Avaliação da função mitocondrial no nervo ciático por respirometria de alta resolução

Summary

A respirometria de alta resolução acoplada aos sensores de fluorescência determina o consumo mitocondrial de oxigênio e a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS). O presente protocolo descreve uma técnica para avaliar as taxas respiratórias mitocondriais e a produção de ROS no nervo ciático permeabilizado.

Abstract

A disfunção mitocondrial nos nervos periféricos acompanha várias doenças associadas à neuropatia periférica, que podem ser desencadeadas por múltiplas causas, incluindo doenças autoimunes, diabetes, infecções, doenças hereditárias e tumores. Avaliar a função mitocondrial nos nervos periféricos do camundongo pode ser desafiador devido ao pequeno tamanho da amostra, a um número limitado de mitocôndrias presentes no tecido e a presença de uma bainha de mielina. A técnica descrita neste trabalho minimiza esses desafios usando um protocolo único de permeabilização adaptado de um usado para fibras musculares, para avaliar a função mitocondrial do nervo ciático em vez de isolar as mitocôndrias do tecido. Medindo a produção fluormétrica de espécies reativas com Amplex Vermelho/Peroxidase e comparando diferentes substratos mitocondriais e inibidores em nervos de saponina-permeabilized, foi possível detectar estados respiratórios mitocondriais, espécies reativas de oxigênio (ROS) e a atividade de complexos mitocondriais simultaneamente. Portanto, o método aqui apresentado oferece vantagens em relação à avaliação da função mitocondrial por outras técnicas.

Introduction

Mitocôndrias são essenciais para manter a viabilidade celular e desempenham inúmeras funções celulares, como metabolismo energético (glicose, aminoácido, lipídio e metabolismo de nucleotídeos). Como local principal da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), as mitocôndrias são centrais em diversos processos de sinalização celular, como apoptose e participam da síntese de aglomerados de ferro-enxofre (Fe-S), importação e maturação de proteínas mitocondriais, e manutenção de seu genoma e ribossomos ^1,2,3. A rede de dinâmica da membrana mitocondrial é controlada por pro....

Protocol

O presente protocolo é aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais em Pesquisa, CCS/UFRJ (CEUA-101/19) e Institutos Nacionais de Saúde para o cuidado e uso de animais experimentais. O nervo ciático é isolado de camundongos C57BL/6 machos de quatro meses de idade, eutanizados por deslocamento cervical de acordo com as diretrizes institucionais. As etapas do protocolo são otimizadas para evitar a deterioração mitocondrial. Portanto, neste protocolo, a calibração dos sensores polarográficos de oxigênio foi realizada antes da dissecção do tecido nervoso ciático do camundongo e da permeabilização.

1. Preparação de reagentes

Results

O consumo mitocondrial de oxigênio pelo nervo ciático permeabilizado está representado na Figura 2. O traço vermelho representa o fluxo O₂ por unidade em pmol/s.mg. Após registrar um consumo basal de oxigênio com substratos endógenos (respiração de rotina), o succinato (SUCC) é injetado para registrar a respiração complexa II (succinato deshidrogenase), resultando em um aumento na taxa de consumo de oxigênio. Em sequência, adiciona-se uma concentração saturada de ADP, ativando a s.......

Discussion

Várias doenças ou condições que acompanham neuropatias têm disfunção mitocondrial como fator de risco. A avaliação da função mitocondrial nos nervos periféricos é essencial para elucidar como as mitocôndrias agem nessas condições neurodegenerativas. A avaliação da função mitocondrial é trabalhosa devido à dificuldade do método de isolamento e à escassez de material. Assim, o desenvolvimento de técnicas de permeabilização tecidual que não requerem o isolamento das mitocôndrias é essencial.

Para.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosina 5' trifosfato dissódico sal hidratado	Sigma-Aldrich	A26209
Adenosina 5′-difosfato de sódio	sal Sigma-Aldrich	A2754
Amplex Red Reagent	Thermo Fisher scientific	A12222	Amplex Red é preparado em DMSO de acordo com a ficha técnica do produto
Antimicina A (de Streptomyces sp.)	Sigma-Aldrich	A8674
Albumina de Soro Bovino	Sigma-Aldrich	A7030	fração de choque térmico, livre de protease, livre de ácidos graxos, essencialmente livre de globulina, pH 7, ≥ 98%
Carbonato de cálcio	Sigma-Aldrich	C6763
Cianeto de carbonila 4- (trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
Citocromo c	Sigma-Aldrich	C7752	(do coração equino; pequena hemeproteína)
DataLab versão 5.1.1.91	OROBOROS INSTRUMENTS, Áustria		Copyright (c) 2002 - 13 por Dr. Erich Gnaiger
Agitador de microplacas orbital digital 120V	Thermo Fisher científico	88882005
DL-Ditiotreitol	Sigma-Aldrich	43819
EGTA sal de sódio	Sigma-Aldrich	E8145
Seringa	Hamilton Sigma-Aldrich	HAM80075	10 uL, 25 uL e 50 uL
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Hidrogênio solução de peróxido 30% P/A	Merck	H1009
Imidazol	Sigma-Aldrich	I2399
L-(&menos;)-Ácido málico	Sigma-Aldrich	M7397
Cloreto de magnésio hexahidratado	Sigma-Aldrich	M2393
MES sal de sódio	Sigma-Aldrich	M3885
Pinça de microdissecação, curva	Sigma-Aldrich	F4142
Pinça de microdissecação, reta	Sigma-Aldrich	F4017
O2K - Conjunto de filtros Amplex Red	OROBOROS INSTRUMENTS, Áustria	44321-01	Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometria: produção de HRR e H2O2 em mitocôndrias cerebrais de camundongos. Rede Fisiol Mitocôndr 17.17.
O2K - Fluorescência LED2 - componente do módulo Sensor de fluorescência Verde	OROBOROS INSTRUMENTS, Áustria	44210-01
Oligomicina	Sigma-Aldrich	O4876	(de Streptomyces diastatochromogenes; mistura de oligomicinas A, B e C
OROBOROS Oxygraph-2k	OROBOROS INSTRUMENTS, Áustria	http://www.oroboros.at
Palmitoilcarnitina (Palmitoil-DL-carnitina-HCl)	Sigma-Aldrich	P4509
Peroxidase de rábano	Sigma-Aldrich	P8375
Placas de Petri, poliestireno	MERCK	P5606
Hidrato de sal dissódico de fosfocreatina	Sigma-Aldrich	P7936
Monobásico de di-hidrogenofosfato de potássio	Sigma-Aldrich	PHR1330
Hidróxido de	potássioSigma-Aldrich	221473
Rotenona	Sigma-Aldrich	R8875
Saponina	Sigma-Aldrich	SAE0073
Piruvato de sódio	Sigma-Aldrich	P5280
Succinato de sódio dibásico hexahidratado	Sigma-Aldrich	S2378
Sacarose	Sigma-Aldrich	S9378
Taurina	Sigma-Aldrich	T0625