Sondando a mecânica do conjunto de miosina em feixes de filamentos de actina usando pinças ópticas

Resumo

A formação de feixes de actomiosina in vitro e a medição da geração de força do conjunto de miosina usando pinças ópticas são apresentadas e discutidas.

Resumo

As miosinas são proteínas motoras que hidrolisam o ATP para percorrer as trilhas do filamento de actina (FA) e são essenciais em processos celulares, como motilidade e contração muscular. Para entender seus mecanismos geradores de força, a miosina II tem sido investigada tanto no nível de molécula única (SM) quanto como equipes de motores in vitro usando métodos biofísicos, como armadilhas ópticas.

Esses estudos mostraram que o comportamento gerador de força da miosina pode diferir muito quando se move do nível de molécula única em um arranjo de três esferas para grupos de motores trabalhando juntos em um grânulo rígido ou superfície de deslizamento de cobertura em um arranjo de deslizamento. No entanto, essas construções de ensaio não permitem avaliar a dinâmica de grupo da miosina dentro da hierarquia estrutural viscoelástica como fariam dentro de uma célula. Desenvolvemos um método utilizando pinças ópticas para investigar a mecânica de geração de força por conjuntos de miosina interagindo com múltiplos filamentos de actina.

Esses feixes de actomiosina facilitam a investigação em um ambiente hierárquico e complacente que captura a comunicação motora e a saída de força do conjunto. A natureza personalizável do ensaio permite alterar as condições experimentais para entender como as modificações no conjunto de miosina, no feixe de filamentos de actina ou no ambiente circundante resultam em diferentes saídas de força.

Introdução

As proteínas motoras são essenciais à vida, convertendo energia química em trabalho mecânico ^1,2,3. Os motores de miosina interagem com os filamentos de actina dando passos ao longo dos filamentos semelhantes a uma trilha, e a dinâmica das redes de actina-miosina realiza a contração muscular, a motilidade celular, o anel contrátil durante a citocinese e o movimento de carga dentro da célula, entre outras tarefas essenciais 3,4,5,6,7,8

Protocolo

1. Folhas de cobertura de gravação

1. Dissolver 100 g de KOH em 300 mL de etanol a 100% em um copo de 1.000 mL. Mexa com uma barra de agitação até que a maioria do KOH tenha se dissolvido.
   CUIDADO: A solução concentrada de KOH pode causar queimaduras e danos à roupa. Use luvas, proteção para os olhos e um jaleco.
2. Coloque as tampas individualmente em racks de limpeza de tampas.
   NOTA: Os racks são projetados com fendas que mantêm as tampas simples espaçadas para permitir a gravação e o enxágue em cada face da tampa, os orifícios de drenagem no fundo e feitos de material que pode suportar as condições adversas de gravação. Eles pod....

Resultados

As células de fluxo que contêm os sistemas de feixe de actomiosina são de um projeto padrão, consistindo de uma lâmina de microscópio e uma lâmina de cobertura gravada separada por um canal feito de fita adesiva de dupla face (Figura 1). O ensaio é então construído a partir do deslizamento de cobertura usando introduções em estágios, conforme descrito no protocolo. O ensaio final consiste em filamentos de actina marcados com rodamina; a concentração de miosina desejada (1 μM foi utilizado pa.......

Discussão

Um estudo in vitro utilizando pinças ópticas combinadas com imagens de fluorescência foi realizado para investigar a dinâmica de conjuntos de miosina interagindo com filamentos de actina. Os feixes de actina-miosina-actina foram montados usando miosina muscular II, actina de rodamina na parte inferior do feixe e na superfície da lâmina de cobertura e filamentos de actina biotinilados marcados com 488 no topo do feixe. A proteína actina do músculo coelho foi polimerizada e estabilizada usando tampões gerais de ac.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Proteína de actina (biotina): músculo esquelético	Citoesqueleto	AB07-A	Proteína de actina biotinilada
Proteína de actina, músculo esquelético de coelho	Citoesqueleto	AKL99-A	Proteína de actina
Alexa Fluor 488 Faloidina	Invitrogen	A12379	Estabilizador de actina e coloração Alexa Fluor 488
ATP	Fisher scientific	BP413-25	Necessário para actina montagem e motilidade da miosina
Beta-D-glicose	Fisher	scientific MP218069110	Parte do sistema de eliminação de oxigênio usado para reduzir o fotobranqueamento durante a imagem de fluorescência
Bloqueador de grau de borrão (caseína)	Biorad	1706404	Usado para bloquear a superfície da ligação não específica
CaCl2	Fisher scientific	C79500	Cloreto de cálcio, fornece o controle necessário sobre a dinâmica da rede de actina miosina
Catalase	Fisher scientific	ICN10040280	Parte do sistema de eliminação de oxigênio usado para reduzir o fotobranqueamento durante a imagem de fluorescência
Coverslips	Fisher scientific	12544C	Usado para fazer células de fluxo
DTT	Fisher scientific	AC327190010	Usado para preparação
de tampãoEtanol	Fisher scientific	A4094	Regent usado para limpeza de lamínulas
Glicose oxidase	Fisher scientific	34-538-610KU	Parte do sistema de eliminação de oxigênio usado para reduzir o fotobranqueamento durante a imagem de fluorescência
KCl	Fisher scientific	P217-500	Usado para preparação de tampão
KOH	Fisher scientific	P250-1	Usado para gravar lamínulas e ajustar tampão pH
MgCl2	Fisher scientific	M33-500	Usado para preparação de tampão
Lâminas de microscópio	Fisher scientific	12-544-2	Usado para fazer células de fluxo
Proteína de miosina II: músculo esquelético de coelho	Citoesqueleto	MY02	Proteína motora de miosina de comprimento total isolada do músculo esquelético de coelho
Nanotracker2	Bruker/JPK	NT2	Instrumento de aprisionamento óptico
Poli-l-lisina	Sigma-Aldrich	P8920	Instalações adesão de filamentos de actina na superfície de vidro da lamínula
Citoesqueleto de faloidina de rodamina		PHDR1	Estabilizador de actina e corante fluorescente de rodamina
Grânulos de estreptavidina, 1 μ m	Spherotech	SVP-10-5	Alça de captura óptica
Tris-HCl	Fisher scientific	PR H5121	Usado para preparação de tampão