Artigo de método

Preparação e caracterização de biotinta de hidrogel biohíbrido 3D à base de grafeno para neuroengenharia periférica

DOI:

10.3791/63622

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16 de maio de 2022

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1Vocational School of Health Services, Istinye University, 2Chemical Metallurgy Faculty, Yildiz Technical University, 3Faculty of Medicine, Department of Histology & Embryology, Istinye University, 43D Bioprinting Design & Prototyping R&D Center, Istinye University, 5Stem Cell, and Tissue Engineering R&D Center, Istinye University, 6Vocational School of Health Services, Altinbas University, 7The V. Akhundov National Scientific Research Medical Prophylactic Institute, 8Center for Stem Cells and Regenerative Medicine (LivMedCell), Liv Hospital

Neste artigo

Resumo

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Neste manuscrito, demonstramos a preparação de uma biotinta hidrogel biohíbrida contendo grafeno para uso em engenharia de tecidos periféricos. Utilizando este material biohíbrido 3D, é realizado o protocolo de diferenciação neural de células-tronco. Este pode ser um passo importante para trazer biomateriais semelhantes para a clínica.

Resumo

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Neuropatias periféricas podem ocorrer como resultado de dano axonal e, ocasionalmente, devido a doenças desmielinizantes. A lesão dos nervos periféricos é um problema global que ocorre em 1,5%-5% dos pacientes de emergência e pode levar a perdas significativas de empregos. Hoje, as abordagens baseadas em engenharia de tecidos, consistindo em arcabouços, linhagens celulares apropriadas e biossinais, tornaram-se mais aplicáveis com o desenvolvimento de tecnologias de bioimpressão tridimensional (3D). A combinação de vários biomateriais de hidrogel com células-tronco, exossomos ou moléculas de biosinalização é frequentemente estudada para superar os problemas existentes na regeneração de nervos periféricos. Nesse sentido, a produção de sistemas injetáveis, como hidrogéis, ou estruturas de condutos implantáveis formadas por diversos métodos de bioimpressão tem ganhado importância na neuroengenharia periférica. Em condições normais, as células-tronco são as células regenerativas do corpo, e seu número e funções não diminuem com o tempo para proteger suas populações; Estas não são células especializadas, mas podem se diferenciar mediante estimulação apropriada em resposta à lesão. O sistema de células-tronco está sob a influência de seu microambiente, chamado de nicho de células-tronco. Nas lesões nervosas periféricas, especialmente na neurotmese, esse microambiente não pode ser totalmente resgatado mesmo após a ligação cirúrgica das terminações nervosas cortadas. A abordagem de biomateriais compósitos e terapias celulares combinadas aumenta a funcionalidade e aplicabilidade dos materiais em termos de várias propriedades, como biodegradabilidade, biocompatibilidade e processabilidade. Nesse sentido, este estudo tem como objetivo demonstrar a preparação e o uso de padrões de hidrogel biohíbrido à base de grafeno e examinar a eficiência da diferenciação de células-tronco em células nervosas, o que pode ser uma solução eficaz na regeneração nervosa.

Introdução

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O sistema nervoso, que é o mecanismo que faz a ponte entre a estrutura interna do organismo e o ambiente, é dividido em duas partes: o sistema nervoso central e o periférico. A lesão dos nervos periféricos é um problema global que constitui 1,5%-5% dos pacientes que chegam ao pronto-socorro e se desenvolve devido a vários traumas, levando à perda significativa do emprego 1,2,3.

Atualmente, as abordagens celulares da neuroengenharia periférica são de grande interesse. As células-tronco vêm em primeiro lugar entre as células usadas nessas abordagens. Em condições normais, as células-tronco são as células regenerativas do corpo, e seu número e funções não diminuem com o tempo para proteger suas populações; Essas células são especializadas, mas podem se diferenciar mediante estimulação apropriada em resposta àlesão4,5. De acordo com a hipótese das células-tronco, o sistema de células-tronco está sob a influência de seu microambiente, chamado nicho de células-tronco. A preservação e diferenciação das células-tronco são impossíveis sem a presença de seumicroambiente6, que pode ser reconstituído via engenharia tecidual utilizando células e scaffolds7. A engenharia de tecidos é um campo multidisciplinar que inclui princípios de engenharia e biologia. A engenharia tecidual fornece ferramentas para a criação de tecidos artificiais que podem substituir tecidos vivos e podem ser usados na regeneração desses tecidos, removendo os tecidos danificados e fornecendo tecidos funcionais8. Os arcabouços teciduais, um dos três pilares da engenharia de tecidos, são produzidos por diferentes métodos a partir de materiais naturais e sintéticos9. A impressão tridimensional (3D) é uma tecnologia emergente de manufatura aditiva que é amplamente utilizada para substituir ou restaurar tecidos defeituosos através de sua produção simples, mas versátil, de formas complexas usando vários métodos. A bioimpressão é um método de manufatura aditiva que possibilita a coexistência de células e biomateriais, denominados biotintas10. Considerando a interação das células nervosas entre si, os estudos mudaram para candidatos a biomateriais condutores, como o grafeno. As nanoplacas de grafeno, que possuem propriedades como eletrônica flexível, supercapacitores, baterias, óptica, sensores eletroquímicos e armazenamento de energia, são um biomaterial preferido no campo da engenharia de tecidos11. O grafeno tem sido utilizado em estudos onde foi realizada a proliferação e regeneração de tecidos e órgãos lesados12,13.

A engenharia de tecidos consiste em três blocos de construção básicos: arcabouço, células e moléculas de biossíntese. Existem deficiências nos estudos sobre lesão de nervos periféricos em termos de fornecer essas três estruturas completamente. Vários problemas têm sido encontrados nos biomateriais produzidos e utilizados nos estudos, como o de conter apenas células-tronco ou moléculas de biossinais, a falta de uma molécula bioativa que permita a diferenciação com células-tronco, a falta de biocompatibilidade do biomaterial utilizado e o baixo efeito sobre a proliferação de células no nicho tecidual, e, assim, a condução nervosa não sendo totalmente realizada 2,13,14,15,16. Isso requer a otimização da regeneração nervosa, reduzindo a atrofia muscular 17,18 e criando homing necessário19 com fatores de crescimento contra tais problemas. Nesse ponto, a caracterização e análise da neuroatividade de um protótipo de biomaterial cirúrgico, a ser transferido para a clínica, são muito importantes.

Nesse sentido, este estudo investiga a padronização de hidrogel de biotinta com nanoplacas de grafeno formadas por uma bioimpressora 3D e sua eficácia na diferenciação neurogênica das células-tronco que contém. Além disso, os efeitos do grafeno na formação e diferenciação da neuroesfera são investigados.

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Protocolo

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1. Cultura de células-tronco mesenquimais gelatinosas de Wharton

  1. Retire as células-tronco mesenquimais gelatinosas da Wharton (WJ-MSCs, da ATCC) de um freezer de -80 °C. Culturas de CTMs-WJ em meio DMEM-F12 contendo 10% de soro fetal bovino (SFB), 1% de Pen-Strep e 1% de L-glutamina em fluxo laminar estéril à temperatura ambiente, conforme descrito em Yurie et al.20.
  2. Criopreservar algumas células a 1 x 106 células/mL com meio de congelamento contendo 35% FBS, 55% DMEMF-12 e 10% dimetil sulfóxido (DMSO). Para isso, conte 1 x 106 células em uma lâmina de contagem de células Thoma e adicione a solução de congelamento gota a gota. Transfira rapidamente a lâmina para um recipiente de nitrogênio líquido.
  3. Quando as células cultivadas estiverem 80% confluentes no frasco, despeje o meio e lave com 5 mL de PBS. Adicionar 5 mL de tripsina a 0,25% e EDTA-4Na 2,21 mM. Incubar numa incubadora a 37 °C durante 5 min.
  4. Adicionar 10 mL de meio DMEM-F12 com FBS a 10% às células retiradas da incubadora. Suspenda bem, colete o meio e transfira o meio para um tubo centrífugo.
  5. Centrifugar a uma velocidade de rotação de 101 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente. Eliminar o sobrenadante e resemear as células em frascos novos com meio nutritivo fresco contendo 10% de SFB.
    NOTA: As CTMs comerciais marcadas com o gene GFP pelo método de transdução podem ser usadas para melhor visualizar as interações biomaterial-célula a serem produzidas21. Os grupos a serem utilizados nesse método podem ser criados conforme mostrado na Tabela 1.

Grupos criadosRazões para criarNúmero de representantes
2D WJ-MSCs (2D-C)Controle 2Dx 5
2D WJ-MSCs & Grafeno (2D-G)Determinação da dose tóxica de grafeno em 2Dx 5 repetições para cada uma das diferentes concentrações
WJ-MSCs estão incluídos em biotintas (3D-B)Controle 3Dx 3
WJ-MSCs & 0,1% Grafeno estão incluídos em biotintas (3D-G)Grupo Biohíbrido 3D Grafeno-Biotintax 3
WJ-MSCs estão na forma esferoide nas biotintas (3D-BS)Controle 3D da Forma Esferoidex 3
WJ-MSCs & 0,1% O grafeno está na forma esferoide nas biotintas (grupo 3D-GS)Grupo Biohíbrido 3D Grafeno-Biotinta de Forma Esferoidex3
Gota de Biotinta 3DÉ produzido para análise de caracterização por MEV e FTIR.x5
Gota de grafeno 3DÉ produzido para análise de caracterização por MEV e FTIR.x5
Biotinta 3D com GFP marcada WJ-MSCs & 0,1%Observação dos movimentos das WJ-MsCs na biotinta contendo a dose adequada de grafeno.x3

Tabela 1. Grupos no método. Todos os grupos 2D e 3D no método estão incluídos.

2. Toxicidade do grafeno e imagens 2D

  1. Preparação de concentrações de grafeno e aplicação em células
    OBS: Nanopartículas de grafeno bruto foram adquiridas comercialmente (tipo nanoplacas industriais de grafeno) e também foram doadas. As dimensões das partículas foram de 5-8 nm de espessura, 5 μm de diâmetro e 120-150 m2/g de área superficial.
    1. Pesar o grafeno para criar uma solução a 1% (mg/ml). Faça uma solução-estoque adicionando 10 mL de meio DMEMF-12 com 10% de FBS aos 100 μg de nanopartículas de grafeno pesados e rotule essa solução como solução-estoque. Esterilizar em autoclave a 121 °C sob pressão de 1,5 atm por 20 min.
      NOTA: A mistura estéril de grafeno é armazenada no frigorífico a 4 °C até à utilização. Pode não ser adequado para uso a longo prazo (máximo de 1 mês). Nesses casos, a mistura deve ser reconstituída e esterilizada.
    2. Preparar uma mistura de grafeno médio em diferentes concentrações para determinar doses não tóxicas. Defina as diluições iniciais como 1%, 0,1%, 0,01%, 0,001% e 0,0001% grafeno/meio.
    3. Começando com a solução-estoque a 1%, retire sucessivamente 1 mL de cada concentração e transfira-o para um novo tubo. Adicionar 9 mL de meio DMEMF-12 com FBS a 10% a cada tubo, fazendo cinco amostras diluídas gradualmente, e agitar e agitar as soluções para obter distribuição igual. Utilizar apenas 10 mL de meio DMEMF-12 com SFB a 10% como controle.
      NOTA: Os pesados flocos de grafeno precipitam-se e, portanto, precisam ser redistribuídos.
    4. Semeando as CTMs-WJ em placas de 6 poços com 2 mL de meio fresco contendo 10% de SFB a 5 x 105 células por poço. Incubar durante 1 dia a 37 °C. Em seguida, divida as placas em grupos de poços iguais e repetidos. Faça cinco repetições para cada concentração.
    5. Descarte o meio e, em seguida, substitua o meio por concentrações de meio de grafeno a 2 mL por poço. Use apenas a mídia para o grupo de controle. Incubar as placas a 37 °C durante 24 horas.
  2. Determinação de concentrações não tóxicas de grafeno com MTT
    1. Descarte o meio com grafeno após 24 h. Lave bem cada um com PBS. Adicionar meio DMEMF-12 fresco com 10% de FBS a 2mL por poço.
      NOTA: É importante lavar com PBS após a aplicação das concentrações de grafeno na célula, pois as nanopartículas de grafeno, que não são levadas para dentro da célula por endocitose, são removidas do ambiente. Isso torna o teste MTT mais eficiente.
    2. Utilizar o protocolo MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio) para determinar o valor de IC50 indicando 50% de viabilidade celular, conforme descrito em Kose et al.22 e nas etapas 2.2.3.-2.2.6.
    3. Primeiro, pesar 5 mg/mL de sal MTT e dissolver em PBS. Esterilizar com filtro de 0,45 μm. Embrulhar a solução de MTT, feita em um tubo de centrífuga de 15 mL, com papel alumínio e armazenar a 4 °C.
    4. Adicionar 10 μL de MTT a todos os poços e incubar a placa durante 4 h a 37 °C. Observar a formação de cristais de formazana em aumento de 10x ao microscópio após a incubação.
    5. Para dissolver os cristais formados nas células, adicione 100 μL de DMSO a cada poço e misture por pipetagem. Mantenha a placa no escuro à temperatura ambiente durante 30 minutos. Insira a placa no leitor de placas ELISA. Defina um comprimento de onda de 570 nm do programa para medição de absorbância e peça-lhe que leia a placa22.
      NOTA: Além disso, enquanto as partículas de grafeno sozinhas são lidas a 270 nm23, o intervalo de leitura de 570 nm24 aqui será apenas para leitura da viabilidade celular.
    6. Realizar análise estatística dos resultados obtidos utilizando ANOVA one-way com teste de Tukey em um programa de análise estatística.
  3. Imagem de pontos
    1. Para examinar a interação de diferentes concentrações de grafeno com as células, realize um lapso de tempo das células com o método chamado imagem por pontos. Este método cria uma imagem de lapso de tempo usando amostras de imagem tiradas em intervalos regulares sob o microscópio.
    2. Para fazer isso, ligue o computador primeiro. Ligue a incubadora de imagens de lapso de tempo e configure-a para 37 °C. Coloque a placa MTT no slot da incubadora de lapso de tempo.
    3. Abra o programa Stitch no computador. Especifique os poços a serem lidos no sistema. Traga o leitor para o primeiro poço e localize e foque a área em 10x de ampliação em luz branca. Inicie o programa.
      NOTA: É um programa para criar colagens de fotos múltiplas de alta qualidade de 4 linhas x 5 colunas. O programa combina fotos tiradas uma após a outra em qualidade HD. Quando você pressiona o botão de início do sistema, os poços são lidos automaticamente, e ele tira e costura 4 linhas x 5 colunas várias fotos.

3. Produção de hidrogel biohíbrido de grafeno - Bioink e diferenciação de CTMs-WJ

  1. Produção de biotintas
    NOTA: Os pós de Alginato-Gelatina liofilizados comercialmente disponíveis (3:5) são usados como base de biotintas. O grupo de biotinta de grafeno (3D-G; 3D-GS) e o grupo de biotinta controle sem grafeno (3D-B; 3D-BS) são preparados com o mesmo método (Tabela 1).
    1. Use tubos cônicos de 50 mL para o preparo. Primeiro, pesar 4,5 mg de alginato e 1,5 mg de gelatina e transferir para um tubo de centrífuga. Adicionar meio DMEMF-12 contendo 10% de FBS à mistura para um volume total de 50 mL. Este é o grupo controle (C) sem grafeno.
    2. Repetir a pesagem de 4,5 mg de alginato e 1,5 mg de gelatina e transferir para um tubo de centrifugação. Em seguida, tome 50 μL do grafeno 0,1% preparado do passo 2.1.3. e adicione-o ao tubo. Adicionar DMEMF-12 com FBS a 10% para um volume total de 50 mL.
    3. Misture as biotintas primeiro por pipetagem e depois vórtice. Esterilizar em autoclave a 121 °C sob pressão de 1,5 atm por 20 min. Alternativamente, realizar a esterilização por micro-ondas até o ponto de ebulição.
    4. Após as misturas serem autoclavadas, centrifugar a 280 x g por 2 min em temperatura ambiente para remover as bolhas formadas. Manter as biotintas a 37 °C até que as células estejam preparadas.
  2. Adição de WJ-MSCs e bioimpressão 3D
    1. Para a contagem, lavar as células quando houver 80% de confluência com aproximadamente 5 mL de PBS e adicionar 5 mL de tripsina a 0,25% e EDTA 4Na 2,21 mM. Deixe agir por 5 min a 37 °C.
    2. Adicionar 10 mL de meio DMEM-F12 com FBS a 10% às células após a retirada da incubadora. Suspenda bem, colete o meio e transfira-o para um tubo centrífugo. Centrifugar a 101 x g durante 5 min à temperatura ambiente e, em seguida, eliminar o sobrenadante.
    3. Deixar aproximadamente 250 μL de meio com o pellet. Redissolver o pellet em 1 mL de meio fresco. A 48 μL de meio, adicionar 2 μL de suspensão celular e 50 μL de azul de tripano (0,4 g azul de tripano/100 mL) em um tubo cônico (1,5 mL) para contagem4. Pipetar bem.
    4. Adicionar aproximadamente 10 mL da suspensão de células coradas preparada a uma câmara de contagem de células Thoma. Calcule o número médio de células caindo nos quadrados em ambos os lados do microscópio de luz.
      Calcular a porcentagem de vitalidade (%) = (células viáveis contadas/total de células contadas) x 100
      NOTA: A interação célula-biotinta é estudada de duas maneiras: (1) Pode ser impressa adicionando-a às biotintas (3D-B; 3D-G); (2) As células são semeadas nas biotintas após serem prensadas, e as células formam um esferoide (3D-BS; 3D-GS).
    5. Para a interação célula-biotinta, primeiro crie os grupos de biotinta (Tabela 1). O grupo 1 inclui impressão 3D-B e 3D-G com biotinta para bioimpressão. O grupo 2 inclui biotintas 3D-BS e 3D-GS nas quais esferoides foram formados após bioimpressão.
    6. Conte as células do grupo 1 para que haja aproximadamente 1 x 107 células em 0,5 mL de meio. Adicionar 4,5 mL de biotinta para elevar o volume total para 5 mL. Transfira para os cartuchos no armário estéril com a ajuda de seringas. Instale os cartuchos na seção da extrusora correspondente da bioimpressora.
    7. Para o segundo grupo, pegue 5 mL de cada um dos grupos de biotinta e transfira-os para cartuchos estéreis com a ajuda de um injetor.
    8. Use a bioimpressora com duas cabeças de impressão coaxiais e a tecnologia de extrusão acionada pneumática. Ajuste a resolução X/Y/Z por micropasso para 1,25 μm, a largura de extrusão para 400 μm e a altura de extrusão para 200 μm. Uma grade de 20 mm x 20 mm x 5 mm é um dos modelos 3D mais utilizados para trabalhos de bioimpressão 3D.
    9. Crie os modelos 3D usando programas CAD de código aberto baseados na Web. Antes da bioimpressão, crie modelos 3D simples com uma das plataformas de código aberto (por exemplo, infill). O modelo pode ser linear (como o modelo usado aqui), favo de mel ou em forma de grade. Exporte e baixe no formato .stl depois de criar um quadrado de 5 mm x 20 mm x 20 mm.
    10. O software da bioimpressora usa arquivos .stl e os converte para o formato .gcode imprimível usando módulos de segmentação de dados. Para obter uma forma de grade imprimível, desative o shell externo no módulo de segmentação de dados. Limpe o dispositivo com etanol 70% antes da operação e, em seguida, esterilize por esterilização UV.
    11. Para o processo de bioimpressão, transfira os grupos de biotinta para os cartuchos com a ajuda de um injetor. Instale os cartuchos na seção da extrusora correspondente da bioimpressora.
    12. Ajuste a pressão média da impressora 3D para 7,5 psi e a temperatura do cartucho e da cama para 37 °C. Defina a velocidade para 60% e realize um processo de impressão 3D padrão.
      NOTA: O planejamento dos modelos preparados com espaços (como um modelo linear) permite que a cultura celular seja feita nos espaços após a bioimpressão.
    13. Coloque o sistema na posição inicial durante a fase de escrita. Posicione os eixos (X, Y, Z) automaticamente, selecione a extrusora e configure. Inicie o processo de impressão. Após o processo de bioimpressão, pegue a amostra e coloque-a sob um gabinete de fluxo laminar.
    14. Borrifar as biotintas com solução de CaCl2 0,1 N após a impressão ou adicionar 1 ml da solução com uma pipeta à temperatura ambiente. Aguarde cerca de 10-20 s e lave os padrões impressos 2x com PBS contendo Ca 2+ e Mg2+.
    15. Adicionar 2 mL de DMEMF-12 com meio FBS a 10% sobre cada um dos grupos de biotinta contendo células. Incubar as placas a 37 °C com 5% de CO2. Em seguida, adicionar 2 mL de meio de suspensão contendo 1 x 106 células a cada grupo para formação de esferoides.
    16. Incubar as placas a 37 °C com 5% de CO2. Após 24 h de incubação, observar a formação esferoide em microscópio invertido.
  3. Diferenciação de WJ-MSCs para células semelhantes a neurônios
    1. Observe e fotografe todos os lotes de biotinta após 24 h de incubação. Adicionar 2 mL de meio de diferenciação neurogênica por poço (exceto para o grupo controle) e atualizar a cada 2 dias. Acompanhar por 7 dias para observar a diferenciação neural.

4. Caracterização do hidrogel biohíbrido Grafeno-Biotinta

NOTA: Análises de time-lapse, espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FT/IR) e microscopia eletrônica de varredura (MEV) são realizadas para a caracterização do hidrogel biohíbrido grafeno-biotinta. As amostras são criadas a partir de grupos de biotintas 3D-B e 3D-G pelo método de gotejamento para análise FT/IR e MEV.

  1. Análise FT/IR
    NOTA: FT/IR é um método analítico químico baseado na transformada matemática de Fourier, indispensável para a caracterização de materiais. Use um dispositivo FT/IR baseado nos princípios do interferômetro Michelson de 28 °C, com uma lâmpada halógena, fonte de luz de mercúrio resfriada a água, proporção de sinal de 4 cm−1, medida por 1 min, a 2.200 cm−1.
    1. Prepare o microscópio FT/IR e certifique-se de que a ótica do instrumento esteja alinhada. Calibre o dispositivo.
    2. Uma vez que a amostra está em gota, pegue um pedaço de hidrogel de 1-2 mm de espessura e coloque-o com pinça na parte da amostra. Foque na amostra e levante-a até que seja feito um contato próximo. Colete o espectro da amostra iniciando o processo a partir do sistema.
  2. Análise por microscopia eletrônica de varredura (MEV)
    NOTA: A morfologia da superfície, a estrutura interna, a distribuição celular e as interações biotinta-célula podem ser examinadas pela análise de MEV em diferentes dimensões.
    1. Soltar o hidrogel em placas de 6 poços contendo 1 mL de reticulante de CaCl2 usando o método de gotículas de ponta de pipeta (ver Figura 1).
    2. Lave as placas 2x com aproximadamente 1 mL de PBS para liberar a solução de sais. Em seguida, coloque essas gotas em um tubo de falcão contendo 5 mL de paraformaldeído a 5% com a ajuda de pinças.
    3. Faça seções finas a partir das biotintas de gota com a ajuda de um bisturi. Cole as amostras no lado pegajoso na placa de metal. Inserir no dispositivo de revestimento onde o paládio de ouro, que passa para a fase de plasma substituindo o ar por gás argônio, cobre a amostra.
    4. Coloque no microscópio eletrônico (MEV). Abra o programa do microscópio ao qual o MEV está conectado. Execute o dimensionamento e tire imagens de diferentes partes da amostra. Para esse protocolo, foram utilizadas escalas de 5 μm, 10 μm e 200 μm. Foram obtidas 40 imagens para os grupos 3D-B e 3D-G.
  3. Imagem com lapso de tempo
    NOTA: Durante a aquisição de imagens por lapso de tempo, não apenas amostras de biotinta contendo células transformadas no gene GFP foram usadas, mas também biotintas com esferoides são fotografadas por 16 h. A imagem de lapso de tempo é realizada para examinar os efeitos do grafeno nas células-tronco e para monitorar as interações celulares dentro da biotinta.
    1. Adicionar MSCs marcadas com GFP 1 x10 7 comercialmente disponíveis em 5 mL de biotinta e bioimpressão, como na etapa 3.2.11. Adicione 1 mL de reticulador, segure por 20-30 s e lave 2x com PBS.
    2. Ligue o monitor de lapso de tempo e abra o programa no computador. Defina aproximadamente 16 h no modo Time-Lapse e ajuste a temperatura para 37 °C. Pressione o botão Iniciar . Vídeos na forma de amostras de vídeo time-lapse de 40 s são gravados pelo sistema.
    3. Focalizar o microscópio em aumento de 10x a cada 2 h. Além disso, visualize os esferoides criados seguindo os mesmos passos.

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Figura 1: Grupos de biotintas 3D-B e 3D-G produzidas como gotas para uso na caracterização. (A) Amostras de biotinta (imagem de pré-caracterização) em uma placa com reticulante. (B) Imagem de gota 3D-B de biotinta. (C) Imagem de gota de biotinta 3D-G. O biomaterial a ser caracterizado e as células que ele contém podem passar mais facilmente por processos como goldplating, amostragem, etc. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Determinação da diferenciação neurogênica pelo método de imunomarcação

  1. Colete os esferoides, sem interromper as formas esféricas, e resemeie em novas placas para restain com um método mais fácil, em vez de incorporar em parafina para secção do tecido.
  2. Cobrir as placas de 48 poços com cerca de 20 mL de solução de gelatina a 0,1% pré-autoclavada e manter em incubadora por pelo menos 1 h. Pipetar aproximadamente 500 μL de gelatina 0,1% preparada em placas de 48 poços. Deixe as placas gelatinosas na incubadora por 10 min.
    NOTA: Isso permitirá que a gelatina inche ligeiramente, cobrindo a superfície e criando um ambiente melhor para os esferoides coletados se fixarem.
  3. Colete os esferoides por pipetagem, distribua os esferoides coletados da incubadora nos poços da placa de 48 poços e adicione meio fresco. Em seguida, incubar por 12-24 h.
    NOTA: É muito difícil distribuir os esferoides por contagem. Coletar os esferoides em um único tubo e distribuir uniformemente o volume total para os poços. Para este estudo, cada poço continha aproximadamente 4-6 esferoides.
    NOTA: Para amostras 2D, a pré-lavagem de manchas é suficiente e não é necessária a substituição de meios.
  4. Retire o meio e lave lentamente as células com PBS, pois os esferoides estarão no topo. Fixar em paraformaldeído a 4% por 2 h.
  5. Lavar novamente as amostras com PBS e bloquear com cerca de 10 mL de BSA a 2% e TritonX a 0,1% por 30 min. Em seguida, lave com PBS 3x.
  6. Diluir anticorpos de primer selecionados (N-caderina-coelho e β-III tubulina-camundongo) na proporção de 1:100 com solução de reagente diluente de anticorpos. Adicionar 100 μL de solução de anticorpos a cada uma das amostras e incubar durante a noite a 4 °C.
  7. Lave as amostras 3x com PBS. Incubar com anti-camundongo IgG-FTIC-coelho para tubulina β-III e anticorpo secundário anti-camundongo IgG-SC2781-cabra para N-Cad diluído a 1:200 à temperatura ambiente por 30 min. Execute todas as operações no escuro.
    NOTA: Qualquer que seja a estirpe utilizada como anticorpo primário (por exemplo, ratinho) na coloração dupla, deve ser utilizada uma estirpe diferente (por exemplo, cabra ou coelho) para o anticorpo secundário.
  8. Lavar o anticorpo secundário com PBS 3x e, em seguida, gotejar a solução DAPI (1:1) em cada uma das amostras. Aguarde 15-20 min. Realizar imagens de imunofluorescência.

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Resultados

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Toxicidade do grafeno e imagens 2D
A análise estatística dos resultados obtidos do MTT foi realizada com ANOVA one-way com teste de Tukey em software de análise estatística, e o gráfico obtido encontra-se na Figura 2. A porcentagem de grafeno em relação ao controle apresentou decréscimo significativo apenas para a concentração de grafeno a 0,001% (**p < 0,01). Não houve diferenças significativas entre os demais grupos e o controle (p > 0,05). Portanto, a concentraçã...

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Discussão

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As vantagens dos tratamentos aplicados com andaimes 3D projetados em relação aos métodos 2D convencionais estão se tornando cada vez mais perceptíveis a cada dia. Células-tronco usadas isoladamente nessas terapias ou em conjunto com arcabouços produzidos a partir de vários biomateriais com baixa biocompatibilidade e biodegradabilidade são geralmente inadequadas na regeneração de nervos periféricos. As células-tronco mesenquimais gelatinosas de Wharton (CTMs-WJ) parecem ser uma linhagem celular candidata adequada, especia...

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Divulgações

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Os autores declaram não haver conflito de interesses. O projeto foi realizado em colaboração com a HD Bioink, desenvolvedora da tecnologia de bioimpressão 3D.

Agradecimentos

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O grafeno utilizado neste estudo foi desenvolvido no Departamento de Engenharia Mecânica da Universidade de Kirklareli. Foi doado pelo Dr. Karabeyoğlu. O teste de toxicidade do grafeno foi financiado pelo projeto intitulado "Printing and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells on 3D Bioprinters with Graphene Doped Bioinks" (Application No: 1139B411802273) concluído no âmbito do TÜBİTAK 2209-B-Industry-Oriented Undergraduate Thesis Support Program. A outra parte do estudo foi apoiada pelo fundo de pesquisa fornecido pela Yildiz Technical University Scientific Research Projects (TSA-2021-4713). Células-tronco mesenquimais com GFP usadas na etapa de imagem time-lapse foram doadas pela Virostem Biotechnology. Os autores agradecem ao Darıcı LAB e à equipe do YTU The Cell Culture and Tissue Engineering LAB pelas discussões produtivas.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários

Hitachi		cultura de pilha e
biomaterialUsado para o reticulador
0,22 µ m filtro de membranaAι Sι moUsado para esterilização
0,45 µ m filtro de seringaAι Sι moUsado para esterilização
tubo cônico de 1,5 mLEppendorfaUsado para gota de bioink
15mL Falcon tubeNestUsado na etapa de cultura de células
25 cm2 frascos de cultura de células (Falcon, TPP frascos de cultura de tecidosNestUsado para cultura de células
3DBioprinting Axolotl Biosystems Bio A2 (Turquia)Etapa
de bioimpressão50 mL Falcon tubeNestUsado na etapa de cultura de células
6/24/48/96 placas de poço (Falcon, microplacas TPP)Merck MilliporeUsado na etapa de cultura de células
Frascos de cultura de células de 75 cm2 (Falcon, frascos de cultura de tecidos TPPNestUsado para cultura de células
Anti camundongo IgG-FTIC-rabbitSanta Cruz BiotechnologyJ1514Anticorpo secundário, usado para corante
Anti anti anti camundongo IgG-SC2781-goatSanta Cruz BiotechnologyC3109Anticorpo secundário, usado para o
dispositivo de revestimento de corante Au EM ACE600Leicapara chapeamento de ouro da seção de biomaterial antes da imagem SEM
AutoclaveNUVE-OT 90LUsado para o processo de esterilização.
AutoclaveNUVE-OT 90LUtilizado para o processo de esterilização.
Cell Cultre CabineHera Safe KSUsado para o processo de cultura de células
Meio de Eagle Modificado de Dulbecco/Mistura de Nutrientes-F12SigmaRNBJ7249Usado como meio de cultura de células
FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEMQuantaFEG 450para SEM
Soro Fetal Bovino-FBSCapricornFBS-16AFoi usado adicionando ao meio de cultura de células.
Freezer -80° CPanasonicMDF-U5386S-PEFomos usados para armazenar células e os exossomos resultantes
Gelatina-Alginato bioink em póHD BioinkUsado para a etapa de bioink produzida
GFP rotulada-WJ-MSCsVirostemUsado para imagens para interação célula-bioink
Nanoplaquetas de grafeno (Grafeno-IGP2)Grafen Chemical Industries Co.Usado para a produção de anticorpos de imunofluorescência 3D-G bioink
(N-CAD; β-III Tubulina)Sinalização celular e Santa CruzUsado para corante
JASCO 6600Tetrapara FTIR
MTT EnsaioSigmaTeste de viabilidade
Penicilina/Estreptomicina SoluçãoCapricórnioPB-SFoi adicionado ao meio para evitar contaminação em cultura de células.
Thoma slideIsolabUsado para contar a célula
Time-Lapse Imaging SystemZeiss Axio.Observer.Z1Imaging
Tripsin-EDTAMulticellO frasco foi usado para remover as células que cobriam a superfície.
VorteksBiobasePara a etapa de bioink produzida
WJ-MSCsATCCUsado para o processo de cultura celular
centrífugo Usado na etapa 0.1N CaCl2 HD Bioink da do

Referências

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