma durante o desenvolvimento dos vertebrados.

Introdução

Nossa compreensão da diferenciação celular e da gênese de tecidos e órgãos é o resultado de décadas de elaboradas telas direcionadas de genes e seus produtos. Aumentar nosso conhecimento de todas as biomoléculas e suas quantidades durante eventos celulares importantes ajudaria a desvendar mecanismos moleculares que controlam o padrão espacial e temporal do plano corporal dos vertebrados. Tecnologias que permitem amplificação molecular e sequenciamento são agora capazes de relatar rotineiramente um grande número de genes e transcritos, apoiando estudos orientados por hipóteses em pesquisa biológica básica e translacional. Para entender os sistemas em desenvolvimento, u....

Protocolo

Todos os protocolos que garantem a manutenção e o manejo humanizado de rãs adultas de Xenopus laevis foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Maryland, College Park (números de aprovação R-DEC-17-57 e R-FEB-21-07).

1. Prepare as soluções

1. Para embriologia
   1. Preparar 1x, 0,5x e 0,2x solução de Steinberg (SS) e, em seguida, autoclavá-los (120 °C por 20 min) para esterilidade seguindo protocolos padrão¹².
   2. Preparar Ficoll a 3% (p/v) em SF 1x esterilizado seguindo protocolos padrão¹².
   3. Para....

Resultados

Este protocolo possibilitou o estudo de proteínas em células isoladas e suas linhagens à medida que estabelecem tecidos em embriões de X. laevis. A Figura 1 ilustra uma dessas aplicações da abordagem para estudar proteínas em células de tecido neural e o ectoderma neural recém-induzido no embrião. Como mostrado na Figura 1A, o fluxo de trabalho bioanalítico integrou ferramentas tradicionais da biologia celular e do desenvolvimento para identificar, inje.......

Discussão

Este protocolo possibilita a caracterização da expressão de proteínas em linhagens celulares identificadas em embriões da espécie Xenopus. Derivada do HRMS, a metodologia combina especificidade requintada na identificação molecular, capacidade de detecção de multiproteínas sem sondas moleculares (geralmente centenas a milhares de proteínas diferentes) e capacidade de quantificação. A adaptabilidade a ferramentas clássicas e fluxos de trabalho em (neuro)biologia celular e de desenvolvimento expande a proteômica d.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Acetonitrila (grau LC-MS)	Fisher Scientific	A955
Agarose	ThermoFisher Scientific	R0492
Bicarbonato de amônio	Fisher Scientific	A643-500
Coluna Analítica	Thermo Scientific	164941
Microbalança Analítica	Mettler-Toledo	XSE105DU
Plataforma automática de fracionamento de peptídeos	Agilent	1260 Infinity II
Borosilicate Capillaries	Sutter Instruments Co.	B100-50-10
Capilares de borosilicato (para fazer emissores)	Sutter Instruments	B100-75-10
C18 colunas de rotação (para dessalinização)	ThermoFisher Scientific	89870
Câmera ro monitor eletrospray	Edmund Optics Inc.	EO-2018C
Combretastatina A4	Millipore Sigma	C7744
Sistema CESI comercial	AB SCIEX	CESI
(Ácido ciclohexilamino) -1-propanossulfônico (CAPS)	VWR	97061-492
Citocalasina D	Millipore Sigma	C8273
Dextran, Alexa Fluor 488; 10.000 MW, aniônico, fixável	ThermoFisher Scientific	D22910
Diothiothreitol	Fisher Scientific	FERR0861
Dumont #5 Fórceps	Fine Science Tools	11252-30
EDTA	Fisher Scientific	AAJ62786AP
Fonte de luz de epifluorescência	Lumencore	AURA III
Eppendorf LoBing microcentrífugas  tubos: proteína	Fisher Scientific	13-698-793
Ácido fórmico (grau LC-MS)	Fisher Scientific	A117-50
Freezer (-20 ° C)	Fisher Scientific	97-926-1
Freezer (-80 ° C)	Thermo Scientific	TSX40086A
Capilar de sílica fundida	Molex	1088150596
Bloco de calor	Benchmark	BSH300
Sistema de cromatografia líquida de alta pressão	ThermoFisher Scientific	Dionex Ultimate 3000 RSLC nanossistema
Fonte de alimentação de alta tensão	Spellman	CZE1000R
Espectrômetro de massa de alta resolução	ThermoFisher Scientific	Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer
HPLC caps	Frascos	C4013-40A
	Scientific	C4013-11
Iluminador, por exemplo, Goosenecks	Nikon	C-FLED2
Ingenuity Pathway Analysis	Qiagen
Iodoacetamida	Fisher Scientific	AC122275000
Metanol (grau LC-MS)	Fisher Scientific	A456
Metanol (grau LC-MS)	Extrator microcapilar Fisher Scientific	A456-4
	Suttor Instruments	P-2000
Microinjetor	Warner Instrument, Handem, CT	PLI-100A
Extrator de micropippette	Sutter Instruments Co.	Software de análise de dados P-1000
MS, software comercial	ProteomeDiscoverer
MS,	MaxQuant
non-idet 40	Millipore Sigma	11754599001 placa de
Petri 60 mm e 80 mm	Fisher Scientific	S08184
Pierce 10 µ Cama em L Zip-tips (para dessalinização)	ThermoFisher Scientific	87782
Pierce kit de ensaio de proteína de ácido bicinchonínico	ThermoFisher Scientific	23225
Pierce ensaio de peptídeo colorimétrico quantitativo	ThermoFisher Scientific	23275
Pierce Tryps Protease (MS Grade)	Frascos
Protein LoBind	Eppendorf	0030108434 ,
Incubadora Refrigerada	Eppendorf
	Millipore Sigma	220078
pirofosfato de sódio	Sigma Aldrich	221368-100G
	Frascos de
	Estereomicroscópio personalizado
(objetiva 10x)	Nikon	SMZ 1270, SZX18
Sucrose	VWR	97063-790
Bombas de seringa (2)	Aparelho Harvard	704506
Seringas (à prova de gás): 500-ndash; 1000 µ L	Hamilton	1750TTL
Pipetas de transferência (Plástico, descartáveis)	Fisher Scientific	13-711-7M
Coluna de Armadilha	Thermo Scientific	164750
Tris-HCl (solução 1 M)	Fisher Scientific	AAJ22638AP
Concentrador de vácuo capaz de operar a 4– 10 ° C	Labconco	7310022
Vortex-mixer	Benchmark	BS-VM-1000
Água (grau LC-MS)	Água Fisher Scientific	W6
(grau LC-MS)	Fisher Scientific	W6
XYZ Estágio de tradução	Thorlabs	PT3
XYZ Personalizado