A combinação de transdução vetorial viral e limpeza cerebral usando o método CLARITY permite a investigação de um grande número de neurônios e astrócitos simultaneamente.
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Artigo de método
Investigação da interação espacial entre astrócitos e neurônios em cérebros limpos
Neste artigo
Resumo
Resumo
A combinação de transdução vetorial viral e limpeza tecidual usando o método CLARITY torna possível investigar simultaneamente vários tipos de células cerebrais e suas interações. A transdução vetorial viral permite a marcação de diversos tipos de células em diferentes cores de fluorescência dentro do mesmo tecido. As células podem ser identificadas geneticamente por atividade ou projeção. Usando um protocolo CLARITY modificado, o tamanho potencial da amostra de astrócitos e neurônios cresceu em 2-3 ordens de magnitude. O uso do CLARITY permite a imagem de astrócitos completos, que são muito grandes para caber em sua totalidade em fatias, e o exame do somata com todos os seus processos. Além disso, oferece a oportunidade de investigar a interação espacial entre astrócitos e diferentes tipos de células neuronais, ou seja, o número de neurônios piramihários em cada domínio astrócito ou a proximidade entre astrócitos e populações específicas de neurônios inibitórios. Este artigo descreve, em detalhes, como esses métodos devem ser aplicados.
Introdução
Nos últimos anos, o conhecimento da função astrócito e como eles interagem com circuitos neuronais aumentaram drasticamente. Os astrócitos podem influenciar a plasticidade 1,2, auxiliar na recuperação neuronal da lesãopós-lesão 3,4, e até induzir a potencialização neuronal de novo, com estudos recentes mostrando a importância dos astrócitos na aquisição e recompensa da memória, antes consideradas como funções puramente neuronais 5,6,7 . Uma caracterís....
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Protocolo
Os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Universidade Hebraica e atenderam às diretrizes do Guia Nacional de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
1. Transdução de vetor viral
NOTA: A transdução vetorial viral é usada para expressar fluoroforos no cérebro.
- Use um atlas (por exemplo, Allen Brain Atlas) para localizar a coordenação relevante da área alvo.
NOTA: Atlases 3D podem ser encontrados online (por exemplo, http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer). - Usando cirurgia estereotática, injete os vetores virais ....
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Resultados
A limpeza bem sucedida de fatias de tecido cerebral espessa resulta em uma nova gama de perguntas que podem ser feitas sobre as propriedades de grandes populações celulares em oposição às propriedades de células únicas ou grupos vizinhos de células. Para alcançar resultados bem-sucedidos, deve-se aderir rigorosamente ao protocolo CLARITY, pois há uma ampla gama de parâmetros que precisam ser considerados para reduzir a variância entre as amostras (por exemplo, percentual de clareza, informações de fluorescência, parâmetr.......
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Discussão
Os métodos de limpeza de tecidos apresentam uma ferramenta revolucionária na pesquisa cerebral, convidando perguntas que não poderiam ter sido feitas anteriormente. A partir do direcionamento das propriedades de um pequeno grupo de células, uma única célula, ou mesmo uma única sinapse, a CLARITY agora permite o direcionamento de populações celulares totais ou recursos de conectividade de longo alcance usando fluoroforos relevantes.
O resultado da combinação de procedimentos fluorforhore e CLAR.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Agradecimentos
Este projeto recebeu financiamento do Conselho Europeu de Pesquisa (ERC) no âmbito do programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia (acordo de subvenção nº 803589), da Fundação Israelenta (isf grant nº 1815/18) e das bolsas Canadá-Israel (CIHR-ISF, conceder nº 2591/18). Agradecemos a Nechama Novick por comentar todo o manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| AAV1-GFAP::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | vetor viral usado para detectar astrócitos | |
| AAV5-CaMKII::eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | vetor viral usado para detectar neurônios | |
| AAV5-CaMKII::H2B-eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | vetor viral usado para detectar núcleos neuronais | |
| AAV5-CaMKII::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | vetor viral usado para detectar neurônios | |
| Acrilamida (40%) | Bio-rad | #161-0140 | |
| Bisacrilamida (2%) | Bio-rad | #161-0142 | |
| Ácido bórico | Sigma | #B7901 | Peso molecular - 61,83 g/mol |
| Microscópio confocal, varredura, FV1000 | Olympus | 4x objetiva (UPlanSApo, 0,16 NA) | |
| Software | ImarisBitplane, Reino Unido | Um software que permite a análise 3D de imagens | |
| NaOH | Sigma | #S5881 | |
| PBS | |||
| PFA 4% | EMS | #15710 | |
| RapiClear | SunJin lab | #RC147002 | |
| RapiClear CS | SunJin lab | #RCCS002 | |
| SDS | Sigma | #L3771 | |
| Software | Um software que permite a análise 3D de imagens usando realidade virtual | ||
| Tris base 1 M | Bio-rad | #002009239100 | Peso molecular - 121,14 g/mol |
| Triton X-100 | ChemCruz | #sc-29112A | |
| Microscópio de dois fótons | Neurolabware | Ti:laser de safira (Chameleon Discovery TPC, Coherent), tubos fotomultiplicadores GaAsP (Hamamatsu, H10770-40), filtro passa-banda (Semrock), objetiva de imersão em água 16x (Nikon, 0.8 NA) | |
| VA-044 Iniciador | Wako | #011-19365 |
Referências
- Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).
- Ciappelloni, S., et al. Aquaporin-4 sur....
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Reimpressões e permissões
