Apresentado aqui é uma descrição do isolamento simples e relativamente rápido de Caenorhabditis elegans DNA genômico de um ou poucos animais usando um kit de tecido comercialmente disponível. A preparação gDNA resultante é um modelo adequado para PCR.
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Artigo de método
Extração em pequena escala de Caenorhabditis elegans DNA genômico
Neste artigo
Resumo
Resumo
A extração de DNA genômico de um único ou alguns elegans de Caenorhabditis tem muitas aplicações a jusante, incluindo PCR para linhas de genotipagem, clonagem e sequenciamento. Os métodos tradicionais à base de proteínas à base de K para extração genômica de DNA de C. elegans levam várias horas. Kits de extração comercial que efetivamente quebram a cutícula C. elegans e extraem DNA genômico são limitados. Um método fácil, mais rápido (~15 min), e econômico de extrair DNA genômico C. elegans que funciona bem para aplicações em sala de aula e pesquisa é relatado aqui. Este método de extração de DNA é otimizado para usar nematoides únicos ou algumas larvas tardias (L4) ou nematoides adultos como material inicial para a obtenção de um modelo confiável para executar PCR. Os resultados indicam que a qualidade do DNA é adequada para amplificar alvos genéticos de diferentes tamanhos por PCR, permitindo genotipagem de animais únicos ou alguns, mesmo em diluições a um cinquenta do DNA genômico de um único adulto por reação. Os protocolos relatados podem ser usados de forma confiável para produzir rapidamente o modelo de DNA a partir de uma única ou uma pequena amostra de C. elegans para aplicações baseadas em PCR.
Introdução
Aqui, dois protocolos relacionados são apresentados para a lise de caenorhabditis elegans para tornar o DNA acessível para aplicações baseadas em PCR. PCR é uma técnica molecular comumente usada para muitas aplicações, incluindo genotipagem e amplificação de fragmentos de DNA para clonagem e sequenciamento, entre outras. A pequena (1 mm), lombriga de vida livre C. elegans é um sistema animal popular para pesquisa biológica. Obter DNA genômico adequado de um único animal ou alguns animais é suficiente para amplificar a sequência por PCR. Larvas L4 tardias e adultos contêm apenas ~1.000 células somáticas (incluindo algumas células multinucleares, poliploides), células germinativas, e (se o animal é uma hermafrodita gravid) prole no útero1. No entanto, esses animais são protegidos por uma cutícula que deve ser interrompida para extrair o DNA genômico2. Os métodos padrão para preparar o modelo de DNA genômico nematode para PCR envolvem múltiplas etapas e levam várias horas. Os animais são primeiro congelados em tampão de lise de verme contendo proteinase K (−70 °C ou abaixo) por pelo menos 15-45 min (mais tempo é recomendado por alguns protocolos)3,4,5,6. Este passo abre os animais.
Após o congelamento, os animais são incubados por 1h a 60-65 °C para o proteinase K funcionar, em seguida, a enzima é inativada por 15-30 min a 95 °C. O proteinase K destrói os núcleos que degradam o DNA. A inativação da proteinase K antes do PCR é importante para evitar que a proteinase K degrade a polimerase do DNA. Os dois protocolos baseados em kits descritos aqui são métodos rápidos, confiáveis e econômicos para extrair DNA genômico de um único animal ou alguns nematoides para pesquisas diárias e aplicações laboratoriais de ensino. O kit utilizado foi originalmente otimizado pelo fabricante para extrair DNA de tecido animal, saliva e cabelo7. Ele usa uma solução proprietária de preparação de tecidos e solução de extração para células de lise e torna o DNA genômico acessível. Uma solução proprietária de neutralização neutraliza então os componentes que podem inibir o PCR (por exemplo, sais, íons e moléculas de ligação Mg2+).
Ao genotipar, um único animal pode ser testado. Ao determinar se uma cepa é homozigosa, testar seis ou mais descendentes de um único animal dá alta confiança de que uma linha é homozigosa ou não (há uma chance de 0,02% de escolher aleatoriamente seis descendentes mutantes homozigos de um pai heterozigoso [(1/4)6 × 100% = 0,02%]). Este método 1) é simples, com menos passos do que o método proteinase K, e 2) diminui o tempo de preparação do modelo para 15 min. Os resultados deste trabalho demonstram que o protocolo desenvolvido funciona robustamente na extração de DNA genômico de um único ou poucos worms, que podem ser usados de forma confiável para aplicações a jusante que não requerem DNA altamente purificado, incluindo PCR.
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Protocolo
1. C. elegans manutenção
NOTA: As cepas N2 (tipo selvagem) e blmp-1(tm548) C. elegans foram mantidas nas placas padrão de nematode growth media (NGM) a 20 °C.
- Prepare as placas de NGM dissolvendo 23,005 g de pó NGM em 973 mL de água em um frasco de 2 L. Cubra a abertura do frasco com papel alumínio (ou tampa autoclavável que permita a ventilação) e fixe a cobertura com fita autoclave. Autoclave para dissolver o pó e esterilizar o conteúdo com um ciclo de esterilização de pelo menos 30 min.
- Esfrie o médio a 60 °C em banho-maria.
- Ao meio resfriado, adicione 25 mL de fosfato estéril de 1 M (KH2PO4), pH 6.0; 1 mL de solução de cloreto de cálcio de 1 M; e 1 mL de solução de sulfato de magnésio de 1 M.
- Mexa o meio em uma placa de mexida magnética para obter uma mistura homogênea e para evitar o resfriamento e a solidificação irregulares (~5 min). Certifique-se de que a barra de rebuliço gire rápido o suficiente para criar um vórtice, mas não tão rápido que as bolhas sejam introduzidas (~250-300 rpm).
- Despeje ~25 mL do meio em cada placa de Petri de 10 cm (~40 placas no total). Seque as placas à temperatura ambiente durante a noite (tipicamente 16-25 °C).
- Cresça uma colônia de Escherichia coli OP50 em 30-50 mL de caldo LB durante a noite a 37 °C.
- Semente cada placa com 500 μL de cultura E. coli OP50 e deixe-as secar em temperatura ambiente antes do uso (tipicamente 16-25 °C)8. Armazene as placas a 4 °C por até 3 semanas.
- Transfira C. elegans para placas semeadas usando uma picareta de arame ou outro método e deixe-os crescer para L4 ou estágio adulto na temperatura necessária para a cepa (tipicamente 16-25 °C, 1-2 dias se os animais foram banhados famintos como dauers, 3-4 dias se os animais foram banhados como embriões)8.
2. Extração de DNA de um único verme
NOTA: Este método é útil para extrair DNA de um único verme (um verme em 1,8 μL de volume total). Uma mistura mestra pode ser feita se vários vermes serão lysed ao mesmo tempo.
- Programe um termociclador para um ciclo a 55 °C por 10 min seguido de 95 °C para 3 min (programa de lise).
- Alíquota 0,8 μL da solução de extração do kit para a parede interna de um tubo PCR de 0,2 mL no gelo. Adicione 0,2 μL da solução de preparação tecidual do kit à gota da solução de extração. Misture por pipetação.
- Identifique um L4 ou um animal adulto sob um microscópio dissecando9. Para identificar hermafroditas L4, procure uma vulva característica que seja visível como um meio-círculo pálido no meio do animal. Identifique hermafroditas adultas procurando os maiores animais na placa que podem ter embriões ovais visíveis em seu útero.
- Usando uma picareta de fio de platina, transfira o animal selecionado para a solução10.
- Centrifugar o tubo brevemente (2-3 s, ≤6.000 rpm /2.000 × g) à temperatura ambiente para coletar o conteúdo na parte inferior do tubo.
- Coloque o tubo no termociclador e execute o programa de lise definido na Etapa 2.1.
- Quando o programa estiver completo, centrifufique brevemente o tubo e coloque-o no gelo. Adicione 0,8 μL da solução de neutralização do kit à mistura. Misture por pipetação.
- Centrifugar o tubo brevemente à temperatura ambiente (2-3 s, ≤6.000 rpm /2.000 × g).
- Use diretamente o lise para PCR ou armazene-o a 4 °C ou −20 °C para uso futuro.
NOTA: O DNA extraído é estável a 4 °C ou -20 °C por pelo menos 6 meses7.
3. Extração de DNA de alguns indivíduos
NOTA: Este método é útil para extrair DNA de alguns vermes. Uma mistura mestra pode ser preparada se várias cepas serão líssedas ao mesmo tempo.
- Programe o termociclador para um ciclo a 55 °C por 10 min seguido de 95 °C para 3 min (programa de lise).
- Alíquota 2,0 μL da solução de extração do kit para a parede interna de um tubo PCR de 0,2 mL no gelo. Adicione 0,5 μL da solução de preparação tecidual do kit à solução de gotícula de extração. Misture por pipetação.
- Identifique L4 ou animais adultos sob um microscópio de dissecação9. Hermafroditas L4 têm uma vulva característica que é visível como um meio-círculo pálido no meio do animal. Hermafroditas adultas são os maiores animais na placa e podem ter embriões ovais visíveis em seu útero.
- Usando uma picareta de fio de platina, transfira alguns animais para a solução: 9 animais produzem 1 animal equivalente ao DNA genômico por 0,5 μL de lise, e 16 animais produzem ~1 animal equivalente ao DNA genômico em 0,25 μL (3,5 nematoides/μL)10.
NOTA: É difícil transferir mais de 16 animais para este volume. - Centrifugar o tubo brevemente à temperatura ambiente (2-3 s, ≤6.000 rpm /2.000 × g).
- Coloque o tubo no termociclador e execute o programa de lise definido na Etapa 3.1.
- Quando o programa estiver completo, centrifufique brevemente o tubo e coloque-o no gelo. Adicione 2 μL da solução de neutralização do kit à mistura. Misture por pipetação.
- Centrifugar o tubo brevemente à temperatura ambiente (2-3 s, ≤6.000 rpm /2.000 × g).
- Use diretamente a lise para PCR ou armazene-a a 4 °C ou −20 °C para uso futuro.
NOTA: O DNA extraído é estável a 4 °C ou -20 °C por pelo menos 6 meses7.
4. Reação do PCR
NOTA: Uma aplicação a jusante desta técnica de lise de verme, detectando uma mutação de exclusão usando uma polimerase rápida, é descrita. A eficácia dos dois protocolos de lise de vermes na produção de DNA de modelo genômico para PCR bem sucedido em diluições a 1/50 de um worm por reação também é demonstrada.
- Extrair DNA de um único verme e 16 vermes usando cepas de n2 e mutantes do tipo selvagem, como descrito acima no Passo 2 e Passo 3.
- Prepare diluições de 2, 10, 20 e 50 vezes de DNA de um único verme de animais N2 selvagens.
- Configure as reações do PCR seguindo o protocolo do fabricante usando primers específicos para a sequência de interesse e mix mestre pcr de início quente (Tabela 1 e Tabela 2). Use 1 μL de DNA não diluído ou 2 μL de DNA diluído como modelo em cada reação.
- Confirme os produtos PCR por eletroforese de gel e imagem11.
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Resultados
O DNA genômico de um único ou alguns adultos do tipo selvagem foi extraído usando o kit comercial ou o protocolo tradicional de lise para comparar a eficácia desses dois métodos. Esses lises foram então usados como modelos para PCR para amplificar um alvo maior de ~2.100 bp (codificação blmp-1) ou um alvo menor de ~500 bp (codificando uma parte do sma-10). Ambos os métodos produziram com sucesso produtos PCR apropriados (Figura 1A).
Em seguida, f...
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Discussão
Determinar os genótipos de C. elegans é um passo importante ao realizar cruzes genéticas para criar novas cepas de C. elegans . Extração genômica de DNA usando um único ou pouco C. elegans é um passo crucial na genotipagem C. elegans. Este protocolo descreve a extração genômica de DNA de C. elegans usando um kit comercial. Este método é rápido e funciona de forma robusta. O DNA genômico extraído usando este método pode ser usado para aplicações a jusante, incluindo genotipagem...
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Agradecimentos
A cepa N2 e a bactéria E. coli OP50 foram obtidas do Centro genético de Caenorhabditis (CGC), que é financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). A cepa blmp-1(tm548) foi obtida do Projeto Nacional de Biorefonte, Japão. Os autores agradecem wormbase. Este trabalho foi apoiado pelo NIH R01GM097591 para t.L.G., financiamento interno da Texas Woman's University para t.L.G, e o Centro de Pesquisa estudantil da TWU para M.F.L.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| fita de autoclave | Defend | 43237-2 | |
| folha de alumínio, | Reynolds Wrap | 2182934 | |
| cloreto de cálcio | Millipore Sigma | 102382 (CAS 10035-04-8) | |
| Kit Extract-N-Amp (inclui Solução de Preparação de Tecidos, Solução de Extração e Solução de Neutralização) | Sigma-Aldrich Co. LLC | XNAT2-1KT | |
| Placa de aquecimento/agitador Isotemp | Fisher Scientific | 11-100-495H | |
| LB media, Lennox, | cápsulas MP Biomedicals, LLC | 3002-131 | |
| sulfato de magnésio, 97% puro, anidro | Microcentrífuga Thermo Scientific | AC413485000 (CAS 7487-88-9) | |
| Labnet | International, Inc. | PrismR, C2500-R | |
| NEB Q5U DNA polimerase de alta fidelidade de partida a quente | New England Biolabs, Inc. | M0515S | "Pol E" usado na Figura Suplementar S1, uma polimerase de alta velocidade e alta fidelidade (20– 30 s/kb) |
| Pó de mídia NGM | US Biological Life Sciences | N1000 | |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix com HF Buffer | New England Biolabs, Inc. | M0531S | "Pol D" na Figura 1B, uma polimerase de alta velocidade e alta fidelidade (15– 30 s/kb) |
| primers | Integrated DNA Technologies | oligos | |
| PrimeSTAR GXL polimerase | Takara Bio Inc. | R050B | "Pol C" na Figura 1B, uma polimerase de alta fidelidade (1 min/kb) para modelos ricos em GC e modelos de até 30 kb |
| Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0,1– 10.0 kb) | New England Biolabs, Inc. | N0550S | |
| SapphireAmp Fast PCR Master Mix | Takara Bio Inc. | RR350A | "Pol A" na Figura 1B, polimerase usada na Figura 1A, C, D, uma polimerase de alta velocidade (10 s/kb) para alvos de até 5 kb |
| Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix | Sigma-Aldrich Co. LLC | P4600 | "Pol B" na Figura 1B, uma polimerase (1 min/kb) para alvos de até 7 kb |
| Termociclador SimpliAmp | Applied Biosystems | A24812 | |
| barra de agitação | Fisher Scientific | 14-512-126 | |
| misturador de vórtice | Fisher Scientific | 2215365 | |
| picareta de minhoca | Genesee Scientific Corporation | 59-AWP |
Referências
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Reimpressões e permissões
