Investigação da interação espacial entre astrócitos e neurônios em cérebros limpos

Resumo

A combinação de transdução vetorial viral e limpeza cerebral usando o método CLARITY permite a investigação de um grande número de neurônios e astrócitos simultaneamente.

Resumo

A combinação de transdução vetorial viral e limpeza tecidual usando o método CLARITY torna possível investigar simultaneamente vários tipos de células cerebrais e suas interações. A transdução vetorial viral permite a marcação de diversos tipos de células em diferentes cores de fluorescência dentro do mesmo tecido. As células podem ser identificadas geneticamente por atividade ou projeção. Usando um protocolo CLARITY modificado, o tamanho potencial da amostra de astrócitos e neurônios cresceu em 2-3 ordens de magnitude. O uso do CLARITY permite a imagem de astrócitos completos, que são muito grandes para caber em sua totalidade em fatias, e o exame do somata com todos os seus processos. Além disso, oferece a oportunidade de investigar a interação espacial entre astrócitos e diferentes tipos de células neuronais, ou seja, o número de neurônios piramihários em cada domínio astrócito ou a proximidade entre astrócitos e populações específicas de neurônios inibitórios. Este artigo descreve, em detalhes, como esses métodos devem ser aplicados.

Introdução

Nos últimos anos, o conhecimento da função astrócito e como eles interagem com circuitos neuronais aumentaram drasticamente. Os astrócitos podem influenciar a plasticidade ^1,2, auxiliar na recuperação neuronal da lesão^{pós-lesão 3,4}, e até induzir a potencialização neuronal de novo, com estudos recentes mostrando a importância dos astrócitos na aquisição e recompensa da memória, antes consideradas como funções puramente neuronais ^5,6,7 . Uma característica de particular interesse na pesquisa de astrócito é o arranjo espacial das células, que mantêm organizações espaciais únicas no hipocampo e outras estruturas cerebrais ^8,9,10. Ao contrário dos dendritos neuronais que se entrelaçam entre somata celular, os astrócitos hipocampais habitam territórios visualmente distinguíveis com ligeira sobreposição entre seus processos, criando domínios distintos 8,11,12,13. As evidências que sustentam a participação de astrócitos em circuitos neuronais não suportam a falta de descrição anatômica detalhada dessas populações e dos neurônios em seus domínios¹⁴.

Os procedimentos de transdução de vetores virais, juntamente com animais transgênicos (TG), têm sido popularizados como um acessório para investigar estruturas cerebrais, funções e interações celulares^15,16. A utilização de diferentes promotores permite o direcionamento de células específicas de acordo com suas propriedades genéticas, níveis de ativação^17,18 ou alvos de projeção. Diferentes vírus podem expressar diferentes fluoroforos coloridos em diferentes populações. Um vírus pode ser combinado com a expressão endógena de fluoroforos em TG, ou animais TG podem ser usados sem a necessidade de vírus. Essas técnicas são amplamente utilizadas para marcação neuronal, e alguns laboratórios começaram a usá-las com modificações especializadas para atingir outros tipos de células, como os astrócitos ^5,9,19.

A técnica CLARITY, descrita pela primeira vez em^{2013 20,21}, permite o estudo de fatias cerebrais grossas, tornando todo o cérebro transparente, deixando intactas as estruturas microscópicas. Combinando os dois métodos de transdução vetorial viral e limpeza tecidual- a opção de examinar as interações espaciais entre diferentes populações do tipo celular está agora disponível. A maioria dos estudos de interação astrócito-neurônio foram realizados em finas fatias cerebrais, resultando em imagens de astrócitos incompletos devido a seus grandes domínios, restringindo radicalmente o número de células analisadas. O uso da técnica CLARITY permite a caracterização de resolução unicelular de populações celulares em volumes em larga escala simultaneamente. Imagens fluorescentes marcadas populações de células em cérebros claros não fornecem resolução sináptica, mas permite uma caracterização completa das interações espaciais entre astrócitos e uma variedade de tipos de células neuronais.

Por essa razão, aproveitamos essas técnicas de última geração para investigar as propriedades dos astrócitos em todo o CA1 dorsal, imagens de toda lamina (Estrato Radiatum, camada piramimal e Stratum Oriens). Medimos dezenas de milhares de astrócitos (com penetração viral de >96%⁵), analisando assim as informações de toda a população astróctica em torno do CA1. Com penetração eficiente dos marcadores neuronais, pudemos registrar as interações entre toda a população de astrócitos ca1 e os quatro tipos de células neuronais-parvalbumina (PV), somatostatina (SST), neurônios inibitórios VIP e células piramipelais excitatórias⁹.

Vários experimentos foram realizados usando uma combinação de fluorescência de animais TG e vetores virais de cores diferentes (todas as células inibitórias), enquanto outros (excitatório) utilizaram dois vetores virais expressando fluoroforos diferentes sob diferentes promotores⁹. Este artigo apresenta um protocolo detalhado, incluindo a marcação das células desejadas no cérebro, tornando o cérebro transparente usando um procedimento de CLARIDADE modificado, bem como imagens e análises de estruturas cerebrais completas, utilizando vários procedimentos e softwares.

Protocolo

Os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Universidade Hebraica e atenderam às diretrizes do Guia Nacional de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Transdução de vetor viral

NOTA: A transdução vetorial viral é usada para expressar fluoroforos no cérebro.

1. Use um atlas (por exemplo, Allen Brain Atlas) para localizar a coordenação relevante da área alvo.
   NOTA: Atlases 3D podem ser encontrados online (por exemplo, http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer).
2. Usando cirurgia estereotática, injete os vetores virais na estrutura cerebral relevante. Consulte⁹ para um protocolo detalhado.
3. Espere 3-6 semanas para a expressão fluorófora.
   NOTA: Um curto período de tempo é suficiente se apenas corpos celulares precisarem ser marcados. Um longo período de tempo será necessário se as projeções axonais forem relevantes para a questão, pois leva mais tempo para os fluoroforos se expressarem em axônios, que podem ter vários milímetros de comprimento.
4. Validar a especificidade e penetração da expressão fluorófora (tanto de expressão viral quanto de animais TG) de antemão (Figura 1A). Antes de prosseguir com o procedimento CLARITY, designe pelo menos um cérebro para fatias finas e certifique-se de que a expressão fluorforeiro seja forte e específica para o recurso da célula alvo.

2. CLAREZA

NOTA: Este método torna o cérebro transparente dentro de 2-6 semanas.

1. Realizar perfusão transcranária em animais usando soro fisiológico frio (PBS), seguido por 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS. Remova o cérebro e mantenha-o em PFA durante a noite a 4 °C em um tubo de 50 mL ou um recipiente semelhante.
   NOTA: Antes da perfusão transcranária ser realizada, o animal deve ser profundamente anestesiado. Nos exemplos apresentados neste protocolo, todos os animais foram anestesiados usando cetamina e xylazina (90% e 10%, respectivamente).
2. Substitua a PFA por Hydrogel Solution (HS; consulte a tabela 1) por 48 h a 4 °C.
   NOTA: Não permita que os materiais fiquem mais quentes do que a temperatura de refrigeração (4-8 °C) nesta fase, ou o Hidrogel irá polimerizar. O HS usado neste protocolo contém 2% de acrilamida, ao contrário dos protocolos anteriores que sugerem 4%²² ou 1%¹⁷. O benefício de 2% está detalhado na seção de discussão. Ao preparar o HS, trabalhe em uma superfície gelada. Armazene-o a -20 °C.
3. Desgaseificação
   NOTA: O objetivo desta etapa é remover todo o oxigênio livre do tecido, pois O₂ interfere no processo de polimerização. Qualquer gás_não-2 pode ser usado (por exemplo, N₂, CO₂); N₂ é recomendado.
   1. Transfira o N₂ do tanque através de um tubo flexível de 5 mm (interno), conectado a uma agulha de 19 G na extremidade (Figura 1B).
   2. Faça dois pequenos furos (agulha-wide) na tampa do tubo: um para introduzir o gás e o outro para permitir que o ar saia do tubo (Figura 1C).
   3. Conecte o tubo do gás N₂ ao tubo e substitua os gases por aproximadamente 30 minutos à temperatura ambiente (RT).
   4. Remova o tubo e sele imediatamente os orifícios com argila modeladora em cada tubo (Figura 1D).
4. Transfira os tubos selados desgaseados para um banho de 37 °C por 3,5 h para polimerizar o HS, que se tornará um gel. Tenha cuidado para não agitar os tubos (Figura 1E).
5. Extrair o cérebro do tubo e remover suavemente o gel polimerizado ao seu redor usando lenços de laboratório. Certifique-se de que nenhum gel residual permaneça ligado à superfície do tecido, pois pode reagir com a solução nas etapas seguintes, inibindo o processo de limpeza tecidual (Figura 1F).
   NOTA: Como o gel continha PFA, a extração deve ser feita sob um capô de fumaça.
6. Corte o cérebro se a pergunta em questão exigir apenas uma parte dele. Divida-o ao meio ou em fatias muito grossas que contenham todas as áreas de interesse (Figura 1G).
7. Coloque as fatias na Primeira Solução de Compensação (CS1, veja Tabela 2) em um novo recipiente e agite a 70 rpm por 24h a 37 °C.
8. Siga os passos descritos abaixo para transferir o cérebro do CS1 para a segunda Solução de Compensação (CS2, ver Tabela 2).
   1. Prepare um tubo perfurado para o cérebro com antecedência (Figura 1H).
   2. Pré-aqueça CS2 a 40-45 °C em um béquer grande o suficiente para conter o tubo. Faça isso em uma placa quente com um agitador. Certifique-se de que a temperatura não chegue a 55 °C para evitar o branqueamento das proteínas expressas.
   3. Coloque o béquer cheio de CS2 e o tubo perfurado em um dispositivo de agitação (um béquer 2 L na Figura 1I). Defina uma taxa de agitação moderada que fará com que o líquido flua sem distorcer o tecido.
      NOTA: Dentro de 2-6 semanas, o tecido se tornará transparente (o processo começa na periferia e se move para dentro em direção às estruturas cerebrais centrais). A decisão sobre quando o tecido é "claro o suficiente" cabe ao julgamento pessoal. O cérebro deve ser suficientemente transparente para imagens sob o microscópio sem interferência (Figura 1J não clara o suficiente; Figura 1K clara o suficiente). Superar o ponto em que o tecido é claro o suficiente pode causar perda de rigidez tecidual.
9. Transfira de CS2 para PBST (0,5% Triton X-100 em PBS, consulte Tabela 2) em um novo recipiente a 37 °C com leve agitação (70 rpm) por 24 h.
   NOTA: No PBST, o tecido ficará esbranquiçado (Figura 1L). A clareza retornará (e melhorará) quando incorporada na Solução de Correspondência de Índices Refrativos (RIMS, ver etapa 2.14).
10. Substitua o PBST pelo novo PBST. Mantenha-se sob as mesmas condições (37 °C com leve agitação) por mais 24 horas.
11. Substitua o PBST novamente pelo novo PBST e mantenha-se no RT por 24 h.
12. Transfira para PBS na RT por 24 h.
13. Substitua o PBS e deixe em RT por mais 24 h.
14. Remova o cérebro da PBS e transfira-o para RIMS a 37 °C durante a noite.
    NOTA: Inicialmente, ondulações nas RIMS podem cercar o cérebro. Este protocolo foi projetado e validado utilizando dois RIMS comerciais específicos (ver Tabela 3). No entanto, o protocolo não deve diferir ao usar outros RIMS (comercial ou auto-fabricado).
15. Mantenha o tecido em RT por mais 24h ou até que a solução atinja o equilíbrio total, ou seja, quando o tecido se tornar transparente, e a solução não contiver mais nenhuma ondulação visível (Figura 1M).
16. Se o tecido for transparente, vá para a preparação da câmara. Se neste ponto, o tecido se torna branco em vez de transparente (devido a agregados de moléculas residuais de SDS), limpe a amostra novamente repetindo as etapas 2.9 e 2.10, e transfira o tecido para CS2 (etapa 2.8) por alguns dias, seguido por todas as etapas até o passo 2.15.

3. Preparação da câmara

NOTA: Cada amostra requer um slide com uma câmara de imagem na qual a amostra será colocada.

1. Coloque a amostra no meio do slide.
2. Usando uma pistola de cola quente, crie paredes nas bordas do escorregador, quase tão alto quanto o tecido. Certifique-se de deixar uma pequena lacuna (aproximadamente 5 mm) em um dos cantos (Figura 2A,B).
3. Aplique 1-2 gotas das RIMS na amostra para manter a superfície superior úmida e evitar que bolhas se formem entre a mancha de cobertura e o tecido.
4. Imediatamente após a aplicação das gotas rims, adicione a última camada de cola quente às paredes (de modo que atinjam a altura do cérebro/fatia) e progrida imediatamente (enquanto a cola quente ainda é líquida) para o passo 3.5.
5. Sele a parte superior com uma mancha de cobertura, colocando-a o mais uniformemente possível na parte superior da camada de cola quente ainda quente (Figura 2C).
6. Encha a câmara com as RIMS através da abertura deixada nas paredes de cola quente (Figura 2D,E).
7. Feche a lacuna com cola quente. Não deixe ar dentro (Figura 2F).
8. Se as paredes de cola quente se estenderem além das bordas do slide, corte as bordas de extensão (Figura 2G).
9. Se o objetivo utilizado para a imagem estiver imerso, adicione mais 2-3 mm de cola às paredes acima do deslizamento de cobertura para que a solução de imersão dure por um período mais longo (Figura 2H).

4. Imagem (confocal ou dois fótons)

1. Verifique se o palco pode segurar a câmara, pois a espessura da câmara pode atingir vários milímetros.
   NOTA: Por exemplo, o microscópio confocal (ver a Tabela de Materiais) utilizado neste protocolo é equipado com várias etapas (por exemplo, circular, retangular). Qualquer etapa escolhida para manter a câmara é irrelevante, desde que seus parâmetros se encaixem nos tamanhos da câmara.
2. Trabalhe com um objetivo com uma distância de trabalho suficiente, ou seja, uma distância mínima de trabalho ≥3 mm, pois a região de interesse cerebral pode ser de alguns milímetros de profundidade, e o deslizamento de cobertura pode não ser completamente reto como foi colocado manualmente.
   NOTA: Como demonstração, os resultados apresentados na Figura 1, Vídeo 1 e Vídeo 2 foram obtidos sob um microscópio de dois fótons usando um objetivo de imersão de água 16x com uma distância de trabalho de 3 mm e ampliação de 2,4 para obter um campo de visão de 652 x 483 μm e uma pilha z com intervalos de 0,937 μm entre os planos.
3. Realizar imagens de várias áreas, que podem levar algumas horas ou até dias. Certifique-se de que há um amplo armazenamento gratuito no computador, pois o tamanho de cada imagem pode atingir até dezenas de gigabits.
   NOTA: A imagem de CLAREZA pode resultar em seções de imagem significativamente mais profundas. Portanto, as intensidades utilizadas para capturar a expressão devem ser relativamente baixas para evitar a superexpressão durante a soma da imagem.
4. Para obter objetivos de imersão, verifique o líquido rotineiramente durante a imagem e suplemente com líquido adicional, se necessário.
   NOTA: Durante a imagem dos dados apresentados no Vídeo 3, a água foi adicionada à superfície da câmara a cada 6-8 h para combater a evaporação.
5. Depois que a imagem for adquirida, visualize-a e analise-a usando vários pacotes de software diferentes.
   NOTA: O software recomendado inclui Imaris e SyGlass para visualização e análise. O pipeline preciso para reconstrução otimizada de astrócitos usando o software Imaris foi descrito anteriormente⁹. Em suma, as características de Imaris utilizadas neste estudo foram Filamentos para reconstruir totalmente estruturas celulares e Manchas para extrair a posição no espaço de toda a somata.

Resultados

A limpeza bem sucedida de fatias de tecido cerebral espessa resulta em uma nova gama de perguntas que podem ser feitas sobre as propriedades de grandes populações celulares em oposição às propriedades de células únicas ou grupos vizinhos de células. Para alcançar resultados bem-sucedidos, deve-se aderir rigorosamente ao protocolo CLARITY, pois há uma ampla gama de parâmetros que precisam ser considerados para reduzir a variância entre as amostras (por exemplo, percentual de clareza, informações de fluorescência, parâmetr...

Discussão

Os métodos de limpeza de tecidos apresentam uma ferramenta revolucionária na pesquisa cerebral, convidando perguntas que não poderiam ter sido feitas anteriormente. A partir do direcionamento das propriedades de um pequeno grupo de células, uma única célula, ou mesmo uma única sinapse, a CLARITY agora permite o direcionamento de populações celulares totais ou recursos de conectividade de longo alcance usando fluoroforos relevantes.

O resultado da combinação de procedimentos fluorforhore e CLAR...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
AAV1-GFAP::TdTomato	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		vetor viral usado para detectar astrócitos
AAV5-CaMKII::eGFP	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		vetor viral usado para detectar neurônios
AAV5-CaMKII::H2B-eGFP	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		vetor viral usado para detectar núcleos neuronais
AAV5-CaMKII::TdTomato	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		vetor viral usado para detectar neurônios
Acrilamida (40%)	Bio-rad	#161-0140
Bisacrilamida (2%)	Bio-rad	#161-0142
Ácido bórico	Sigma	#B7901	Peso molecular - 61,83 g/mol
Microscópio confocal, varredura, FV1000	Olympus		4x objetiva (UPlanSApo, 0,16 NA)
Software	ImarisBitplane, Reino Unido		Um software que permite a análise 3D de imagens
NaOH	Sigma	#S5881
PBS
PFA 4%	EMS	#15710
RapiClear	SunJin lab	#RC147002
RapiClear CS	SunJin lab	#RCCS002
SDS	Sigma	#L3771
Software			Um software que permite a análise 3D de imagens usando realidade virtual
Tris base 1 M	Bio-rad	#002009239100	Peso molecular - 121,14 g/mol
Triton X-100	ChemCruz	#sc-29112A
Microscópio de dois fótons	Neurolabware		Ti:laser de safira (Chameleon Discovery TPC, Coherent), tubos fotomultiplicadores GaAsP (Hamamatsu, H10770-40), filtro passa-banda (Semrock), objetiva de imersão em água 16x (Nikon, 0.8 NA)
VA-044 Iniciador	Wako	#011-19365