Uma abordagem de implante retrógrado para a colocação de cateter de diálise peritoneal em camundongos

Resumo

Este artigo descreve modificações de um procedimento para implantação de cateter de diálise peritoneal em modelo murino para evitar grandes problemas técnicos observados com as técnicas convencionais.

Resumo

Modelos murinos são empregados para investigar vários aspectos da diálise peritoneal (DP), como inflamação peritoneal e fibrose. Esses eventos impulsionam a falha da membrana peritoneal em humanos, que continua sendo uma área de intensa investigação devido às suas profundas implicações clínicas no manejo de pacientes com doença renal em estágio terminal (DRCT). Apesar da importância clínica da DP e suas complicações relacionadas, os modelos murinos experimentais atuais sofrem de desafios técnicos importantes que comprometem o desempenho dos modelos. Estes incluem migração e torção do cateter de DP e geralmente justificam a remoção mais precoce do cateter. Essas limitações também impulsionam a necessidade de um maior número de animais para completar um estudo. Abordando essas desvantagens, este estudo introduz melhorias técnicas e nuances cirúrgicas para prevenir complicações comumente observadas do cateter de DP em um modelo murino. Além disso, este modelo modificado é validado pela indução de inflamação peritoneal e fibrose usando injeções de lipopolissacarídeos. Em essência, este artigo descreve um método melhorado para criar um modelo experimental de DP.

Introdução

Carga de doença renal em estágio terminal
A doença renal crônica (DRC) é um problema de saúde mundial¹. Estimativas atuais sugerem que mais de 850 milhões de pessoas em todo o mundo têm doença renal. A prevalência de doença renal quase dobra o número de pessoas com diabetes (422 milhões) e é mais de 20 vezes a prevalência de pacientes com câncer (42 milhões) ou HIV/AIDS (36,7 milhões) em todo o mundo². Aproximadamente um em cada sete americanos tem DRC, e dois em cada 1.000 americanos têm ESKD que requer um transplante renal ou suporte de diálise³. Considerando a crescente carga da ESKD em todo o mundo, otimizar a tecnologia de diálise é crucial³.

Diálise peritoneal
A DP é uma modalidade significativamente subutilizada para o tratamento da DRCT nos Estados Unidos. De acordo com o United States Renal Data System (USRDS), o percentual de pacientes com DP prevalentes foi de apenas 11% em 2020 ^4,5. A DP confere várias vantagens em relação à hemodiálise (HD) no centro, incluindo uma melhor qualidade de vida, menos visitas clínicas e uma diminuição nos gastos com o Medicare ^6,7. Além disso, a DP é uma terapia caseira e está associada a um risco muito menor de infecções graves, como bacteremia e endocardite, que geralmente estão relacionadas a cateteres de hemodiálise. Além disso, a DP pode ser iniciada rapidamente com um protocolo de início urgente, diminuindo a necessidade de início da diálise com cateteres vasculares de demora⁸. A DP é considerada o método preferencial de diálise na população pediátrica com DRCT⁹.

Comprometimento peritoneal induzido pela diálise peritoneal
A DP implica a introdução de fluido de DP (dialisato) no peritônio, o que resulta em inflamação e remodelamento da membrana peritoneal ao longo do tempo. A inflamação peritoneal desencadeia fibrose, culminando na perda potencial das capacidades de ultrafiltração da membrana ao longo do tempo. A preservação da membrana peritoneal é um desafio significativo na DP, e mais pesquisas são criticamente importantes para garantir que as melhores práticas clínicas estejam disponíveis para os profissionais. Existem modelos murinos bem estabelecidos para ajudar a aprofundar a compreensão dos mecanismos fisiopatológicos de infecção e inflamação peritoneal, soluto, cinética de transporte de água e falha de membrana; ainda, problemas técnicos com o cateter muitas vezes limitam esses modelos¹⁰.

Analisando as alterações da membrana peritoneal
Em pacientes com DRCT, o dialisato é tradicionalmente introduzido na cavidade peritoneal através de um cateter de Tenkhoff com manguito profundo e superficial. Os pacientes podem potencialmente apresentar complicações relacionadas ao cateter, incluindo migração do cateter, dor na infusão e má drenagem do dialisato^11,12,13. Dois tipos principais de cateteres peritoneais têm sido introduzidos para humanos, enrolados ou retos, para minimizar essas complicações¹². Várias modificações, incluindo um manguito extra aos cateteres convencionais de dois manguitos, foram adicionadas aos cateteres originais para prolongar a sobrevida do cateter de DP¹¹. A técnica de inserção varia de acordo com diversos fatores, impedindo que a migração do cateter seja adicionada após a sobrevida, incluindo a disponibilidade dos recursos e o nível de especialização¹⁴.

Em contraste, os modelos murinos de diálise peritoneal têm diferenças fundamentais nas técnicas e na finalidade em comparação com os cateteres peritoneais humanos. Por exemplo, cateteres peritoneais em modelos murinos são usados principalmente para estudar alterações de membrana e são menos destinados a funções de drenagem bidirecional. A técnica atual sofre de potencial deslocamento da porta e migração do cateter devido ao manuseio dos animais. Nos modelos murinos convencionais, as portas de acesso não foram fixadas à pele. Esse aspecto criou uma porta de acesso instável, que em animais acordados pode ser desalojada, resultando em migração do cateter. Dada a importância dos modelos murinos na pesquisa da membrana peritoneal, é imperativo criar técnicas cirúrgicas eficazes para gerar modelos confiáveis. Portanto, propusemo-nos a otimizar o modelo convencional de colocação de cateteres de DP. É importante ressaltar que o próprio cateter causa alterações histopatológicas na membrana peritoneal e, portanto, quaisquer conclusões sobre o efeito das soluções de DP em estudos com animais devem ser interpretadas no contexto do cateter de DP como um corpo estranho^15,16,17.

Histopatologia da membrana peritoneal
A insuficiência da DP está relacionada principalmente à fibrose e ao excesso de angiogênese, resultando na perda de um gradiente de concentração osmolar. Além disso, a capacidade de filtração por membrana peritoneal pode ser afetada pela peritonite. Além disso, a peritonite infecciosa é uma causa bem estabelecida para a mudança na modalidade de diálise da diálise peritoneal para a hemodiálise. ¹⁸.

Protocolo

Para este estudo, foram utilizadas oito fêmeas de camundongos C57BL/6J, com 8-12 semanas de idade e peso médio de 20 g. Os ratos foram alojados em condições padrão e foram alimentados com ração e água ad libitum. Este estudo foi realizado com a aprovação do Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), Boston University Medical Center (AN-1549). Os procedimentos aqui descritos foram realizados em condições estéreis.

1. Anestesiar o rato numa câmara de isoflurano e injetar o analgésico por via subcutânea

1. Segure o animal da base da cauda. Mantenha o animal na superfície dorsal da mão não dominante.
2. Transfira o animal para a câmara de indução anestésica contínua preenchida com isoflurano a 3%-4%. Confirmar anestesia geral adequada pela ausência de reflexo de pinça do dedo do pé nos membros posteriores direito e esquerdo. Mantenha a manutenção da anestesia geral com isoflurano 1%-3%.
3. Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos.
4. Administrar uma injeção subcutânea de Buprenorfina.
   1. Dissolver o estoque de buprenorfina a uma concentração de 0,3 mg/mL em cloreto de sódio (NaCl) a 0,9% para atingir a concentração final de 0,03 mg/mL.
   2. Injetar uma dose de 0,05-0,1 mg/kg de 0,03 mg/ml de Buprenorfina, juntamente com 500 μL de NaCl estéril 0,9%, 20 min antes da cirurgia num rato a 20 g (2 μg ou 66 μL de 0,03 mg/ml de Buprenorfina por rato).

2. Preparação da pele

1. Coloque o rato totalmente anestesiado numa posição lateral esquerda, expondo o seu flanco direito à manta de aquecimento. Raspe o lado direito do abdômen, logo perto da linha média da área paraespinhal e até a cauda do animal.
2. Desinfete a área raspada três vezes usando um cotonete com a aplicação alternativa da solução antisséptica ou esfoliante e álcool a 70% ou solução salina estéril em um movimento circular, começando no local da incisão cirúrgica e movendo-se para fora. Descarte o cotonete após cada uso. Tenha cuidado para não molhar excessivamente áreas não cirúrgicas do animal com álcool ou antisséptico, pois isso pode piorar a hipotermia.
   NOTA: É importante diluir adequadamente as soluções antissépticas e não deixar esfoliantes cirúrgicos na pele durante a cirurgia, pois podem ser irritantes e precisam ser enxaguados. Verifique frequentemente a temperatura da manta de aquecimento durante o procedimento para garantir que a temperatura não caia.

3. Meça o comprimento do cateter e marque o ponto de inserção dentro do abdômen e do trato do tubo sobre a pele preparada

1. Atribua o bolso da porta de acesso 1 cm acima da cauda do animal. Segure o segmento de instalação com o indicador não dominante e o polegar sobre a área atribuída perto da cauda.
2. Coloque o cateter acima da pele e estime o local para a inserção do tubo do cateter dentro da cavidade abdominal. Marque o local designado para a inserção do tubo, respeitando a flexão mínima do tubo próximo à linha média anterior.
   NOTA: Todos os procedimentos devem ser realizados com luvas estéreis, e o cateter deve ser mantido estéril durante a medição. As ferramentas cirúrgicas devem ser autoclavadas a 121 °C antes da utilização. Consulte a Figura Suplementar S1 para os instrumentos necessários para o procedimento.

4. Personalize a seção do reservatório do cateter peritoneal

1. Faça um furo lateral sobre a estrutura da seção do reservatório com o pichador auricular do mouse (Figura 1 e Figura 2). Deve-se notar que o soco auricular é uma ferramenta cirúrgica e precisa ser estéril.

5. Coloque a porta de instilação

1. Faça uma incisão horizontal de pele de 1 cm de largura 1 cm acima da cauda. Disseque sem rodeios o plano subcutâneo da camada muscular subjacente para fazer uma bolsa para a colocação do cateter para garantir que a porta de instilação resida livremente na bolsa da porta ideal.
2. Mantenha a ponta da tesoura da íris em direção à linha média para fazer um túnel oblíquo para a colocação do tubo (Figura 3A).
3. Passe a sutura 3.0 do orifício lateral personalizado. Fixe a porta de acesso ao leito muscular apertando a sutura passada, mantendo o curso da tubulação cefálico.

6. Faça a incisão no local de inserção da ponta do cateter

1. Faça uma incisão de 1 cm sobre a área anteriormente marcada perto da linha média. Confirme o trato bem desenvolvido passando uma tesoura pelo trato.
2. Escolha a ponta do cateter suavemente com fórceps para colocar o cateter em um curso retrógrado.
   NOTA: Evite beliscar os orifícios laterais do tubo.
3. Passar o tubo do cateter pelo trato preparado (Figura 3B). Faça uma incisão de 1 cm sobre a camada muscular próxima à linha média direita.

7. Confirme o funcionamento do cateter

1. Antes de fechar todas as incisões, certifique-se de que o cateter colocado esteja funcional. Verifique a função com uma seringa de 1 ml ligada à agulha Huber específica para a porta.
2. Injete 200 μL de solução salina normal na porta de instilação. Procure um fluxo suave com tolerância zero à resistência.
3. Lave a porta e o cateter com heparina a 10% para manter a permeabilidade.

8. Feche as incisões na pele

1. Feche as incisões cutâneas ao redor do reservatório do porto (Figura 3C) com suturas absorvíveis 3-0.

9. Fixe a ponta do cateter dentro da cavidade abdominal

1. Coloque uma sutura solta com 4-0 sutura redonda absorvível ao redor do músculo da parede abdominal incisada. Passe a feltro proximal do cateter dentro da incisão.
2. Aperte a sutura preparada com a bolsa ao redor do tubo, mantendo o segundo sentido fora do fio da bolsa, sobre a camada muscular (Figura 3D), e feche a pele com suturas absorvíveis 3-0 (Figura 2).

10. Monitorar os animais no pós-operatório e diariamente, administrar analgesia e fluidos pós-operatórios e manter registros pós-operatórios diários por um período mínimo de 7 dias e até a recuperação completa

1. Mantenha o cateter funcional com uma injeção diária de 200 μL de solução salina normal através do cateter.

11. Injeções de fluidos

1. Confirme o processo pós-procedimento sem intercorrências, inspecionando cuidadosamente a incisão da pele.
2. Preparar LPS 2 mg/kg de peso corporal para injeções intraperitoneais (i.p.) diluindo 40 μg do LPS com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) até a concentração de trabalho de 0,2 μg/μL (em essência, 10 μL para 2 μg/g de peso corporal e 200 μL de LPS para camundongos 20 g).
3. Inicie as injeções na segunda semana após o implante do cateter.
   1. Segure o animal suavemente com a mão não dominante e restrinja a porta de instilação enquanto move os dedos indicador e polegar na direção cefálica.
   2. Desinfete a pele que recobre o reservatório com álcool isopropílico a 70%. Utilize a seringa ligada à agulha Huber para injetar o LPS.
      1. Depois de entrar na porta com a agulha Huber, injete 100 μL de solução salina normal na porta para confirmar o curso da patente.
      2. Injete os 200 μL preparados de LPS, seguidos pelos 100 μL de solução salina normal para irrigação do tubo, e certifique-se de que não há resistência.

12. Anestesiar os camundongos antes de colher o peritônio e coletar o líquido peritoneal

1. Após 7 dias de injeções de LPS e 2 semanas de implantação do cateter, planeje a biópsia peritoneal.
2. Planeje a anestesia geral.
   1. Anestesiar o rato numa câmara de isoflurano e injetar o analgésico por via subcutânea.
   2. Segure o animal a partir da base da cauda e mantenha o animal na superfície dorsal da mão.
   3. Transfira o animal para a câmara de indução anestésica contínua preenchida com isoflurano a 3%-4%. Confirmar anestesia geral adequada pela ausência de reflexo de pinça do dedo do pé nos membros posteriores direito e esquerdo. Mantenha a manutenção da anestesia geral com isoflurano 1%-3%.

13. Biópsia peritoneal

1. Coloque o animal sobre o cobertor aquecido na posição supina. Faça uma incisão na pele da linha média do sub-xifóide para a bexiga.
2. Perfundir o plano subfascial com PBS frio (Figura 3E).
3. Certifique-se de que o plano está completamente dissecado sem perturbar a integridade do peritônio. Iniciar dissecar o peritônio a partir da reflexão peritoneal lateral no quadrante inferior esquerdo, a partir do hilo para o flanco esquerdo, e bexiga no aspecto inferior para manter as amostras consistentes entre os animais (Figura 3F).
4. Após a colheita peritoneal, eutanasiar o animal por luxação cervical.

Resultados

Todos os cateteres implantados estavam funcionais até o final do estudo, e o deslocamento ou torção do cateter não complicou nenhum dos cateteres implantados. A técnica atual, modificada, foi validada com um modelo induzido por peritonite usando LPS. Os camundongos controle receberam 200 μL de injeções diárias normais de solução salina, enquanto os camundongos experimentais foram injetados com 200 μL de LPS, conforme discutido na etapa 11 do protocolo, por um total de 7 dias após o implante do cateter.

Discussão

Três modelos murinos de DP são descritos. Isso inclui uma punção cega da superfície peritoneal, um sistema aberto-permanente e um sistema fechado¹⁰. A punção cega da superfície peritoneal envolve acesso peritoneal direto semelhante às injeções intraperitoneais, mas não permite a drenagem do dialisato. Sendo um procedimento cego, este método pode ferir os órgãos viscerais abdominais. O modelo de sistema aberto-permanente mantém o cateter de diálise e a porta de instilação fora do corpo. No entanto,...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10% de heparina	Canadá Inc., Boucherville, QC, Canadá)	Produto
Buprenorfina 0,3 mg/mL	PAR Farmacêutica	Camundongos NDC 42023-179-05
C57BL/6J	The Jackson Lab	IMSR_JAX:000664
CD31	Abcam	Ab9498
Grampo	Ferramentas de Belas Ciências	13002-10
Fórceps	Ferramentas de Belas Ciências	11002-12
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Dumont Vessel Cannulation Forceps	Fine Science Tools	11282-11
Tesoura Fina - Grandes Loops	Fine Science Tools	14040-10
Fisherbrand  Furador de Orelha Animal	Fisher Scientific	13-812-201
Hill Hemostat	Fine Science Tools	13111-12
Agulha de ponta Huber	Acesso  Tecnologias	PG25-500	Agulha para injeções
Isoflurano, USP	Covetrus	NDC 11695-6777-2
Lipopolissacarídeo de E.coli	SIGMA&	nbsp;                         Microscópio L4391
	Nikon Eclipse Microscópio Invertido	TE2000
Minuto Mouse Port 4French com contas de retenção e furos cruzados	Acesso  Tecnologias	MMP-4S-061108A
Agulhas de ponta Huber Posi-Grip 25 G x 1/2&aguda; &agudo;	Acesso  Tecnologias	PG25-500
Tesoura	Ferramentas de Belas Ciências	14079-10
Sutura Vicryl	AD-Cirúrgica	#L-G330R24

farmacêutico