Aplicação de interferência de RNA no Nematode pinewood, Bursaphelenchus xylophilus

Xiaofang Liu; Xiang Zhou; Lifeng Zhou; Jiafu Hu; Kai Guo

doi:10.3791/63645

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Artigo de método

Aplicação de interferência de RNA no Nematode pinewood, Bursaphelenchus xylophilus

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DOI:

10.3791/63645

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9 de março de 2022

Xiaofang Liu¹ , Xiang Zhou¹ , Lifeng Zhou¹ , Jiafu Hu¹ , Kai Guo¹

¹College of Forestry and Biotechnology, Zhejiang Agricultural & Forestry University

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Resumo

Aqui, introduzimos um método de imersão detalhado da interferência de RNA em Bursaphelenchus xylophilus para facilitar o estudo das funções genéticas.

Resumo

O nematode de pinheiro, Bursaphelenchus xylophilus, é uma das espécies invasoras mais destrutivas do mundo, causando a murcha e eventual morte de pinheiros. Apesar do reconhecimento de sua significância econômica e ambiental, até agora tem sido impossível estudar as funções genéticas detalhadas dos nematoides parasiticos vegetais (PPNs) utilizando genética convencional para a frente e métodos transgênicos. No entanto, como uma tecnologia genética reversa, a interferência de RNA (RNAi) facilita o estudo dos genes funcionais de nematoides, incluindo B. xylophilus.

Este artigo descreve um novo protocolo para RNAi do gene ppm-1 em B. xylophilus, que tem sido relatado para desempenhar papéis cruciais no desenvolvimento e reprodução de outros nematoides patogênicos. Para o RNAi, o promotor T7 foi ligado ao 5′-terminal do fragmento alvo por reação em cadeia de polimerase (PCR), e o RNA de dupla cadeia (dsRNA) foi sintetizado por transcrição in vitro . Posteriormente, a entrega de dsRNA foi realizada absorvendo os nematoides em uma solução dsRNA misturada com neuroestimulantes sintéticos. Os jovens sincronizados de B. xylophilus (aproximadamente 20.000 indivíduos) foram lavados e encharcados em dsRNA (0,8 μg/mL) no tampão de imersão por 24 h no escuro a 25 °C.

A mesma quantidade de nematoides foi colocada em um tampão de imersão sem dsRNA como controle. Enquanto isso, outra quantidade idêntica de nematoides foi colocada em um tampão de imersão com proteína fluorescente verde (gfp) gene dsRNA como controle. Após a imersão, o nível de expressão das transcrições de destino foi determinado por meio de PCR quantitativo em tempo real. Os efeitos da RNAi foram então confirmados utilizando-se observação microscópica dos fenótipos e comparação do tamanho do corpo dos adultos entre os grupos. O protocolo atual pode ajudar a avançar a pesquisa para entender melhor as funções dos genes de B. xilophilus e outros nematoides parasitas para o desenvolvimento de estratégias de controle através da engenharia genética.

Introdução

Os nematoides parasiticos vegetais (PPNs) são uma ameaça contínua à segurança alimentar e aos ecossistemas florestais. Eles causam cerca de 100 bilhões de USD em perdas econômicas a cada^{ano 1}, dos quais os mais problemáticos são principalmente nematoides de nó raiz, nematoides de cisto e nematoides de pinheiros. O nematoide de pinheiro, Bursaphelenchus xylophilus, é um nematoide migratório e endoparasitário, que é o patógeno causal da doença^de murchar pinheiro 2. Causou grandes danos às florestas de pinheiros em todo o mundo³. Usando a terminologia de Van Megen et ^al.4