Artigo de método

Imagem Biomolecular da Captação Celular de Nanopartículas utilizando Microscopia Óptica Multimodal Não Linear

DOI:

10.3791/63637

⸱

16 de maio de 2022

 ,  ,  , 
1Biomedical Physics, School of Physics and Astronomy, University of Exeter

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Este artigo apresenta a integração de um módulo de focalização espectral e um laser de pulso de dupla saída, permitindo imagens hiperespectrais rápidas de nanopartículas de ouro e células cancerígenas. Este trabalho tem como objetivo demonstrar os detalhes de técnicas ópticas não lineares multimodais em um microscópio de varredura a laser padrão.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sondar nanopartículas de ouro (AuNPs) em sistemas vivos é essencial para revelar a interação entre AuNPs e tecidos biológicos. Além disso, ao integrar sinais ópticos não lineares, como espalhamento Raman estimulado (SRS), fluorescência excitada de dois fótons (TPEF) e absorção transitória (TA) em uma plataforma de imagem, ele pode ser usado para revelar o contraste biomolecular de estruturas celulares e AuNPs de maneira multimodal. Este artigo apresenta uma microscopia óptica não linear multimodal e a aplica para realizar imagens quimicamente específicas de AuNPs em células cancerígenas. Essa plataforma de imagem fornece uma nova abordagem para desenvolver AuNPs funcionalizadas mais eficientes e determinar se elas estão dentro de vasculaturas ao redor dos espaços tumoral, pericelular ou celular.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As nanopartículas de ouro (AuNPs) mostraram grande potencial como sondas de imagem biocompatíveis, por exemplo, como substratos eficazes de espectroscopia Raman aprimorada por superfície (SERS) em várias aplicações biomédicas. As principais aplicações incluem campos como biossensoriamento, bioimagem, espectroscopias aprimoradas de superfície e terapia fototérmica para o tratamento do câncer1. Além disso, sondar AuNPs em sistemas vivos é crucial para avaliar e entender a interação entre AuNPs e sistemas biológicos. Existem várias técnicas analíticas, incluindo espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) 2, espectrometria de massa indutivamente acoplada à ablação a laser (LA-ICP-MS)3 e ressonância magnética (MRI)4 que têm sido usadas com sucesso para investigar a distribuiçãode AuNPs em tecidos. No entanto, esses métodos sofrem de várias desvantagens, como ser demorado e envolver o preparo complexo da amostra3, exigindo longos tempos de aquisição, ou a falta de resolução espacial sub-mícron 2,4.

Em comparação com as técnicas de imagem convencionais, a microscopia óptica não linear oferece várias vantagens para sondar células vivas e AuNPs: a microscopia óptica não linear atinge uma profundidade de imagem mais profunda e fornece capacidade intrínseca de seccionamento óptico 3D com o uso de lasers ultrarrápidos de infravermelho próximo. Com a melhora significativa da velocidade de imagem e da sensibilidade de detecção, a fluorescência excitada de dois fótons (TPEF)5,6,7 e a microscopia de segunda geração harmônica (SHG)8,9,10 demonstraram melhorar ainda mais a imagem não invasiva de biomoléculas endógenas em células e tecidos vivos. Além disso, utilizando novas técnicas ópticas não lineares bomba-sonda, como a absorção transitória (AT)11,12,13,14 e o espalhamento Raman estimulado (SRS)15,16,17,18, é possível derivar o contraste bioquímico livre de rótulo de estruturas celulares e AuNPs. Visualizar AuNPs sem o uso de rótulos extrínsecos é de grande importância, uma vez que as perturbações químicas das nanopartículas modificarão suas propriedades físicas e, portanto, sua absorção nas células.

Este protocolo apresenta a implementação de um módulo Spectral Focusing Timing and Recombination Unit (SF-TRU) para um laser de pulso de comprimento de onda duplo, permitindo imagens multimodais rápidas de AuNPs e células cancerígenas. Este trabalho tem como objetivo demonstrar os detalhes das técnicas integradas de TPEF, TA e SRS em um microscópio de varredura a laser.

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Protocolo

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1. Ligar o sistema a laser

  1. Ligue o sistema de intertravamento e selecione o laser do braço antes de iniciar o sistema.
  2. Ligue o PC com o software para controlar o laser de femtossegundo de saída dupla.
  3. Carregue o software para o laser de femtossegundo de saída dupla; este software permite que o laser seja ligado e desligado e controla diretamente o comprimento de onda do feixe da bomba.
  4. Ative a emissão de laser mantendo pressionado o ícone Energia para uma contagem de 3.
  5. Espere até que o laser tenha aquecido e a luz pronta para laser esteja acesa em verde no software.
  6. O comprimento de onda do feixe da bomba é controlado diretamente através do software; isso pode variar de 680-1.300 nm. Para imagens celulares na região vibracional C-H Raman, selecione 802 nm.
  7. Abra as persianas do feixe da bomba ajustável e do feixe de Stokes de 1.045 nm, mantendo pressionadas as imagens de abertura por 3 s.
    CUIDADO: Orientação de segurança do laser O laser de femtossegundo de saída dupla é um laser pulsado infravermelho classe IV e pode causar danos permanentes à visão. Portanto, todas as regras locais de segurança do laser devem ser seguidas durante a realização deste procedimento: (i) Somente usuários autorizados que receberam treinamento de segurança a laser podem realizar o procedimento. (ii) A entrada no laboratório é feita através de acesso por cartão magnético com uma trava na porta da sala. (iii) Durante a maior parte da operação, os feixes de laser são totalmente fechados. (iv) Quando o feixe de laser é exposto, os óculos de segurança a laser devem ser usados (use os óculos de segurança a laser LG9, que dão bloqueio OD 7+ da bomba e dos feixes Stokes).

2. Ligar a Unidade de Temporização e Recombinação de Focagem Espectral (SF-TRU)

  1. Carregue o software ATM no mesmo PC com o software laser, que controla os estágios de atraso e atenuadores a laser na unidade SF-TRU.
    NOTA: Esta unidade é responsável por garantir que a bomba e os feixes de Stokes estejam espacialmente sobrepostos, controlando a dispersão na bomba e nos feixes de Stokes e controlando o atraso de tempo entre a bomba e os feixes de Stokes. A polarização dos feixes da bomba e de Stokes é vertical. Observe que cada feixe é equipado com uma placa de meia onda para controlar independentemente as polarizações antes de sair do SF-TRU.
  2. Certifique-se de que os lasers da bomba e de Stokes sejam atenuados para <10% (bomba) e <15% (feixes de Stokes). Se os feixes não forem atenuados, a potência do laser pode causar danos ao sistema e queimará amostras biológicas.
  3. Para imagens celulares, defina as configurações ideais do laser para 6% (bomba) e 10% (Stokes), correspondendo a 12 mW e 30 mW na amostra.
  4. O SF-TRU tem duas configurações: modo femtosegundo (fs) e modo picossegundo (ps).
  5. Para o modo fs, empurre os botões em ambos os lados da caixa (isso remove as grades de dispersão do caminho do feixe).
  6. Para o modo ps, puxe os botões de ambos os lados da caixa (isso coloca as grades de dispersão no caminho do feixe).
  7. Para imagens hiperespectrais, selecione o modo ps.
  8. Certifique-se de que o estágio de atraso esteja na posição correta para que a bomba e os feixes de Stokes sejam sobrepostos temporalmente para imagens C-H neste sistema.
  9. Certifique-se de que as configurações de dispersão da bomba e do feixe de Stokes estejam corretas; para uma bomba de 802 nm, isto é de 5 mm para o feixe da bomba e de 30 mm para o feixe de Stokes.

3. Modulando o feixe de Stokes para imagens SRS

  1. Para a detecção de SRS, module a intensidade do feixe de Stokes.
  2. Ligue o gerador de sinal para a modulação do feixe.
  3. Recupere as configurações anteriores, que são as seguintes:
    SAÍDA 1: Onda quadrada: Frequência = 19,5 MHz, Amplitude = 1,4 V.
    SAÍDA 2: Onda quadrada: Frequência = 19,5 MHz, Amplitude = 300 mV.
  4. Ative as saídas 1 e 2.
  5. Conecte a saída 1 a um amplificador para o EOM na caixa SF-TRU através de um cabo BNC.
  6. Conecte a saída 2 ao amplificador de bloqueio usado para detecção de SRS através de um cabo BNC.
  7. Ligue a fonte de alimentação do amplificador no pórtico.

4. Ligar o amplificador de bloqueio

  1. Para imagens SRS, use o módulo de detecção SRS que compreende um fotodiodo de grande área e um amplificador de bloqueio construído para esse fim.
  2. Ligue a fonte de alimentação para o amplificador de bloqueio no pórtico.
  3. Carregue o software para o amplificador de bloqueio "SRS detection Module" no PC.
  4. No software, foram escolhidas as seguintes configurações: Fase = 0°, Deslocamento = -80 mW, Ganho = 58 dB.
  5. Selecione a constante de tempo de integração do amplificador de bloqueio no software: para imagens celulares, a constante de tempo de 2 μs fornece imagens de boa qualidade.

5. Operando no microscópio de varredura a laser

  1. Ligue os plugues de todos os equipamentos, exceto a caixa de controle remoto. Aguarde até que o modo de espera esteja aceso na caixa de controle localizada na parte superior do pórtico.
  2. Ligue a caixa de controle remoto no pórtico e ligue a parte de trás da caixa. Aguarde até que a luz remota fique azul (na caixa de controle) e pressione Start Operation.
  3. Ligue o PC do microscópio de varredura a laser.
  4. Execute o software do microscópio confocal.
  5. Verifique o caminho da luz do microscópio através do software do computador.
    NOTA: Algumas modificações foram feitas no microscópio para torná-lo adequado para imagens SRS: (i) No caminho do feixe, uma passagem curta de 775 nm foi adicionada à roda de filtro onde os feixes de laser entram na unidade de varredura, isso pode ser selecionado na guia Lightpath no software do computador. (ii) Em vez de usar os PMTs embutidos do microscópio confocal para detecção, um detector sob medida foi adicionado ao caminho da luz transmitida, o que permite a detecção SRS e CARS. (iii) As saídas desses detectores são conectadas à caixa analógica no pórtico. O sinal CARS do PMT é conectado através de um cabo BNC ao CD1 e o sinal SRS do amplificador de bloqueio é conectado através de um cabo BNC ao CD2.
  6. Controle o foco através da tela sensível ao toque ou dos botões de controle remoto ou do software do computador.
  7. Selecione as configurações de imagem desejadas no software; isso inclui zoom, o tamanho da imagem em pixels e o tempo de permanência do pixel.
  8. Certifique-se de que a velocidade de imagem (tempo de permanência do pixel) seja maior do que o tempo de integração definido no software do amplificador de bloqueio.
    OBS.: FOI UTILIZADA UMA OBJETIVA DE IMERSÃO EM ÁGUA NA 1.2 para a imagem.

6. Montagem de uma amostra no estágio do microscópio

  1. Prepare as amostras de células para geração de imagens da seguinte maneira.
    1. Cultura de células de carcinoma mamário de camundongo 4T1 em RPMI-1640 suplementadas com 10% de soro fetal bovino (FBS). Mude o meio a cada 2 dias e passe as células em 70% a 80% de confluência.
      NOTA: As passagens 8–10 foram usadas ao longo dos experimentos descritos aqui.
    2. Para experimentos de imagem, incubar 1 x 10 5 células em coberturas quadradas por 24 h a 37 °C,5 % de CO2. Em seguida, lavar as células com solução salina pré-aquecida tamponada com fosfato (PBS) e incubar com nanopartículas de ouro (diluição 1:100 em meio de cultura celular, concentração de estoque: 2,3 x10 10 partículas/mL, diâmetro: 60 nm) por 4 h.
    3. Antes da imagem, lave as células com PBS gelado e fixe-as com paraformaldeído a 4% em PBS por 15 min à temperatura ambiente (RT). Lave as células com PBS 3x e, em seguida, monte entre duas folhas de cobertura para obter imagens.
  2. Coloque uma gota de água destilada em cima da objetiva de imersão em água que concentra os feixes de laser na amostra entre a objetiva e a amostra. Em seguida, coloque a amostra no estágio do microscópio.
  3. Um condensador com NA 1.4 recolhe a luz propagada para a frente. Aplique uma gota de água entre o condensador e a amostra para exames de imagem. Ajustar a altura do condensador para aproximadamente 1 mm acima da amostra para recolher a quantidade máxima de luz.
  4. O detector SRS está em uma montagem móvel, o que permite que ele seja deslizado para dentro e para fora da via óptica de coleta. Para se concentrar na amostra usando luz branca, mova o detector SRS para fora do caminho do feixe.
  5. Coloque o detector de volta no caminho do feixe, pronto para a imagem SRS.

7. Alterando o deslocamento Raman e coletando uma pilha de dados hiperespectral

NOTA: O deslocamento Raman no qual a imagem ocorre depende da posição do estágio de atraso na caixa SF-TRU e do comprimento de onda do feixe da bomba do sistema a laser.

  1. Para grandes mudanças no deslocamento Raman, altere o comprimento de onda do laser. Por exemplo, para a imagem de vibrações CH entre 2.800–3.100 cm-1, selecione 802 nm, enquanto, para a imagem de cerca de 1.600 cm-1 para o pico de amida I, selecione o feixe da bomba a 898 nm. Ajuste isso através do software.
  2. Para obter pequenos ajustes no turno Raman, verifique o estágio de atraso na unidade SF-TRU.
  3. O SF-TRU fornece posições de estágio de atraso em milímetros (mm). Para converter a posição do estágio de atraso de mm para cm-1, execute a varredura hiperespectral de calibração usando uma amostra de esferas de poliestireno e compare as posições de pico encontradas na varredura de calibração com aquelas tomadas em uma configuração Raman espontânea. Isso fornecerá uma equação linear, que converte a posição do estágio de atraso em mm para o deslocamento Raman em cm-1.
  4. Para gerar uma varredura hiperespectral, faça uma série temporal de imagens em diferentes posições de estágio de atraso.
  5. Para sincronizar a aquisição de imagem e o movimento do estágio de atraso, use a unidade analógica para enviar e receber sinais TTL de e para o sistema SF-TRU.
    NOTA: Para fazer isso, a caixa analógica tem as seguintes conexões: (i) TRIG OUT VD1—isso é conectado ao SF-TRU através de um BNC e envia um sinal TTL para dizer ao estágio de atraso para mover o incremento +1. (ii) TRIG Em 1—aqui, um sinal é recebido via BNC quando o estágio de atraso termina seu movimento, e isso é usado para acionar a próxima imagem na série temporal.
  6. Para o conjunto de dados hiperespectrais, selecione as seguintes configurações no software de microscópio confocal:
    1. Na guia Acionador , selecione Iniciar pelo gatilho TTL (ON) e Trigger (cada quadro).
    2. Na guia Série , defina a série temporal ON e a série z OFF.
    3. Defina o número de quadros na série temporal para corresponder ao número de etapas no software ATM (101 etapas são usadas aqui).
  7. No software ATM, vá para a guia Executar .
    1. Defina as posições do estágio de atraso em milímetros para o início e a parada da varredura hiperespectral. Para a região de alto número de onda CH, use a posição inicial = 90,25 mm e a posição de parada = 92,25 mm.
    2. Certifique-se de que o número de passos corresponde ao número de quadros no software do microscópio confocal.
  8. Depois de verificar as configurações corretas, inicie a pilha hiperespectral no software do microscópio confocal primeiro. Vá para Adquirir e clique em Iniciar varredura. Em seguida, no software ATM, clique em Iniciar. Isso inicia a coleta de uma série de imagens, com aumentos incrementais na posição do estágio de atraso entre as posições de início e parada selecionadas.
  9. Exporte a série de imagens hiperespectrais como um arquivo de .tif de vários quadros e use um pacote de software adequado para realizar a calibração.
  10. Quando a calibração estiver concluída, use a equação de calibração linear para converter a posição do estágio de atraso para os deslocamentos Raman.
  11. Para alternar entre a imagem na região vibracional CH (2.800–3.100 cm-1) para a região vibracional amida I 1.500–1.700 cm-1), faça o seguinte.
    1. Altere o comprimento de onda da bomba no software laser de 802 nm para 898 nm.
    2. Altere a configuração de dispersão de Stokes no software ATM de 30 mm para 5 mm.
    3. Faça um pequeno ajuste no espelho na via de dispersão do feixe da bomba dentro da caixa SF-TRU. Isso é feito ajustando o botão inferior no suporte do espelho, o que altera o ângulo do espelho em uma quantidade incremental.
    4. Ao executar uma varredura hiperespectral sobre a região amida I, defina as posições de início e parada no software ATM para 89 e 91mm, respectivamente
      CUIDADO: Óculos de segurança a laser devem ser usados para esta etapa, pois o feixe de laser será exposto.

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Resultados

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O módulo Spectral Focusing Timing and Recombination Unit (SF-TRU) é introduzido entre o laser de femtossegundo de saída dupla e o microscópio de varredura a laser modificado. O sistema de laser ultrarrápido ajustável usado neste estudo tem duas portas de saída que fornecem um feixe a um comprimento de onda fixo de 1.045 nm e o outro feixe ajustável na faixa de 680-1.300 nm. Um esquema detalhado do módulo SF-TRU e da plataforma de imagem multimodal é representado na Figura 1. O SF-TRU é empre...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo apresentou a combinação do módulo SF-TRU e do sistema laser ultrarrápido de saída dupla demonstrando suas aplicações para microespectroscopia multimodal. Com sua capacidade de investigar a absorção de nanopartículas de ouro (AuNPs) por células cancerígenas, a plataforma de imagem multimodal pode visualizar as respostas celulares a tratamentos de câncer hipertérmico quando os feixes de laser são absorvidos por AuNPs.

Além disso, imagens quimicamente específicas rápidas e alta resolu...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta pesquisa foi apoiada pelo EPSRC Grants: Raman Nanotheranostics (EP/R020965/1) e CONTRAST facility (EP/S009957/1).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Unidade de Detecção APE SRSAPE (Angewandte Physik & Elektronik GmbH)APELock-in ModuleSistema combinado contendo um fotodiodo Si de grande área para detectar o feixe da bomba junto com um amplificador Lock-In para detectar as modulações do feixe
Unidade de varredura confocalOlympusFV 3000Unidade de varredura confocal usada para imagens
CML Latex Beads, 4% w/v, 1.0 µ mInvitrogenC37483Microesferas de poliestireno
LamínulasThorlabsCG15CH2lamínulas de 22 mm x 22 mm para semear células
FBSGibco10500-064Soro Fetal Bovino (Inativado pelo Calor)
FlouviewOlympusFV31S-SWSoftware de controle de microscópio de varredura a laser
Gerador de funçãoBX precision40543Usado para gerar a função de onda quadrada que é alimentada ao EOM em SF-TRU para produzir modulações no feixe de stokes
Nanopartículas de ouroNanopartzA11-60Nanopartículas esféricas de ouro, 60 nm de diâmetro
Interface de entrada e saídaOlympusFV30 ANALOGEsta unidade permite que as leituras de tensão de PMT e LockIn sejam alimentadas no software de varredura confocal e permite que pulsos de temporização sejam enviados entre o microscópio olympus e o SF-TRU unidade.
InSight X3NewportSpectra-PhysicsLaser pulsado de femtossegundo de saída dupla. Ajustável (680– 1300 nm) e fixas (1045 nm) com taxa de repetição de 80 MHz.
Estrutura do microscópioOlympusIX83Microscópio invertido
Mouse 4T1 célulasATCCCRL-2539Células de câncer de mama de camundongo
NA 1.2 Objetiva de imersão em águaOlympusUPLSAPO60XW/IRA objetiva multifotônica 60x tem uma distância de trabalho de 0,28 mm. Outros objetivos semelhantes podem ser usados.
NA 1.4 CondensadorNikonCSC1003Também podem ser utilizados outros condensadores com NA superior ao objectivo de excitação.
PMTHamamatsuR3896PMT usado para detectar fotos anti-stokes para microscopia CARS
Conector PMTConector HamamatsuC13654-01-Y002
fonte de alimentaçãoPMTRSP RSPD-3303 Cfonte de alimentação programável, que é usada para fornecer a tensão correta para o PMT
RPMI-1640GibcoA10491-01Desde então, o Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium foi considerado adequado para uma variedade de células de mamíferos.
SF-TRUNewport Spectra PhysicsSistema SF-TRUprojetado para controlar o atraso de tempo e a dispersão das 2 saídas de laser e para realizar as modulações de feixe necessárias para SRS
para : ,

Referências

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Gold NanoparticlesNonlinear Optical MicroscopyStimulated Raman ScatteringTwo Photon FluorescenceTransient AbsorptionMultimodal ImagingCancer CellsCellular UptakeHyperspectral ImagingMolecular Imaging

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