Summary
Kombination af viral vektortransduktion og hjernerydning ved hjælp af CLARITY-metoden muliggør undersøgelse af et stort antal neuroner og astrocytter samtidigt.
Abstract
Ved at kombinere viral vektortransduktion og vævsclearing ved hjælp af CLARITY-metoden er det muligt samtidig at undersøge flere typer hjerneceller og deres interaktioner. Viral vektortransduktion muliggør mærkning af forskellige celletyper i forskellige fluorescensfarver inden for det samme væv. Celler kan identificeres genetisk ved aktivitet eller projektion. Ved hjælp af en modificeret CLARITY-protokol er den potentielle prøvestørrelse af astrocytter og neuroner vokset med 2-3 størrelsesordener. Brugen af CLARITY gør det muligt at afbilde komplette astrocytter, som er for store til at passe i deres helhed i skiver, og undersøgelse af somata med alle deres processer. Derudover giver det mulighed for at undersøge den rumlige interaktion mellem astrocytter og forskellige neuronale celletyper, nemlig antallet af pyramidale neuroner i hvert astrocytisk domæne eller nærheden mellem astrocytter og specifikke hæmmende neuronpopulationer. Dette papir beskriver i detaljer, hvordan disse metoder skal anvendes.
Introduction
I de senere år er kendskabet til astrocytfunktion og hvordan de interagerer med neuronale kredsløb steget dramatisk. Astrocytter kan påvirke plasticitet 1,2, hjælpe med neuronal genopretning efter mened 3,4 og endda inducere de novo neuronal potensering, med nylige undersøgelser, der udviser astrocytternes betydning i hukommelseserhvervelse og belønning, tidligere betragtet som rent neuronale funktioner 5,6,7 . Et træk af særlig interesse for astrocytforskning er cellernes rumlige arrangement, som opretholder unikke rumlige organisationer i hippocampus og andre hjernestrukturer 8,9,10. I modsætning til de neuronale dendritter, der fletter sig ind mellem celle somata, beboer hippocampale astrocytter visuelt skelnelige territorier med let overlapning mellem deres processer, hvilket skaber forskellige domæner 8,11,12,13. Beviserne til støtte for astrocytters deltagelse i neuronale kredsløb understøtter ikke manglen på detaljeret anatomisk beskrivelse af sådanne populationer og neuronerne i deres domæner14.
Virale vektortransduktionsprocedurer sammen med transgene dyr (TG) er blevet populariseret som et værktøjssæt til at undersøge hjernestrukturer, funktioner og celleinteraktioner15,16. Udnyttelsen af forskellige promotorer tillader målretning af specifikke celler i henhold til deres genetiske egenskaber, aktiveringsniveauer17,18 eller projektionsmål. Forskellige vira kan udtrykke forskellige farvede fluoroforer i forskellige populationer. En virus kan kombineres med den endogene ekspression af fluoroforer i TG, eller TG-dyr kan anvendes uden behov for vira. Disse teknikker anvendes i vid udstrækning til neuronal mærkning, og nogle laboratorier er begyndt at bruge dem med modifikationer, der er specialiserede til at målrette mod andre celletyper, såsom astrocytter 5,9,19.
CLARITY-teknikken, der først blev beskrevet i 201320,21, gør det muligt at studere tykke hjerneskiver ved at gøre hele hjernen gennemsigtig, samtidig med at de mikroskopiske strukturer forbliver intakte. Ved at kombinere de to metoder - viral vektortransduktion og vævsclearing - er muligheden for at undersøge de rumlige interaktioner mellem forskellige celletypepopulationer nu tilgængelig. De fleste astrocyt-neuron-interaktionsundersøgelser blev udført på tynde hjerneskiver, hvilket resulterede i billeder af ufuldstændige astrocytter på grund af deres store domæner, hvilket radikalt begrænsede antallet af analyserede celler. Anvendelsen af CLARITY-teknikken muliggør karakterisering af enkeltcelleopløsning af cellepopulationer i store mængder samtidigt. Billeddannelse fluorescerende mærkede cellepopulationer i klare hjerner leverer ikke synaptisk opløsning, men tillader grundig karakterisering af de rumlige interaktioner mellem astrocytter og en række neuronale celletyper.
Af den grund udnyttede vi disse state-of-the-art teknikker til at undersøge astrocytternes egenskaber i hele den dorsale CA1 og afbilde alle lamina (Stratum Radiatum, pyramidelag og Stratum Oriens). Vi målte titusinder af astrocytter (med viral penetrans på >96%5) og analyserede derved informationen om hele den astrocytiske befolkning omkring CA1. Med effektiv penetrans af neuronale markører kunne vi registrere interaktionerne mellem hele populationen af CA1-astrocytter og de fire typer neuronale celler-parvalbumin (PV), somatostatin (SST), VIP-hæmmende neuroner og excitatoriske pyramideceller9.
Flere eksperimenter blev udført ved anvendelse af en kombination af fluorescens fra TG-dyr og forskelligt farvede virale vektorer (alle hæmmende celler), mens andre (excitatoriske) anvendte to virale vektorer, der udtrykte forskellige fluoroforer under forskellige promotorer9. Dette papir præsenterer en detaljeret protokol, herunder mærkning af de ønskede celler i hjernen, hvilket gør hjernen gennemsigtig ved hjælp af en modificeret CLARITY-procedure samt billeddannelse og analyse af komplette hjernestrukturer ved hjælp af forskellige procedurer og software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimentelle protokoller blev godkendt af Hebrew University Animal Care and Use Committee og opfyldte retningslinjerne fra National Institute of Health Guide for care and Use of Laboratory Animals.
1. Viral vektortransduktion
BEMÆRK: Viral vektortransduktion bruges til at udtrykke fluoroforer i hjernen.
- Brug et atlas (f.eks. Allen Brain Atlas) til at lokalisere den relevante koordinering af målområdet.
BEMÆRK: 3D-atlasser kan findes online (f.eks. http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer). - Ved hjælp af stereotaktisk kirurgi injiceres de virale vektorer i den relevante hjernestruktur. Se9 for en detaljeret protokol.
- Vent i 3-6 uger på fluoroforekspression.
BEMÆRK: En kort periode er nok, hvis kun cellelegemer skal markeres. En lang periode vil være nødvendig, hvis de aksonale fremspring er relevante for spørgsmålet, da det tager længere tid for fluoroforerne at udtrykke sig i axoner, som kan være flere millimeter lange. - Validere specificiteten og penetransen af fluoroforekspression (både af viral ekspression og TG-dyr) på forhånd (figur 1A). Før du fortsætter med CLARITY-proceduren, skal du udpege mindst en hjerne til tynde skiver og sørge for, at fluoroforekspressionen er både stærk og specifik for målcellefunktionen.
2. KLARHED
BEMÆRK: Denne metode gør hjernen gennemsigtig inden for 2-6 uger.
- Udfør transkraniel perfusion på dyr ved hjælp af koldt fosfatbufret saltvand (PBS) efterfulgt af 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS. Fjern hjernen og opbevar den i PFA natten over ved 4 °C i et 50 ml rør eller en lignende beholder.
BEMÆRK: Før transkraniel perfusion udføres, skal dyret være dybt bedøvende. I eksemplerne i denne protokol blev alle dyr anæstesiseret ved hjælp af ketamin og xylazin (henholdsvis 90% og 10%. - Pfa erstattes med hydrogelopløsning (HS; se tabel 1) i 48 timer ved 4 °C.
BEMÆRK: Lad ikke materialerne blive varmere end køletemperaturen (4-8 °C) på dette stadium, da hydrogelen ellers polymeriserer. HS, der anvendes i denne protokol, indeholder 2% acrylamid, i modsætning til tidligere protokoller, der tyder på 4% 22 eller 1%17. Fordelen ved 2% er beskrevet i diskussionsafsnittet. Når du forbereder HS, skal du arbejde på en iskold overflade. Opbevar den ved -20 °C. - Afgasning
BEMÆRK: Formålet med dette trin er at fjerne alt frit ilt fravævet, da O2 forstyrrer polymerisationsprocessen. Enhverikke-O2-gas kan anvendes (f.eks.N2, CO2); N2 anbefales.- Overfør N2 fra tanken via en 5 mm (intern) fleksibel slange, der er forbundet til en 19 G nål i enden (figur 1B).
- Lav to små huller (nålebred) i rørets hætte: det ene for at introducere gassen og det andet for at lade luften forlade røret (figur 1C).
- Fastgør røret fraN2-gassen til røret, og udskift gasserne i ca. 30 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Fjern røret, og forsegl straks hullerne med modellervoks på hvert rør (figur 1D).
- Overfør de afgassede forseglede rør til et bad på 37 °C i 3,5 timer for at polymerisere HS, som bliver til en gel. Pas på ikke at ryste rørene (figur 1E).
- Uddrag hjernen fra røret og fjern forsigtigt den polymeriserede gel fra omkring den ved hjælp af laboratorieservietter. Sørg for, at der ikke forbliver nogen resterende gel fastgjort til vævets overflade, da den kan reagere med opløsningen i de følgende trin, hvilket hæmmer vævsrensningsprocessen (figur 1F).
BEMÆRK: Fordi gelen indeholdt PFA, skulle udsugningen ske under en stinkhætte. - Skær hjernen i skiver, hvis det aktuelle spørgsmål kun kræver en del af det. Del det i halve eller i meget tykke skiver, der indeholder alle interesseområder (figur 1G).
- Skiverne anbringes i den første clearingopløsning (CS1, se tabel 2) i en ny beholder og rystes ved 70 o/min i 24 timer ved 37 °C.
- Følg nedenstående trin for at overføre hjernen fra CS1 til den anden clearingopløsning (CS2, se tabel 2).
- Forbered et perforeret rør til hjernen på forhånd (figur 1H).
- Forvarm CS2 til 40-45 °C i et bægerglas, der er stort nok til at indeholde røret. Gør dette på en kogeplade med en omrører. Sørg for, at temperaturen ikke når op på 55 °C for at forhindre blegning af de udtrykte proteiner.
- Bægerglasset fyldt med CS2 og det perforerede rør anbringes på en omrøringsanordning (et bægerglas på 2 L i figur 1I). Indstil en moderat omrøringshastighed, der får væsken til at strømme uden at forvrænge vævet.
BEMÆRK: Inden for 2-6 uger bliver vævet gennemsigtigt (processen starter i periferien og bevæger sig indad mod de centrale hjernestrukturer). Beslutningen om, hvornår vævet er "klart nok", er op til personlig vurdering. Hjernen skal være tilstrækkelig gennemsigtig til billeddannelse under mikroskopet uden interferens (figur 1J ikke klar nok; Figur 1K klar nok). At overgå det punkt, hvor vævet er klart nok, kan forårsage tab af vævsstivhed.
- Overførsel fra CS2 til PBST (0,5 % Triton X-100 i PBS, se tabel 2) i en ny beholder ved 37 °C med mild omrystning (70 o/min.) i 24 timer.
BEMÆRK: I PBST bliver vævet hvidligt (figur 1L). Klarheden vender tilbage (og forbedres), når den integreres i Refractive Index Matching Solution (RIMS, se trin 2.14). - Udskift PBST med ny PBST. Opbevares under de samme forhold (37 °C ved mild omrystelse) i yderligere 24 timer.
- Udskift PBST igen med ny PBST og hold den på RT i 24 timer.
- Overførsel til PBS på RT i 24 timer.
- Udskift PBS'en, og lad den stå ved RT i yderligere 24 timer.
- Fjern hjernen fra PBS og overfør den til RIMS ved 37 °C natten over.
BEMÆRK: I første omgang kan krusninger i RIMS omgive hjernen. Denne protokol blev designet og valideret ved hjælp af to specifikke kommercielle RIMS (jf . tabel 3). Protokollen bør dog ikke afvige, når du bruger andre RIMS (kommercielle eller selvfremstillede). - Hold vævet ved RT i yderligere 24 timer, eller indtil opløsningen når fuld ligevægt, dvs. når vævet bliver gennemsigtigt, og opløsningen ikke længere indeholder synlige krusninger (figur 1M).
- Hvis vævet er gennemsigtigt, fortsæt til kammerpræparatet. Hvis vævet på dette tidspunkt bliver hvidt i stedet for gennemsigtigt (på grund af aggregater af resterende SDS-molekyler), skal prøven rengøres igen ved at gentage trin 2.9 og 2.10 og overføre vævet til CS2 (trin 2.8) i et par dage efterfulgt af alle trin indtil trin 2.15.
3. Forberedelse af kammeret
BEMÆRK: Hver prøve kræver et dias med et billedkammer, hvor prøven placeres.
- Placer prøven midt på diaset.
- Brug en varm limpistol til at skabe vægge ved kanterne af diaset, næsten lige så højt som vævet. Sørg for at efterlade et lille mellemrum (ca. 5 mm) i et af hjørnerne (figur 2A,B).
- Påfør 1-2 dråber rims på prøven for at holde den øvre overflade fugtig og forhindre, at der dannes bobler mellem dækslippet og vævet.
- Umiddelbart efter påføring af RIMS-dråberne tilsættes det sidste lag varm lim til væggene (så de når højden af hjernen / skiven) og skrider straks frem (mens den varme lim stadig er flydende) til trin 3.5.
- Forsegl toppen med et dækslip, og placer det så jævnt som muligt på toppen af det stadig varme varme limlag (figur 2C).
- Fyld kammeret med RIMS gennem det mellemrum, der er tilbage i de varme limvægge (figur 2D,E).
- Luk hullet med varm lim. Efterlad ingen luft indeni (figur 2F).
- Hvis de varme limvægge strækker sig ud over diasets grænser, skal du skære de forlængende kanter (figur 2G).
- Hvis det mål, der anvendes til billeddannelse, er nedsænket, tilsættes yderligere 2-3 mm lim til væggene over dæksedlen, så nedsænkningsopløsningen holder i længere tid (figur 2H).
4. Billeddannelse (konfokal eller to-foton)
- Kontroller, om scenen kan holde kammeret, da kammerets tykkelse kan nå flere millimeter.
BEMÆRK: For eksempel er det konfokale mikroskop (se materialetabellen), der anvendes i denne protokol, udstyret med flere trin (f.eks. Cirkulært, rektangulært). Hvilket trin der vælges til at holde kammeret, er irrelevant, så længe dets parametre passer til kammerstørrelserne. - Arbejd med et mål med en tilstrækkelig arbejdsafstand, dvs. en minimal arbejdsafstand ≥3 mm, da hjerneområdet af interesse kan være et par millimeter i dybden, og dæksedlen muligvis ikke er helt lige, da den blev placeret manuelt.
BEMÆRK: Som en demonstration blev resultaterne præsenteret i figur 1, video 1 og video 2 opnået under et to-fotonmikroskop ved hjælp af et vandnedsænkning 16x mål med en 3 mm arbejdsafstand og forstørrelse på 2,4 for at opnå et synsfelt på 652 x 483 μm og en z-stak med 0,937 μm intervaller mellem flyene. - Udfør billeddannelse i flere områder, hvilket kan tage et par timer eller endda dage. Sørg for, at der er rigelig gratis lagerplads på computeren, da størrelsen på hvert billede kan nå op til snesevis af gigabit.
BEMÆRK: CLARITY-billeddannelse kan resultere i betydeligt flere billedsektioner i dybden. Derfor bør intensiteterne, der bruges til at fange udtrykket, være relativt lave for at forhindre overekspression under billedsummen. - For nedsænkningsmål skal du kontrollere væsken rutinemæssigt under billeddannelse og supplere med yderligere væske, hvis det er nødvendigt.
BEMÆRK: Under billeddannelsen af de data, der præsenteres i video 3, blev der tilsat vand til kammerets overflade hver 6-8 timer for at bekæmpe fordampning. - Når billedet er erhvervet, skal du se og analysere det ved hjælp af flere forskellige softwarepakker.
BEMÆRK: Anbefalet software inkluderer Imaris og SyGlass til både visualisering og analyse. Den præcise pipeline til optimeret rekonstruktion af astrocytter ved hjælp af Imaris software er tidligere beskrevet9. Kort sagt var Imaris-funktionerne, der blev brugt i denne undersøgelse, filamenter til fuldt ud at rekonstruere cellestrukturer og pletter til at udtrække positionen i rummet af alle somata.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket rydning af tykke hjernevævsskiver resulterer i en ny række spørgsmål, der kan stilles vedrørende egenskaberne hos store cellepopulationer i modsætning til egenskaberne af enkeltceller eller nabogrupper af celler. For at opnå vellykkede resultater bør man nøje overholde CLARITY-protokollen, da der er en lang række parametre, der skal overvejes for at reducere variansen mellem prøver (f.eks. Procentdel af klarhed, fluorescensinformation, hævedehedsparametre).
Figur 1 beskriver hele clearingprocessen fra validering af fluorescerende proteinekspression gennem alle faser af clearingmetoden. Figur 2 beskriver, hvordan man forbereder et kammer til det afklarede væv, optimalt til billeddannelse under et to-foton eller konfokalt mikroskop. De materialer, der kræves i denne protokol, er ekstremt billige i forhold til andre protokoller til kammerforberedelse.
Figur 3 viser terningen beskrevet i Video 1, hvor over 300 astrocytter er vist i et ryddet afsnit af CA1-delen af en museflodhestcampus. Figur 4 viser terningen beskrevet i video 2, hvor både astrocytter og excitatorisk neuronal somata er vist i tykt gennemsigtigt væv. Figur 5 viser en hel halvkugle, som beskrevet i video 3. Hjernedækkende neuronale fremskrivninger vises fra den dorsale CA1 (grøn, GFP) og den ventrale CA1 (rød, TdTomato).
Video 1 præsenterer et tykt billede af hippocampale astrocytter (>300) erhvervet med et to-fotonmikroskop efter en CLARITY-procedure. Fluorescens blev tilvejebragt ved viral vektortransduktion, der var specifik for astrocytter. Video 2 præsenterer den rumlige nærhed mellem astrocytter og kernerne i hippocampale pyramideceller. Video 3 sporer aksonale bundter over en hel halvkugle; axoner projicerer fra den primære motoriske cortex og spores tilbage fra rygmarven. Et andet bundt spores fra den dorsale hippocampus mod Supra Mammillary-kroppene. Endelig sporer den et rødt bundt axoner fra Mammillary-kroppene mod deres oprindelse ved den ventrale hippocampus. Alle markerede celler er udelukkende excitatoriske.
Figur 1: Detaljeret beskrivelse af clearingprocessen. (A) Validering af fluoroforekspression. I dette eksempel udtrykker alle astrocytter i CA1-delen af en musefloppocampus et rødt protein (TdTomato, afbildet i magenta), og alle excitatoriske neuroner udtrykker et grønt protein i deres kerner (H2B-GFP). Dette billede blev erhvervet ved hjælp af et 2-fotonmikroskop. Billedet blev taget ved hjælp af et vandnedsænkning 16x mål (0,8 NA) med forstørrelse på 2,4 for at opnå et 652 x 483 μm synsfelt, ved 15,5 billeder / s og en z-stak med 0,937 μm intervaller mellem planerne. Specificiteten og penetransen blev verificeret af immunohistokemi9. (B) Overførsel afN2-gassen fra tanken til røret, der holder hjernen, kræver et rør med en nål i enden. (C) Luft inde i røret erstattes medN2 ved at skabe to huller, et (øverste pil) til tilstrømning af N2via nålen, der er forbundet med rørene fra gastanken og et andet (nederste pil) til udstrømning. (D) Tildækning af hullerne med modellervoks umiddelbart efter afgasning forhindrerN2 i at forlade røret. E) Opvarmning af den afgassede opløsning i 3,5 timer i et varmt bad. (F) Vellykket polymerisation resulterer i en hjerne indlejret i geleret HS. Gasbobler kan være fanget i polymeren. (G) Umiddelbart efter ekstraktion fra gelen er det bedste punkt for hjernen at blive skåret i den ønskede tykkelse. (H) Perforerede rør gør det muligt for strømmen af opløsningen på omrøreren at nå prøven. (I) Hjerner inde i perforerede rør holdes lodret af en selvfremstillet holder af en størrelse, der er lavet til at passe til et 2 L bægerglas, der står på en kogepladeomrører. (J) Eksempel på en hjerne, der ikke er klar nok. Prøven skal omrøres i CS2 i ca. en uge mere. (K) Eksempel på en tilstrækkelig klar hjerne. (L) Når den klare hjerne indsættes i PBST, bliver vævet hvidere end før. Denne farveændring skyldes Triton og forsvinder, når den flyttes fra denne løsning til den næste. (M) Efter >24 timer i RIMS bliver hjernen helt gennemsigtig igen. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; NA = numerisk blænde; HS = hydrogelopløsning; CS2 = Clearingopløsning 2; PBST = Fosfatbufret saltvand indeholdende 0,5% Triton X-100; RIMS = Brydningsindeks matchende løsning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Kammerforberedelse. (A) Det første lag af varme limvægge dækker kanterne af et dias og efterlader et rum, der er bredt nok til at indeholde hjernen uden at røre ved væggene. Der er et hul tilbage i øverste venstre hjørne af diaset. (B) Tilsætning af lag efter lag for at nå vævets højde. (C) Lige dæksler (hvid pil) forsegler kammeret. (D) Kammer fyldt med RIMS gennem hullet i kammervæggene. (E) Kammeret er fyldt med RIMS og efterlader ingen luftbobler. (F) Forsegling af hullet i kammeret med varm lim for at forhindre lækage. Set fra siden. (G) På dette stadium skal enhver varm limrest, der strækker sig over gliderens kanter, afskæres fra kammeret. (H) Fuldt forberedt kammer, klar til billeddannelse under mikroskopet. Forkortelse: RIMS = Brydningsindeksmatchningsløsning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Alle afbildede astrocytter (AAV1-GFAP::TdTomato, rød) i en ryddet hippocampus. En enkelt ramme fra Video 1 , der fanger alle afbildede astrocytter (AAV1-GFAP::TdTomato, rød) i en ryddet hippocampus. Alle detaljer om billedegenskaberne er beskrevet under Video 1. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Astrocytter (AAV1-GFAP::TdTomato, rød) og hippocampale pyramidecellekerner (AAV5-CaMKII::H2B-eGFP, grøn) i tykt gennemsigtigt væv. En enkelt ramme fra Video 2 , der viser både astrocytter (AAV1-GFAP::TdTomato, rød) og hippocampale pyramidecellekerner (AAV5-CaMKII::H2B-eGFP, grøn) i tykt gennemsigtigt væv. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Grønne axoner (AAV5-CaMKII::eGFP, grøn) og røde axoner (AAV5-CaMKII::TdTomato). En enkelt ramme fra Video 3 , der viser begge typer axoner afledt fra flere steder i en musehjerne, der kan spores gennem en hel halvkugle. Klik her for at se en større version af denne figur.
Video 1: Optagelser af >1 mm tykke skive hippocampale dorsale CA1-astrocytter (AAV1-GFAP::TdTomato, rød). Videoen blev erhvervet med et to-fotonmikroskop ved hjælp af et 16x mål (0,8 NA) med forstørrelse på 2,4 efter en CLARITY-procedure. I lighed med figur 1A blev z-stack-intervallet sat til 0,937 μm. Fluorescens blev tilvejebragt ved viral vektortransduktion, der var specifik for astrocytter. Antallet af astrocytter i denne terning er >300, og de fleste processer er tilgængelige til analyse i de fleste celler. Forkortelser: NA = numerisk blænde; AAV = adeno-associeret virus; GFAP = glia fibrillært surt protein. Klik her for at downloade denne video.
Video 2: Astrocytter og excitatoriske neuroner kerner i en 3D-terning. Terningen indeholder alle lamina af dCA1 under de optiske betingelser, der er nævnt for figur 1A og Video 1. Denne terning udviser den rumlige nærhed mellem astrocytter (AAV1-GFAP::TdTomato, rød) og kernerne i hippocampale pyramideceller (AAV5-CaMKII::H2B-eGFP, grøn). Forkortelser: AAV = adeno-associeret virus; GFAP = glial fibrillært surt protein; CAMKII = calcium/calmodulinafhængig proteinkinase II; eGFP = forbedret grønt fluorescerende protein; H2B = histon 2B. Klik her for at downloade denne video.
Video 3: Sporing af aksonale bundter på tværs af en hel halvkugle. Grønne axoner (AAV5-CaMKII::eGFP, grøn), der slutter ved rygmarven, spores let tilbage til den primære motoriske cortex (mere end 7 mm fra hinanden). Fra hippocampus (dorsal side) spores et andet bundt mod Supra Mammillary-kroppene (den mest ventrale side af hjernen), et spor på næsten 3 mm langt. Anden halvdel af videoen sporer et rødt bundt axoner (AAV5-CaMKII::tdTomato), der stammer fra den ventrale hippocampus tilbage fra deres målplacering ved Mammillary-kroppene. Billedet blev taget under et Olympus scanning laser konfokalmikroskop FV1000 ved hjælp af et 4x mål (0,16 NA), og flere ROI'er blev kombineret ved hjælp af MATL FluoView-funktion til at præsentere hele halvkuglen. Forkortelser: AAV = adeno-associeret virus; CAMKII = calcium/calmodulinafhængig proteinkinase II; eGFP = forbedret grønt fluorescerende protein; NA = numerisk blænde; MATL = multiple area time-lapse. Klik her for at downloade denne video.
| Hydrogelopløsning (1 l) | |
| Materiale | Beløb |
| VA-044 Initiativtager | 2,5 g |
| PFA 4% | 900 ml |
| Acrylamid (40%) | 50 ml |
| Bisacrylamid (2%) | 50 ml |
Tabel 1: Fremstilling af hydrogelopløsning (1 L). Hydrogelopløsning skal fremstilles på en iskold overflade. Rækkefølgen, hvori ingredienserne blandes, er ikke vigtig. Bemærk, at den samlede procentdel af acrylamid er 2% i modsætning til lignende protokoller, der bruger enten 1%17 eller 4%22.
| Clearingløsninger (1 L) | ||
| Materiale | Beløb | |
| CS1 | CS2 | |
| Borsyre (M.W. = 61,83 g/mol) | 12.366 g | 3,4 g |
| SDS | 80 g | 80 g |
| Tris-base (M.W. = 121,14 g/mol) | 0 | 12,1 g |
| Destilleret vand (DW) | Fyld til 1 L | Fyld til 1 L |
| NaOH | pH 8,5 | |
| 1 liter fosfatbufret saltvand med 0,5% Triton X-100 | ||
| Materiale | Beløb | |
| PBS | 995 ml | |
| Triton X-100 | 5 ml | |
Tabel 2: Fremstilling af clearingopløsninger 1 og 2 (1 l) og 1 liter fosfatbufret saltvand med 0,5 % Triton X-100. Clearingopløsningerne kan forberedes på forhånd og opbevares ved stuetemperatur i lang tid. Enhver opløsning, der indeholder borsyre og SDS, skal håndteres under en stinkhætte for at undgå indånding eller hudkontakt med enten SDS eller borsyre. NaOH i CS1 skal tilføjes sidst for at indstille pH til 8,5. Hver hjerneprøve skal placeres i mindst 5-25 ml CS1 og opbevares natten over for tilstrækkelig diffusion. Forkortelser: CS1 = clearingopløsning 1; SDS = natriumdodecylsulfat; M.W. = molekylvægt.
| Produktets navn | Primær fordel | Primær ulempe |
| RapiClear | Prøven forbliver gennemsigtig | Væv hævelse |
| RapiClear CS | Prøven krymper tilbage til normal størrelse | Prøven kan miste gennemsigtigheden |
Tabel 3: RIMS muligheder med fordele og ulemper. Rapiclear (RC, RI = 1,47) eller CLARITY-specifik Rapiclear (CSRC, RI = 1,45). Den primære forskel mellem disse to løsninger er, at mens CSRC krymper den klare hjerne tilbage til sin oprindelige størrelse, gør RC-opløsningen det ikke, hvilket efterlader den ryddede prøve lidt hævet. Forkortelse: RI = brydningsindeks.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vævsrensningsmetoder præsenterer et revolutionerende værktøj inden for hjerneforskning, der inviterer til spørgsmål, der ikke tidligere kunne have været stillet. Fra at målrette mod egenskaberne for en lille gruppe celler, en enkelt celle eller endda en enkelt synaps muliggør CLARITY nu målretning af samlede cellepopulationer eller langtrækkende forbindelsesfunktioner ved hjælp af relevante fluoroforer.
Resultatet af kombinationen af fluoroforekspression og CLARITY-procedure er ikke binært; mange faktorer kan forstyrre proceduren, der fører til suboptimale resultater. For det første skal fluoroforekspressionen verificeres på forhånd. Da CLARITY-proceduren medfører et vist informationstab, er tilstrækkelig fluoroforproteinekspression afgørende for billedets gyldighed ved afslutningen af CLARITY-processen. For det andet skal den transkranielle perfusion håndteres omhyggeligt og sikre, at alt blod kommer ud af hjernen, fordi blodets autofluorescens vil føre til upålidelige data i tykke skiver. For det tredje skal alle parametre, der diskuteres i protokollen, håndteres i hvert trin i clearingprocessen med præcision, f.eks.O2-rester i HS, før polymerisation eller temperaturupræcision på hvert trin forhindrer den kemiske reaktion mellem de aktive materialer i at forekomme.
Tidligere protokoller17,22 anbefaler forskellige koncentrationer af acrylamid i HS. Det primære formål med acrylamid er at fiksere molekylerne bedre med aminrester (proteiner og nukleinsyrer). Små ændringer i koncentrationen påvirker i høj grad hele clearingprocessen: Hvis fikseringen er for kompakt, vil lipidmolekylerne ikke afbryde forbindelsen til vævet, og clearingprocessen vil blive unødigt langvarig eller resultere i uigennemsigtige hjerner. Lavere koncentrationer af acrylamid vil imidlertid ikke i tilstrækkelig grad opretholde hjernestrukturen, når den først er blottet for lipider. I denne protokol er acrylamidprocenten indstillet til at tilvejebringe den delikate balance mellem fikseret, men klart væv.
Det meste af clearingprocessen foregår i CS2, og vævets klarhedsniveau bør testes dagligt. PBST-oprydning er et vigtigt skridt mellem Clearing-løsningerne og brydningsindeksmatchningsløsningerne, fordi det renser de resterende SDS-molekyler, som kan interagere med RIMS. Det er også muligt at holde det klare væv i PBST (0,5%) på ubestemt tid, hvis kammerforberedelse endnu ikke er nødvendig.
Når man placerer hjernen i RIMS, bør man sætte sig ind i fordelene og begrænsningerne ved løsningerne. For eksempel vil RapiClear forårsage fuldstændig gennemsigtighed selv i næsten ryddet væv, men vil også forårsage en vis hævelse, som ikke bør overses, når man analyserer dataene. Tidligere målinger9 tyder på lige stor ekspansion langs alle akser (dvs. dorsoventrale, forreste-bageste og lateral-mediale akser), hvilket gør det muligt at beregne hævelsesindekset i sammenligning med tynde skiver fra samme hjerneområde. Brug af CLARITY-specific RapiClear eliminerer hævelsen; Men hvis der forbliver SDS-rester i vævet, vil de aggregeres i ikke-gennemsigtige masser.
En anden fordel ved denne ændrede protokol er dens omkostninger. Tidligere protokoller foreslår forskellige limtyper for at skabe et kammer, der kan holde hjernen i RIMS. I denne protokol bruger vi simpelthen varm lim. Det reagerer ikke med løsningerne, kan købes overalt, er let at bruge og er betydeligt billigere end de lim, der blev foreslået før.
Data erhvervet ved billeddannelse af tykke hjerneprøver kan beskrive hele cellepopulationer, forbindelse på tværs af hjernestrukturer eller sporing af en enkelt axon over store afstande (Video 3). Selvom spørgsmål vedrørende disse egenskaber er blevet stillet før, forbedrer gyldigheden af de data, der nu kan opnås ved hjælp af tykke hjerneskiver, i høj grad ved tidligere, fejlbehæftede metoder til tyndt udsnitsbilledoverlay.
CLARITY-processen giver en vellykket og ensartet rydning af tykke skiver - fra flere millimeter til fuld hjernebilleddannelse. Den passive clearing (dvs. ikke at bruge ETC) mindsker risikoen for skade på vævet og den tid, hvor prøverne nedsænkes i clearingopløsninger, så det ikke påvirker den høje effektivitet af proteinbevarelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Dette projekt har modtaget støtte fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC) under EU's Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogram (tilskudsaftale nr. 803589), Israel Science Foundation (ISF-bevilling nr. 1815/18) og Canada-Israel-bevillingerne (CIHR-ISF, bevilling nr. 2591/18). Vi takker Nechama Novick for at kommentere hele manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV1-GFAP::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect astrocytes | |
| AAV5-CaMKII::eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
| AAV5-CaMKII::H2B-eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neuronal nuclei | |
| AAV5-CaMKII::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
| Acrylamide (40%) | Bio-rad | #161-0140 | |
| Bisacrylamide (2%) | Bio-rad | #161-0142 | |
| Boric acid | Sigma | #B7901 | Molecular weight - 61.83 g/mol |
| Confocal microscope, scanning, FV1000 | Olympus | 4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA) | |
| Imaris software | Bitplane, UK | A software that allows 3D analysis of images | |
| NaOH | Sigma | #S5881 | |
| PBS | |||
| PFA 4% | EMS | #15710 | |
| RapiClear | SunJin lab | #RC147002 | |
| RapiClear CS | SunJin lab | #RCCS002 | |
| SDS | Sigma | #L3771 | |
| SyGlass software | A software that allows 3D analysis of images using virtual reality | ||
| Tris base 1 M | Bio-rad | #002009239100 | Molecular weight - 121.14 g/mol |
| Triton X-100 | ChemCruz | #sc-29112A | |
| Two photon microscope | Neurolabware | Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA) | |
| VA-044 Initiator | Wako | #011-19365 |
References
- Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).
- Ciappelloni, S., et al. Aquaporin-4 surface trafficking regulates astrocytic process motility and synaptic activity in health and autoimmune disease. Cell Reports. 27 (13), 3860-3872 (2019).
- Sylvain, N. J., et al. The effects of trifluoperazine on brain edema, aquaporin-4 expression and metabolic markers during the acute phase of stroke using photothrombotic mouse model. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1863 (5), 183573 (2021).
- Kitchen, P., et al. Targeting aquaporin-4 subcellular localization to treat central nervous system edema. Cell. 181 (4), 784-799 (2020).
- Adamsky, A., et al. Astrocytic activation generates de novo neuronal potentiation and memory enhancement. Cell. 174 (1), 59-71 (2018).
- Adamsky, A., Goshen, I. Astrocytes in memory function: pioneering findings and future directions. Neuroscience. 370, 14-26 (2018).
- Nagai, J., et al. Behaviorally consequential astrocytic regulation of neural circuits. Neuron. 109 (4), 576-596 (2021).
- Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
- Refaeli, R., et al. Features of hippocampal astrocytic domains and their spatial relation to excitatory and inhibitory neurons. Glia. 69 (10), 2378-2390 (2021).
- Eilam, R., Aharoni, R., Arnon, R., Malach, R. Astrocyte morphology is confined by cortical functional boundaries in mammals ranging from mice to human. eLife. 5, 15915 (2016).
- Bushong, E. A., Marton, M. E., Ellisman, M. H. Maturation of astrocyte morphology and the establishment of astrocyte domains during postnatal hippocampal development. International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 73-86 (2004).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus. Journal of Comparative Neurology. 462 (2), 241-251 (2003).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. The Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Chai, H., et al. Neural circuit-specialized astrocytes: transcriptomic, proteomic, morphological, and functional evidence. Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).
- Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).
- Hippenmeyer, S., et al. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biology. 3 (5), 159 (2005).
- Ye, L., et al. Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences. Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).
- DeNardo, L. A., et al. Temporal evolution of cortical ensembles promoting remote memory retrieval. Nature Neuroscience. 22 (3), 460-469 (2019).
- Srinivasan, R., et al. New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Ye, L., et al. Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences. Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
