Method Article

Um ensaio de recuo de molécula única otimizado para quantificação da fosforilação de proteínas

DOI:

10.3791/63665

⸱

June 6th, 2022

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1Department of Pathology, University of New Mexico School of Medicine, 2Department of Physics and Astronomy, University of New Mexico, 3Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O presente protocolo descreve a preparação da amostra e a análise de dados para quantificar a fosforilação proteica usando um ensaio de recuo de molécula única (SiMPull).

Abstract

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A fosforilação é uma modificação pós-transinal necessária que regula a função proteica e direciona os resultados da sinalização celular. Os métodos atuais para medir a fosforilação proteica não podem preservar a heterogeneidade na fosforilação entre proteínas individuais. O ensaio de tração única de moléculas (SiMPull) foi desenvolvido para investigar a composição de complexos macromoleculares através da imunoprecipitação de proteínas em um deslizamento de vidro seguido de imagem de molécula única. A técnica atual é uma adaptação do SiMPull que fornece quantificação robusta do estado de fosforilação de receptores de membrana de comprimento total no nível de molécula única. A imagem de milhares de receptores individuais dessa forma permite quantificar padrões de fosforilação de proteínas. O presente protocolo detalha o procedimento SiMPull otimizado, desde a preparação da amostra até a imagem. A otimização dos protocolos de preparação de vidro e fixação de anticorpos melhora ainda mais a qualidade dos dados. O protocolo atual fornece código para a análise de dados de molécula única que calcula a fração de receptores fosforilados dentro de uma amostra. Enquanto este trabalho se concentra na fosforilação do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), o protocolo pode ser generalizado para outros receptores de membrana e moléculas de sinalização citostónica.

Introduction

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A sinalização associada à membrana é ajustada por uma combinação de ativação do receptor de membrana induzida por ligante e recrutamento de proteínas acessórias a jusante que propagam o sinal. A fosforilação das tyrosinas-chave nas caudas citoplasmáticas receptoras é fundamental para iniciar a formação de complexos de sinalização, ou signalossomos 1,2. Portanto, uma questão importante na biologia é como os padrões de fosforilação são criados e mantidos para recrutar parceiros de sinalização e ditar resultados celulares. Isso inclui compreender a heterogeneidade da fosforilação receptora, tanto em abundância qu....

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Protocol

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1. Preparação do deslizamento de cobertura

NOTA: Para esta etapa, é preciso usar equipamentos de proteção individual (EPI), que inclui uma camada dupla de luvas de nitrito, óculos de segurança ou escudo facial, e um jaleco.

  1. Realize a gravura de piranha para remover detritos orgânicos do vidro.
    ATENÇÃO: A solução piranha é um agente oxidante forte que é corrosivo e altamente reativo quando em contato com materiais orgânicos. A reação com detritos orgânicos é exotérmica e potencialmente explosiva. Assim, o procedimento deve ser realizado em um capô de fumaça química com a faixa abaixada. O vidro Pyrex é necessári....

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Results

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Um desenho animado retratando o processo SiMPull é mostrado na Figura 1A. As manchas são funcionalizadas usando NeutrAvidin como uma âncora para anticorpos anti-EGFR biotinilados para capturar EGFR-GFP de lisatos totais de proteínas. Após a lavagem da proteína não ligada, os receptores fosforilalatados são rotulados com um anticorpo anti-fosfotyrosina (anti-PY)15. A Figura 1B mostra uma imagem da matriz hidrofóbica, onde várias amostras p.......

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Discussion

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O protocolo descrito aqui foi otimizado para permitir medições quantitativas de fosforilação receptora no nível único da proteína. Várias modificações simples, mas importantes no protocolo SiMPull foram desenvolvidas que melhoraram a confiabilidade da medição para detecção de fosfo-tyrosina, incluindo redução da autofluorescência com tratamento NaBH4 e pós-fixação da amostra para evitar a dissociação de anticorpos. O uso da máscara de canal verde para identificar os locais do receptor para o cálculo da colocal.......

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Disclosures

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Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

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Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde R35GM126934, R01AI153617 e R01CA248166 para DSL. A EMB foi apoiada através do programa ASERT-IRACDA (NIH K12GM088021) e jar pelo programa UNM MARC (NIH 2T34GM008751-20). Agradecemos o uso do recurso compartilhado de microscopia de fluorescência do Centro de Câncer Integral da Universidade do Novo México, apoiado pelo NIH P30CA118100. Queremos reconhecer os Drs. Ankur Jain e Taekijip Ha, cujo desenvolvimento original do SiMPull inspirou este trabalho.
ES-C apresentar endereço: Grupo de Imunodinâmica, Laboratório de Imunologia Integrativa do Câncer, Centro de Pesquisa do Câncer, Instituto Nacional de Cânce....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mLMTC BioC2000
10 mM Tris-HCl pH 7,4
10 mM Tris-HCl pH 8,0/ 50 mM NaClT50 Tampão
100 mm Placa de cultura de tecidosCELLTREAT229620Armazenamento de vidro/matrizes gravadas piranha
15 mL tubo
16% Paraformaldeído Aquoso SoluçãoMicroscopia Eletrônica Sciences15710Tubo
cônico perigoso de 50 mLFuncionalizado Armazenamento de vidro / reutilização de KOH
50 mM Tris-HCl pH 7,2 / 150 mM NaClComponente tampão de lise
60 mm Placa de cultura de tecidosCorning430166
8% Glutaraldeído Solução aquosaMicroscopia eletrônica Sciences16020
Acetona Perigosa (C3H6O)Millipore Sigma270725Perigoso
Alexa Fluor 647 NHS EsterThermo Fisher ScientificA-20006
EGF Humano Recombinante Livre de AnimaisPeprotechAF-100-15
EGFR Anti-Humano (Domínio Externo) – BiotinaLeinco Technologies, IncE101
Anti-p-Tyr Anticorpo (PY99) Alexa Fluor 647Santa Cruz Biotechnologysc-7020 AF647
Bath-sonicatorBranson1200
BCA Protein Assay KitPierce23227
Biotina-PEGLaysan BioBiotina-PEG-SVA, MW 5.000
Albuminade soro bovinoGold BiotechnologyA-420-1Tyrode's Buffer
Component Buchner funnel
Bunsen burner
Cloreto de cálcio (CaCl2)Millipore SigmaC4901Tyrode's Buffer
Component Cell ScraperBioworld30900017-1
Frasco de Filtragem CônicaFisher ScientificS15464
Coplin JarWHEATON900470
Contador de Células Automatizado Countess IIThermo Fisher ScientificAMQAX1000
Coverslips 24 x 60 #1.5Electron Microscopy Sciences63793
DipImagehttps://diplib.org/
DMEMCaisson LabsDML19-500
Câmera emCCDAndor iXon
Fetal Bovine Serum, OptimaBio-TechneS12450H
Fusion 360 inativadoAutodesk
Geneticin G418 DisulfatoCaisson LabsG030-5GM
Ácido acético glacial (CH3COOH)JT BakerJTB-9526-01perigoso
sorológicas de vidro
Glass Stir Rod
Glucose (D-(+)-Glucose)Millipore SigmaD9434Tyrode's Buffer
Component Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X)Thermo Fisher Scientific78446Lysis Buffer Component
HEPESMillipore SigmaH3375TyrodeÁcido
clorídrico (HCl)VWRBDH7204-1Peróxido
de hidrogênio perigoso (H2O2) (3%)HX0645
Peróxido de hidrogênio (H2O2) (30%)EMD MilliporeHX0635-2
Ice
IGEPAL CA-630 ( NP-40)Sigma AldrichI8896Componente de tampão de lise
ImmEdge Caneta de barreira hidrofóbicaVector LaboratoriesH-4000
Immersol 518F óleo de imersãoZeiss444960-0000-000
linha
L-glutaminaThermo Fisher Scientific25030-164
Cloreto de magnessium hexahidratado (MgCl2-6H2O)MPBio2191421Tyrode's Buffer Component
MatlabMathworksCurve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox e Statistics and Machine Learning toolbox
Metanol (CH3OH)IBIS ScientificMX0486-1Água
Milli-Qperigosa
Kits de rotulagem de anticorpos de corante CF Mix-n-StainBiotium92245Kit de conjugação sugerido
mPEGLaysan BiomPEG-succinimidil valerato, MW 5.000
N- (2-aminoetil) -3-aminopropiltrimetoxissilanoUCT United ChemicalA0700Nanogrid
Perigoso Miraloma Tech
NeutrAvidin Biotina Proteína de LigaçãoThermo Fisher Scientific31000
Nitrogênio (gás comprimido)
NVIDIA GPU com CUDAProcure compatibilidade em https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html
Microscópio Olympus iX71 FilmeOlympus
Parafilm MThe Lab DepotHS234526C
PBS pH 7.4Caisson LabsPBL06
PC-200 Placa Quente AnalógicaCorning6795-200
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-163
Receptor Fosfo-EGF (Tyr1068) (1H12) Tecnologiade Sinalização de Células2236BF
Cloreto de Potássio (KCl)Millipore Sigma529552Componente Tampão Tyrode
Hidróxido de Potássio (KOH)Millipore Sigma1050330500Perigoso
Premium PLA Filament, 1,75 mm de diâmetroElevação 3DPMS:2035U/RAL:3028Faixa de temperatura de impressão: 205-235 ° C
Pro2 Impressora 3DRaise 3D
Pyrex 1 L copo
PYREX 100 mL garrafas de armazenamentoCorning1395-100CH3OH/C3H6O reutilização
Pyrex 250 mL béqueres
Pyrex 4 L Quad-view
Imagem SplitterPhotometricsModelo QV2
Centrífuga refrigeradaEppendorfEP-5415R
RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting SlidesVWR10027-446
Filtros de emissão Semrock: azul (445/45 nm), verde (525/45 nm), vermelho (600/37 nm), vermelho distante (685/40 nm)SemrockLF405/488/561/635-4X4M-B-000
Controlador de pipeta sorológica
Pipetas
sorológicas atingem o pacotehttps://github.com/LidkeLab/smite.git
Bicarbonato de Sódio (NaHCO3)Sigma AldrichS6014
Borohidreto de Sódio Perigoso (NaBH4)Millipore Sigma452874Tyrode' s Componente tampão
Cloreto de sódio (NaCl)Millipore SigmaS9625Ativar por ciclo sucessivo de calor e pH
Hidróxido de sódioVWRBDH3247-1
Ortovanadato de sódio (Na3VO4)Millipore SigmaS6508
Ácido sulfúrico perigoso (H2SO4)MicroesferasTetraSpeck Perigosas258105
Thermo Fisher ScientificT7279multifluorescentes
base Tris (Trizma)Millipore SigmaT1503
Mancha azul de tripano, 0,4%Thermo Fisher Scientific15250061
Tripsina-EDTA 0,05%Thermo Fisher Scientific25300120
cônico por calor software Pipetas de vácuo interna de Vedação mAb de Camundongo de análise de molécula única Millipore Sigma

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  2. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006....

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Single Molecule Pull DownProtein PhosphorylationPhosphorylation QuantificationEGFR PhosphorylationImmunoprecipitation AssayAntibody LabelingGlass PreparationSingle Molecule ImagingColocalization AnalysisGaussian Localization

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