Apresentado aqui é uma descrição do isolamento simples e relativamente rápido de Caenorhabditis elegans DNA genômico de um ou poucos animais usando um kit de tecido comercialmente disponível. A preparação gDNA resultante é um modelo adequado para PCR.
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Artigo de método
Extração em pequena escala de Caenorhabditis elegans DNA genômico
Neste artigo
Resumo
Resumo
A extração de DNA genômico de um único ou alguns elegans de Caenorhabditis tem muitas aplicações a jusante, incluindo PCR para linhas de genotipagem, clonagem e sequenciamento. Os métodos tradicionais à base de proteínas à base de K para extração genômica de DNA de C. elegans levam várias horas. Kits de extração comercial que efetivamente quebram a cutícula C. elegans e extraem DNA genômico são limitados. Um método fácil, mais rápido (~15 min), e econômico de extrair DNA genômico C. elegans que funciona bem para aplicações em sala de aula e pesquisa é relatado aqui. Este método de extração de DNA é otimizado para usar nematoides únicos ou algumas larvas tardias (L4) ou nematoides adultos como material inicial para a obtenção de um modelo confiável para executar PCR. Os resultados indicam que a qualidade do DNA é adequada para amplificar alvos genéticos de diferentes tamanhos por PCR, permitindo genotipagem de animais únicos ou alguns, mesmo em diluições a um cinquenta do DNA genômico de um único adulto por reação. Os protocolos relatados podem ser usados de forma confiável para produzir rapidamente o modelo de DNA a partir de uma única ou uma pequena amostra de C. elegans para aplicações baseadas em PCR.
Introdução
Aqui, dois protocolos relacionados são apresentados para a lise de caenorhabditis elegans para tornar o DNA acessível para aplicações baseadas em PCR. PCR é uma técnica molecular comumente usada para muitas aplicações, incluindo genotipagem e amplificação de fragmentos de DNA para clonagem e sequenciamento, entre outras. A pequena (1 mm), lombriga de vida livre C. elegans é um sistema animal popular para pesquisa biológica. Obter DNA genômico adequado de um único animal ou alguns animais é suficiente para amplificar a sequência por PCR. Larvas L4 tardias e adultos contêm apenas ~1.000 células somáticas (incluindo algumas células....
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Protocolo
1. C. elegans manutenção
NOTA: As cepas N2 (tipo selvagem) e blmp-1(tm548) C. elegans foram mantidas nas placas padrão de nematode growth media (NGM) a 20 °C.
- Prepare as placas de NGM dissolvendo 23,005 g de pó NGM em 973 mL de água em um frasco de 2 L. Cubra a abertura do frasco com papel alumínio (ou tampa autoclavável que permita a ventilação) e fixe a cobertura com fita autoclave. Autoclave para dissolver o pó e esterilizar o conteúdo com um ciclo de esterilização de pelo menos 30 min.
- Esfrie o médio a 60 °C em banho-maria.
- Ao meio resfriado, adicione 25 mL de fosfato esté....
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Resultados
O DNA genômico de um único ou alguns adultos do tipo selvagem foi extraído usando o kit comercial ou o protocolo tradicional de lise para comparar a eficácia desses dois métodos. Esses lises foram então usados como modelos para PCR para amplificar um alvo maior de ~2.100 bp (codificação blmp-1) ou um alvo menor de ~500 bp (codificando uma parte do sma-10). Ambos os métodos produziram com sucesso produtos PCR apropriados (Figura 1A).
Em seguida, f.......
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Discussão
Determinar os genótipos de C. elegans é um passo importante ao realizar cruzes genéticas para criar novas cepas de C. elegans . Extração genômica de DNA usando um único ou pouco C. elegans é um passo crucial na genotipagem C. elegans. Este protocolo descreve a extração genômica de DNA de C. elegans usando um kit comercial. Este método é rápido e funciona de forma robusta. O DNA genômico extraído usando este método pode ser usado para aplicações a jusante, incluindo genotipagem.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Agradecimentos
A cepa N2 e a bactéria E. coli OP50 foram obtidas do Centro genético de Caenorhabditis (CGC), que é financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). A cepa blmp-1(tm548) foi obtida do Projeto Nacional de Biorefonte, Japão. Os autores agradecem wormbase. Este trabalho foi apoiado pelo NIH R01GM097591 para t.L.G., financiamento interno da Texas Woman's University para t.L.G, e o Centro de Pesquisa estudantil da TWU para M.F.L.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| fita de autoclave | Defend | 43237-2 | |
| folha de alumínio, | Reynolds Wrap | 2182934 | |
| cloreto de cálcio | Millipore Sigma | 102382 (CAS 10035-04-8) | |
| Kit Extract-N-Amp (inclui Solução de Preparação de Tecidos, Solução de Extração e Solução de Neutralização) | Sigma-Aldrich Co. LLC | XNAT2-1KT | |
| Placa de aquecimento/agitador Isotemp | Fisher Scientific | 11-100-495H | |
| LB media, Lennox, | cápsulas MP Biomedicals, LLC | 3002-131 | |
| sulfato de magnésio, 97% puro, anidro | Microcentrífuga Thermo Scientific | AC413485000 (CAS 7487-88-9) | |
| Labnet | International, Inc. | PrismR, C2500-R | |
| NEB Q5U DNA polimerase de alta fidelidade de partida a quente | New England Biolabs, Inc. | M0515S | "Pol E" usado na Figura Suplementar S1, uma polimerase de alta velocidade e alta fidelidade (20– 30 s/kb) |
| Pó de mídia NGM | US Biological Life Sciences | N1000 | |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix com HF Buffer | New England Biolabs, Inc. | M0531S | "Pol D" na Figura 1B, uma polimerase de alta velocidade e alta fidelidade (15– 30 s/kb) |
| primers | Integrated DNA Technologies | oligos | |
| PrimeSTAR GXL polimerase | Takara Bio Inc. | R050B | "Pol C" na Figura 1B, uma polimerase de alta fidelidade (1 min/kb) para modelos ricos em GC e modelos de até 30 kb |
| Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0,1– 10.0 kb) | New England Biolabs, Inc. | N0550S | |
| SapphireAmp Fast PCR Master Mix | Takara Bio Inc. | RR350A | "Pol A" na Figura 1B, polimerase usada na Figura 1A, C, D, uma polimerase de alta velocidade (10 s/kb) para alvos de até 5 kb |
| Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix | Sigma-Aldrich Co. LLC | P4600 | "Pol B" na Figura 1B, uma polimerase (1 min/kb) para alvos de até 7 kb |
| Termociclador SimpliAmp | Applied Biosystems | A24812 | |
| barra de agitação | Fisher Scientific | 14-512-126 | |
| misturador de vórtice | Fisher Scientific | 2215365 | |
| picareta de minhoca | Genesee Scientific Corporation | 59-AWP |
Referências
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-31 (2015).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook (2007).
- Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H.
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Reimpressões e permissões
