Genética reversa para projetar variantes do vírus de RNA de sentido positivo

Resumo

O protocolo descreve um método para introduzir diversidade genética controlável no genoma do vírus da hepatite C combinando síntese completa de RNA mutante usando PCR propenso a erros e genética reversa. O método fornece um modelo para seleção de fenótipos e pode ser usado para genomas de vírus de RNA de sentido positivo de 10 kb longos.

Resumo

A falta de um método conveniente para a geração iterativa de diversas variantes virais de comprimento total tem impedido o estudo da evolução dirigida em vírus de RNA. Ao integrar uma PCR propensa a erros no genoma de RNA e genética reversa, a mutagênese de substituição aleatória do genoma pode ser induzida. Desenvolvemos um método usando esta técnica para sintetizar diversas bibliotecas para identificar mutantes virais com fenótipos de interesse. Esse método, chamado síntese completa de RNA mutante (FL-MRS), oferece as seguintes vantagens: (i) a capacidade de criar uma grande biblioteca por meio de uma PCR altamente eficiente e propensa a erros em uma etapa; (ii) a capacidade de criar grupos de bibliotecas com diferentes níveis de diversidade genética, manipulando a fidelidade da DNA polimerase; (iii) a criação de um produto de PCR completo que possa servir diretamente como um modelo para a síntese de RNA mutante; e (iv) a capacidade de criar RNA que pode ser entregue em células hospedeiras como um pool de entrada não selecionado para rastrear mutantes virais do fenótipo desejado. Descobrimos, usando uma abordagem de genética reversa, que a ERM-FL é uma ferramenta confiável para estudar a evolução dirigida por vírus em todos os estágios do ciclo de vida do vírus da hepatite C, isolado de JFH1. Esta técnica parece ser uma ferramenta inestimável para empregar a evolução dirigida para entender a adaptação, a replicação e o papel dos genes virais na patogênese e resistência antiviral em vírus de RNA de sentido positivo.

Introdução

O rastreamento genético antecipado começa com um fenótipo viral de interesse e, em seguida, por meio do sequenciamento de seu genoma e comparação com o da cepa original, tenta identificar a(s) mutação(ões) causadora(s) desse fenótipo. Em contraste, nos rastreamentos genéticos reversos, mutações aleatórias são introduzidas em um gene alvo, seguidas por um exame do(s) fenótipo(s) resultante(s)¹. Para a abordagem da genética reversa, a mutagênese in vitro é a técnica mais amplamente utilizada para criar um pool de variantes que são posteriormente rastreadas para fenótipos de interesse. Várias ferramentas genéticas têm sido relatadas para ....

Protocolo

NOTA: A cepa JFH1 (WT) usada aqui foi um presente gentil de Takaji Wakita, Instituto Nacional de Doenças Infecciosas. A linhagem celular de hepatoma humano, Huh7.5, foi um presente gentil de Charles Rice, da Universidade Rockefeller. Um esquema do método é mostrado na Figura 1.

1. Mutagênese de substituição genômica ampla de JFH1 usando PCR propenso a erros

1. Para a realização da ep-PCR, preparar a mistura mestre para quatro conjuntos de experimentos com os primers J-For 5'-GTTTTCCCAGTCAGCACGTTGTAAAACGACGGC-3' e J-Rev 5'-CATGATCTGCAGAGAGACCAGTTACGGCACTCTC -3' (Figur....

Resultados

Uma infinidade de variantes completas do HCV pode ser gerada e rastreada para fenótipos resistentes de interesse seguindo os procedimentos descritos na Figura 1. Bibliotecas completas de mutantes do genoma foram sintetizadas usando clonal-pJFH1 em quantidades decrescentes (100-10 ng), como mostrado na Figura 2. Os rendimentos médios dos produtos de ep-PCR (bibliotecas mutantes) variaram de 3,8-12,5 ng/μL. A Figura 3 mostra os transc.......

Discussão

Neste estudo, detalhamos um procedimento simples e rápido de FL-MRS que integra ep-PCR¹⁸ e genética reversa para sintetizar bibliotecas do genoma completo do HCV, que pode então ser usado em um sistema de cultura celular para gerar variantes competentes em replicação para a triagem de fenótipos resistentes a drogas. O uso de Taq DNA polimerase de baixa fidelidade é um pré-requisito da ep-PCR que permite a incorporação de substituições durante a amplificação por PCR de um genoma viral completo. Tes.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1 kb mais escada de DNA	Thermo Fisher	10787018
tubo de centrífuga de 1,5 ml	Tarsons	500010
Tubo de centrífuga de 15 ml	Tarsons	546021 placa de
cultura de células de 35 mm	Tarsons	960010
50 ml	Tarsons	546041
Ácido acético	Merck	A6283
Agarose	Unidade de	MB080
Agrose	BioRad	1704406
Biosafety Cabinet, ClassII	ESCO	AC2 4S
Albumina de soro bovino	HiMedia	MB083
Centrífuga	Eppendorf	5424-R
CFX Connect	BioRad	1855201
Placas de Clonagem 90 mm	Tarson	460091
Incubadora de CO2	Galáxia de Brunswick	170R
	Titertek-Berthold	11050140
DAB  Substrato  Kit	Abcam	ab94665
Solução dATP	NEB	N0440S
Conjunto de Solução de Desoxinucleotídeo (dNTP)	NEB	N0446
Dietil Pirocarbonato (DEPC)	produto químico	46791
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	HiMedia	MB058
DMEM Lonza		BE12-604F
EcoR1-HF	NEB	R3101
EDTA sal tetrassódico di-hidratado	HiMedia	GRM4918
Brometo de Etídio	Amresco	X328
Soro bovino fetal	Gibco	26140079
Formaldeído	Fishser Scientific	12755
	ALPHA IMAGER
Anticorpo Secundário Anti-Rato IgG (H+L) de Cabra, HRP	Thermo Fisher	A16066
Peróxido de hidrogênio 30%	Merck	107209
Microscópio invertido	Nickon	Caldo ECLIPSE Ts2
LB	HiMedia	M1245
Lipofectamina 2000	de	Reagente de Transfecção	Thermo Fisher
	Eppendorf
Metanol	Merck	106009
Micro Pontas 0.2-10 µ l	Tarsons	521000
Micro Pontas 10 - 100 µ l	Tarsons	521010
Micro Pontas 200-1000 µ l	Tarsons	521020
Amortecedor MOPS	GeNei	3601805001730
Aminoácidos não essenciais (NEAA)	Gibco	11140050
One Shot TOP10 Quimicamente competente E. coli	Invitrogen	C404010	E.coli DH5α
Opti-MEM	Gibco	1105-021	de meio essencial mínimo
0.2 ml	Tarsons	510051
Pencillin/estreptomicina	Gibco	15070063
pGEM-T Easy Vector System	Promega	A1360	T-vector DNA
Phosphate Buffer salina (PBS)	HiMedia	TI1099
Phusion  Controlador de pipeta de DNA polimerase de alta fidelidade	NEB	M0530S
Pibrentasvir	Cayman Chemical	27546
	Gilson
Polimerase de DNA Taq de Platina	Software	de
Prism	GraphPad
QIAamp Viral RNA Mini kit	Kit de isolamento viral	Qiagen	52904
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
QIAquick PCR Kit de purificação	QIAGEN	28104	kit de purificação de cokum
RNeasy Mini Kit	Kit de limpeza de RNA	QIAGEN	74104
Pipetas sorológicas 25 ml	Thermo Fisher	170357N
Pipetas sorológicas 5 ml	Thermo Fisher	170355N
Pipetas sorológicas 10 ml	Thermo Fisher	170356N
Marcador de RNA de fita única 0.2-10 kb	Merck	R7020
Leite desnatado	HiMedia	M530
Azida de sódio 0.1 M solução	Merck	8591
SuperScript III Transcriptase reversa	Invitrogen	18080044	transcriptase reversa
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
T175 frasco de cultura de células	Tarsons	159910
T25 frasco de cultura de células	Tarsons	950040
T7 RiboMax Express	Promega	P1320	Sistema de produção de RNA em larga escala
Frasco de cultura de células T75	Tarsons	950050
Taq DNA Polimerase	Genetix Biotech (Puregene)	PGM040
TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit	Applied Biosystems	4392653
TaqMan RNA-to-CT  1-Passo  Kit	Thermo Fisher	4392653	kit comercial qRT-PCR
TOPO-XL--2 Kit Completo de Clonagem de PCR	Thermo Fisher	K8050-10	kit para clonagem de produto de PCR longo
Base Tris HiMedia		TC072
Solução de tripsina-EDTA	HiMedia	TCL007
Tween 20	HiMedia	MB067
Concentrador de Vácuo	Eppendorf, Concentrador Plus	100248
Banho-maria	CONCESSÃO	JBN-18
Xba1	NEB	R0145S

Tubo de centrífuga eletroforese em gel HiMedia Sistema de Detecção de PCR em Tempo Real Novo Espectrômetro de Microvolume Colibri da Glicose alta do Sistema de Documentação em Gel Conjunto Pipetas Mecânicas de 116680270 3120000909 tubos PCR F110120 análise estatística Thermo 10966034 Sistema de Produção de RNA em Larga Escala