Microscopia Subcelular Intravital da Glândula Mamária

Yeap Ng; Andrius Masedunskas; Marco Heydecker; Seham Ebrahim; Roberto Weigert; Ian H. Mather

doi:10.3791/63674

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Artigo de método

Microscopia Subcelular Intravital da Glândula Mamária

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DOI:

10.3791/63674

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24 de junho de 2022

Yeap Ng¹ , Andrius Masedunskas¹^,² , Marco Heydecker¹ , Seham Ebrahim¹^,³ , Roberto Weigert¹ , Ian H. Mather¹

¹Laboratory of Cellular and Molecular Biology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, ²Charles Perkins Centre, Central Clinical School, Faculty of Medicine and Health, The University of Sydney, ³Department of Molecular Physiology and Biological Physics, School of Medicine, University of Virginia

Neste artigo

Resumo

O presente protocolo descreve uma técnica fácil para a imagem intravital da glândula mamária de camundongos lactantes por microscopia confocal e multifotônica de varredura a laser.

Resumo

A glândula mamária constitui um modelo por excelência para investigar funções epiteliais, incluindo remodelação tecidual, polaridade celular e mecanismos secretores. Durante a gravidez, a glândula se expande de uma árvore ductal primitiva embutida em uma almofada de gordura para uma rede alveolar altamente ramificada, preparada para a formação e secreção de colostro e leite. No pós-parto, a glândula fornece todos os nutrientes necessários para a sobrevivência neonatal, incluindo gotículas lipídicas revestidas por membrana (LDs), proteínas, carboidratos, íons e água. Vários componentes do leite, incluindo lactose, micelas de caseína e proteínas do leite desnatado, são sintetizados dentro das células alveolares e secretados das vesículas por exocitose na superfície apical. Os LDs são transportados de locais de síntese no retículo endoplasmático rugoso para o ápice celular, revestidos com membranas celulares e secretados por um mecanismo apócrino único. Outros constituintes pré-formados, incluindo anticorpos e hormônios, são transportados do lado seroso do epitélio para o leite por transcitose. Esses processos são passíveis de microscopia intravital porque a glândula mamária é uma glândula cutânea e, portanto, diretamente acessível à manipulação experimental. Neste artigo, um procedimento fácil é descrito para investigar a cinética da secreção de LD in situ, em tempo real, em camundongos vivos anestesiados. Boro-dipirrometeno (BODIPY) _665/676 ou monodansilpentano são usados para rotular a fração lipídica neutra de camundongos transgênicos, que expressam EGFP solúvel (proteína fluorescente verde aprimorada) no citoplasma ou um peptídeo direcionado à membrana fundido a EGFP ou tdTomato. As proteínas de fusão marcadas com membrana servem como marcadores de superfícies celulares, e os corantes lipídicos resolvem LDs ≥ 0,7 μm. As imagens de lapso de tempo podem ser gravadas por microscopia confocal de varredura a laser padrão até uma profundidade de 15-25 μm ou por microscopia multifotônica para imagens mais profundas no tecido. A glândula mamária pode ser banhada com agentes farmacológicos ou corantes fluorescentes durante toda a cirurgia, fornecendo uma plataforma para manipulações experimentais agudas, conforme necessário.

Introdução

A microscopia intravital da glândula mamária de camundongo está atraindo cada vez mais atenção como um método poderoso para analisar toda uma gama de fenômenos biológicos, incluindo a origem e diferenciação de células-tronco ^1,2, a progressão de tumores metastáticos ^3,4,5 e o papel dos macrófagos ductais ao longo do desenvolvimento e involução mamária⁶. Através do desenvolvimento da Microscopia Subcelular Intravital (ISMic)⁷, as investig....