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Artigo de método

Preparação e caracterização de biotinta de hidrogel biohíbrido 3D à base de grafeno para neuroengenharia periférica

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DOI:

10.3791/63622

16 de maio de 2022

Neste artigo

Resumo

Neste manuscrito, demonstramos a preparação de uma biotinta hidrogel biohíbrida contendo grafeno para uso em engenharia de tecidos periféricos. Utilizando este material biohíbrido 3D, é realizado o protocolo de diferenciação neural de células-tronco. Este pode ser um passo importante para trazer biomateriais semelhantes para a clínica.

Resumo

Neuropatias periféricas podem ocorrer como resultado de dano axonal e, ocasionalmente, devido a doenças desmielinizantes. A lesão dos nervos periféricos é um problema global que ocorre em 1,5%-5% dos pacientes de emergência e pode levar a perdas significativas de empregos. Hoje, as abordagens baseadas em engenharia de tecidos, consistindo em arcabouços, linhagens celulares apropriadas e biossinais, tornaram-se mais aplicáveis com o desenvolvimento de tecnologias de bioimpressão tridimensional (3D). A combinação de vários biomateriais de hidrogel com células-tronco, exossomos ou moléculas de biosinalização é frequentemente estudada para superar os problemas existentes na regeneração de nervos periféricos. Nesse sentido, a produção de sistemas injetáveis, como hidrogéis, ou estruturas de condutos implantáveis formadas por diversos métodos de bioimpressão tem ganhado importância na neuroengenharia periférica. Em condições normais, as células-tronco são as células regenerativas do corpo, e seu número e funções não diminuem com o tempo para proteger suas populações; Estas não são células especializadas, mas podem se diferenciar mediante estimulação apropriada em resposta à lesão. O sistema de células-tronco está sob a influência de seu microambiente, chamado de nicho de células-tronco. Nas lesões nervosas periféricas, especialmente na neurotmese, esse microambiente não pode ser totalmente resgatado mesmo após a ligação cirúrgica das terminações nervosas cortadas. A abordagem de biomateriais compósitos e terapias celulares combinadas aumenta a funcionalidade e aplicabilidade dos materiais em termos de várias propriedades, como biodegradabilidade, biocompatibilidade e processabilidade. Nesse sentido, este estudo tem como objetivo demonstrar a preparação e o uso de padrões de hidrogel biohíbrido à base de grafeno e examinar a eficiência da diferenciação de células-tronco em células nervosas, o que pode ser uma solução eficaz na regeneração nervosa.

Introdução

O sistema nervoso, que é o mecanismo que faz a ponte entre a estrutura interna do organismo e o ambiente, é dividido em duas partes: o sistema nervoso central e o periférico. A lesão dos nervos periféricos é um problema global que constitui 1,5%-5% dos pacientes que chegam ao pronto-socorro e se desenvolve devido a vários traumas, levando à perda significativa do emprego 1,2,3.

Atualmente, as abordagens celulares da neuroengenharia periférica são de grande interesse. As células-tronco vêm em primeiro lugar entre as células usadas nessas abordagens.....

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Protocolo

1. Cultura de células-tronco mesenquimais gelatinosas de Wharton

  1. Retire as células-tronco mesenquimais gelatinosas da Wharton (WJ-MSCs, da ATCC) de um freezer de -80 °C. Culturas de CTMs-WJ em meio DMEM-F12 contendo 10% de soro fetal bovino (SFB), 1% de Pen-Strep e 1% de L-glutamina em fluxo laminar estéril à temperatura ambiente, conforme descrito em Yurie et al.20.
  2. Criopreservar algumas células a 1 x 106 células/mL com meio de congelamento contendo 35% FBS, 55% DMEMF-12 e 10% dimetil sulfóxido (DMSO). Para isso, conte 1 x 106 células em uma lâmina de contagem de células Thoma e adicio....

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Resultados

Toxicidade do grafeno e imagens 2D
A análise estatística dos resultados obtidos do MTT foi realizada com ANOVA one-way com teste de Tukey em software de análise estatística, e o gráfico obtido encontra-se na Figura 2. A porcentagem de grafeno em relação ao controle apresentou decréscimo significativo apenas para a concentração de grafeno a 0,001% (**p < 0,01). Não houve diferenças significativas entre os demais grupos e o controle (p > 0,05). Portanto, a concentraçã.......

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Discussão

As vantagens dos tratamentos aplicados com andaimes 3D projetados em relação aos métodos 2D convencionais estão se tornando cada vez mais perceptíveis a cada dia. Células-tronco usadas isoladamente nessas terapias ou em conjunto com arcabouços produzidos a partir de vários biomateriais com baixa biocompatibilidade e biodegradabilidade são geralmente inadequadas na regeneração de nervos periféricos. As células-tronco mesenquimais gelatinosas de Wharton (CTMs-WJ) parecem ser uma linhagem celular candidata adequada, especia.......

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesses. O projeto foi realizado em colaboração com a HD Bioink, desenvolvedora da tecnologia de bioimpressão 3D.

Agradecimentos

O grafeno utilizado neste estudo foi desenvolvido no Departamento de Engenharia Mecânica da Universidade de Kirklareli. Foi doado pelo Dr. Karabeyoğlu. O teste de toxicidade do grafeno foi financiado pelo projeto intitulado "Printing and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells on 3D Bioprinters with Graphene Doped Bioinks" (Application No: 1139B411802273) concluído no âmbito do TÜBİTAK 2209-B-Industry-Oriented Undergraduate Thesis Support Program. A outra parte do estudo foi apoiada pelo fundo de pesquisa fornecido pela Yildiz Technical University Scientific Research Projects (TSA-2021-4713). Células-tronco mesenquimais com GFP usadas na etapa de imagem time-lapse f....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários

Hitachi
cultura de pilha e
biomaterialUsado para o reticulador
0,22 µ m filtro de membranaAι Sι moUsado para esterilização
0,45 µ m filtro de seringaAι Sι moUsado para esterilização
tubo cônico de 1,5 mLEppendorfaUsado para gota de bioink
15mL Falcon tubeNestUsado na etapa de cultura de células
25 cm2 frascos de cultura de células (Falcon, TPP frascos de cultura de tecidosNestUsado para cultura de células
3DBioprinting Axolotl Biosystems Bio A2 (Turquia)Etapa
de bioimpressão50 mL Falcon tubeNestUsado na etapa de cultura de células
6/24/48/96 placas de poço (Falcon, microplacas TPP)Merck MilliporeUsado na etapa de cultura de células
Frascos de cultura de células de 75 cm2 (Falcon, frascos de cultura de tecidos TPPNestUsado para cultura de células
Anti camundongo IgG-FTIC-rabbitSanta Cruz BiotechnologyJ1514Anticorpo secundário, usado para corante
Anti anti anti camundongo IgG-SC2781-goatSanta Cruz BiotechnologyC3109Anticorpo secundário, usado para o
dispositivo de revestimento de corante Au EM ACE600Leicapara chapeamento de ouro da seção de biomaterial antes da imagem SEM
AutoclaveNUVE-OT 90LUsado para o processo de esterilização.
AutoclaveNUVE-OT 90LUtilizado para o processo de esterilização.
Cell Cultre CabineHera Safe KSUsado para o processo de cultura de células
Meio de Eagle Modificado de Dulbecco/Mistura de Nutrientes-F12SigmaRNBJ7249Usado como meio de cultura de células
FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEMQuantaFEG 450para SEM
Soro Fetal Bovino-FBSCapricornFBS-16AFoi usado adicionando ao meio de cultura de células.
Freezer -80° CPanasonicMDF-U5386S-PEFomos usados para armazenar células e os exossomos resultantes
Gelatina-Alginato bioink em póHD BioinkUsado para a etapa de bioink produzida
GFP rotulada-WJ-MSCsVirostemUsado para imagens para interação célula-bioink
Nanoplaquetas de grafeno (Grafeno-IGP2)Grafen Chemical Industries Co.Usado para a produção de anticorpos de imunofluorescência 3D-G bioink
(N-CAD; β-III Tubulina)Sinalização celular e Santa CruzUsado para corante
JASCO 6600Tetrapara FTIR
MTT EnsaioSigmaTeste de viabilidade
Penicilina/Estreptomicina SoluçãoCapricórnioPB-SFoi adicionado ao meio para evitar contaminação em cultura de células.
Thoma slideIsolabUsado para contar a célula
Time-Lapse Imaging SystemZeiss Axio.Observer.Z1Imaging
Tripsin-EDTAMulticellO frasco foi usado para remover as células que cobriam a superfície.
VorteksBiobasePara a etapa de bioink produzida
WJ-MSCsATCCUsado para o processo de cultura celular
centrífugo Usado na etapa 0.1N CaCl2 HD Bioink da do

Referências

  1. Kamasak, B., et al. Peripheral Nerve Injuries and Physiotherapy. Clinical Physiotherapy. 19, Vize Publishing, Istanbul. (2019).
  2. Yegiyants, S., Dayicioglu, D., Kardashian, G., Panthaki, Z. J. Traumatic peripheral nerve injury: A wartime review. Journal of Craniofacial Surgery....

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Reimpressões e permissões

Etiquetas

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