O presente protocolo descreve a preparação da amostra e a análise de dados para quantificar a fosforilação proteica usando um ensaio de recuo de molécula única (SiMPull).
Artigo de método
O presente protocolo descreve a preparação da amostra e a análise de dados para quantificar a fosforilação proteica usando um ensaio de recuo de molécula única (SiMPull).
A fosforilação é uma modificação pós-transinal necessária que regula a função proteica e direciona os resultados da sinalização celular. Os métodos atuais para medir a fosforilação proteica não podem preservar a heterogeneidade na fosforilação entre proteínas individuais. O ensaio de tração única de moléculas (SiMPull) foi desenvolvido para investigar a composição de complexos macromoleculares através da imunoprecipitação de proteínas em um deslizamento de vidro seguido de imagem de molécula única. A técnica atual é uma adaptação do SiMPull que fornece quantificação robusta do estado de fosforilação de receptores de membrana de comprimento total no nível de molécula única. A imagem de milhares de receptores individuais dessa forma permite quantificar padrões de fosforilação de proteínas. O presente protocolo detalha o procedimento SiMPull otimizado, desde a preparação da amostra até a imagem. A otimização dos protocolos de preparação de vidro e fixação de anticorpos melhora ainda mais a qualidade dos dados. O protocolo atual fornece código para a análise de dados de molécula única que calcula a fração de receptores fosforilados dentro de uma amostra. Enquanto este trabalho se concentra na fosforilação do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), o protocolo pode ser generalizado para outros receptores de membrana e moléculas de sinalização citostónica.
A sinalização associada à membrana é ajustada por uma combinação de ativação do receptor de membrana induzida por ligante e recrutamento de proteínas acessórias a jusante que propagam o sinal. A fosforilação das tyrosinas-chave nas caudas citoplasmáticas receptoras é fundamental para iniciar a formação de complexos de sinalização, ou signalossomos 1,2. Portanto, uma questão importante na biologia é como os padrões de fosforilação são criados e mantidos para recrutar parceiros de sinalização e ditar resultados celulares. Isso inclui compreender a heterogeneidade da fosforilação receptora, tanto em abundância qu....
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1. Preparação do deslizamento de cobertura
NOTA: Para esta etapa, é preciso usar equipamentos de proteção individual (EPI), que inclui uma camada dupla de luvas de nitrito, óculos de segurança ou escudo facial, e um jaleco.
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Um desenho animado retratando o processo SiMPull é mostrado na Figura 1A. As manchas são funcionalizadas usando NeutrAvidin como uma âncora para anticorpos anti-EGFR biotinilados para capturar EGFR-GFP de lisatos totais de proteínas. Após a lavagem da proteína não ligada, os receptores fosforilalatados são rotulados com um anticorpo anti-fosfotyrosina (anti-PY)15. A Figura 1B mostra uma imagem da matriz hidrofóbica, onde várias amostras p.......
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O protocolo descrito aqui foi otimizado para permitir medições quantitativas de fosforilação receptora no nível único da proteína. Várias modificações simples, mas importantes no protocolo SiMPull foram desenvolvidas que melhoraram a confiabilidade da medição para detecção de fosfo-tyrosina, incluindo redução da autofluorescência com tratamento NaBH4 e pós-fixação da amostra para evitar a dissociação de anticorpos. O uso da máscara de canal verde para identificar os locais do receptor para o cálculo da colocal.......
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Os autores não têm nada a revelar.
Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde R35GM126934, R01AI153617 e R01CA248166 para DSL. A EMB foi apoiada através do programa ASERT-IRACDA (NIH K12GM088021) e jar pelo programa UNM MARC (NIH 2T34GM008751-20). Agradecemos o uso do recurso compartilhado de microscopia de fluorescência do Centro de Câncer Integral da Universidade do Novo México, apoiado pelo NIH P30CA118100. Queremos reconhecer os Drs. Ankur Jain e Taekijip Ha, cujo desenvolvimento original do SiMPull inspirou este trabalho.
ES-C apresentar endereço: Grupo de Imunodinâmica, Laboratório de Imunologia Integrativa do Câncer, Centro de Pesquisa do Câncer, Instituto Nacional de Cânce....
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL | MTC Bio | C2000 | |
| 10 mM Tris-HCl pH 7,4 | |||
| 10 mM Tris-HCl pH 8,0/ 50 mM NaCl | T50 Tampão | ||
| 100 mm Placa de cultura de tecidos | CELLTREAT | 229620 | Armazenamento de vidro/matrizes gravadas piranha |
| 15 mL tubo | |||
| 16% Paraformaldeído Aquoso Solução | Microscopia Eletrônica Sciences | 15710 | Tubo |
| cônico perigoso de 50 mL | Funcionalizado Armazenamento de vidro / reutilização de KOH | ||
| 50 mM Tris-HCl pH 7,2 / 150 mM NaCl | Componente tampão de lise | ||
| 60 mm Placa de cultura de tecidos | Corning | 430166 | |
| 8% Glutaraldeído Solução aquosa | Microscopia eletrônica Sciences | 16020 | |
| Acetona Perigosa (C3H6O) | Millipore Sigma | 270725 | Perigoso |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester | Thermo Fisher Scientific | A-20006 | |
| EGF Humano Recombinante Livre de Animais | Peprotech | AF-100-15 | |
| EGFR Anti-Humano (Domínio Externo) – Biotina | Leinco Technologies, Inc | E101 | |
| Anti-p-Tyr Anticorpo (PY99) Alexa Fluor 647 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7020 AF647 | |
| Bath-sonicator | Branson | 1200 | |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23227 | |
| Biotina-PEG | Laysan Bio | Biotina-PEG-SVA, MW 5.000 | |
| Albumina | de soro bovinoGold Biotechnology | A-420-1 | Tyrode's Buffer |
| Component Buchner funnel | |||
| Bunsen burner | |||
| Cloreto de cálcio (CaCl2) | Millipore Sigma | C4901 | Tyrode's Buffer |
| Component Cell Scraper | Bioworld | 30900017-1 | |
| Frasco de Filtragem Cônica | Fisher Scientific | S15464 | |
| Coplin Jar | WHEATON | 900470 | |
| Contador de Células Automatizado Countess II | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Coverslips 24 x 60 #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 63793 | |
| DipImage | https://diplib.org/ | ||
| DMEM | Caisson Labs | DML19-500 | |
| Câmera emCCD | Andor iXon | ||
| Fetal Bovine Serum, Optima | Bio-Techne | S12450H | |
| Fusion 360 inativado | Autodesk | ||
| Geneticin G418 Disulfato | Caisson Labs | G030-5GM | |
| Ácido acético glacial (CH3COOH) | JT Baker | JTB-9526-01 | perigoso |
| sorológicas de vidro | |||
| Glass Stir Rod | |||
| Glucose (D-(+)-Glucose) | Millipore Sigma | D9434 | Tyrode's Buffer |
| Component Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | 78446 | Lysis Buffer Component |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | TyrodeÁcido |
| clorídrico (HCl) | VWR | BDH7204-1 | Peróxido |
| de hidrogênio perigoso (H2O2) (3%) | HX0645 | ||
| Peróxido de hidrogênio (H2O2) (30%) | EMD Millipore | HX0635-2 | |
| Ice | |||
| IGEPAL CA-630 ( NP-40) | Sigma Aldrich | I8896 | Componente de tampão de lise |
| ImmEdge Caneta de barreira hidrofóbica | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Immersol 518F óleo de imersão | Zeiss | 444960-0000-000 | |
| linha | |||
| L-glutamina | Thermo Fisher Scientific | 25030-164 | |
| Cloreto de magnessium hexahidratado (MgCl2-6H2O) | MPBio | 2191421 | Tyrode's Buffer Component |
| Matlab | Mathworks | Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox e Statistics and Machine Learning toolbox | |
| Metanol (CH3OH) | IBIS Scientific | MX0486-1 | Água |
| Milli-Q | perigosa | ||
| Kits de rotulagem de anticorpos de corante CF Mix-n-Stain | Biotium | 92245 | Kit de conjugação sugerido |
| mPEG | Laysan Bio | mPEG-succinimidil valerato, MW 5.000 | |
| N- (2-aminoetil) -3-aminopropiltrimetoxissilano | UCT United Chemical | A0700 | Nanogrid |
| Perigoso Miraloma Tech | |||
| NeutrAvidin Biotina Proteína de Ligação | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Nitrogênio (gás comprimido) | |||
| NVIDIA GPU com CUDA | Procure compatibilidade em https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html | ||
| Microscópio Olympus iX71 Filme | Olympus | ||
| Parafilm M | The Lab Depot | HS234526C | |
| PBS pH 7.4 | Caisson Labs | PBL06 | |
| PC-200 Placa Quente Analógica | Corning | 6795-200 | |
| Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-163 | |
| Receptor Fosfo-EGF (Tyr1068) (1H12) Tecnologia | de Sinalização de Células | 2236BF | |
| Cloreto de Potássio (KCl) | Millipore Sigma | 529552 | Componente Tampão Tyrode |
| Hidróxido de Potássio (KOH) | Millipore Sigma | 1050330500 | Perigoso |
| Premium PLA Filament, 1,75 mm de diâmetro | Elevação 3D | PMS:2035U/RAL:3028 | Faixa de temperatura de impressão: 205-235 ° C |
| Pro2 Impressora 3D | Raise 3D | ||
| Pyrex 1 L copo | |||
| PYREX 100 mL garrafas de armazenamento | Corning | 1395-100 | CH3OH/C3H6O reutilização |
| Pyrex 250 mL béqueres | |||
| Pyrex 4 L Quad-view | |||
| Imagem Splitter | Photometrics | Modelo QV2 | |
| Centrífuga refrigerada | Eppendorf | EP-5415R | |
| RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting Slides | VWR | 10027-446 | |
| Filtros de emissão Semrock: azul (445/45 nm), verde (525/45 nm), vermelho (600/37 nm), vermelho distante (685/40 nm) | Semrock | LF405/488/561/635-4X4M-B-000 | |
| Controlador de pipeta sorológica | |||
| Pipetas | |||
| sorológicas atingem o pacote | https://github.com/LidkeLab/smite.git | ||
| Bicarbonato de Sódio (NaHCO3) | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Borohidreto de Sódio Perigoso (NaBH4) | Millipore Sigma | 452874 | Tyrode' s Componente tampão |
| Cloreto de sódio (NaCl) | Millipore Sigma | S9625 | Ativar por ciclo sucessivo de calor e pH |
| Hidróxido de sódio | VWR | BDH3247-1 | |
| Ortovanadato de sódio (Na3VO4) | Millipore Sigma | S6508 | |
| Ácido sulfúrico perigoso (H2SO4) | Microesferas | TetraSpeck Perigosas | 258105 |
| Thermo Fisher Scientific | T7279 | multifluorescentes | |
| base Tris (Trizma) | Millipore Sigma | T1503 | |
| Mancha azul de tripano, 0,4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Tripsina-EDTA 0,05% | Thermo Fisher Scientific | 25300120 |
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