Extração em pequena escala de Caenorhabditis elegans DNA genômico

Aqui, dois protocolos relacionados são apresentados para a lise de caenorhabditis elegans para tornar o DNA acessível para aplicações baseadas em PCR. PCR é uma técnica molecular comumente usada para muitas aplicações, incluindo genotipagem e amplificação de fragmentos de DNA para clonagem e sequenciamento, entre outras. A pequena (1 mm), lombriga de vida livre C. elegans é um sistema animal popular para pesquisa biológica. Obter DNA genômico adequado de um único animal ou alguns animais é suficiente para amplificar a sequência por PCR. Larvas L4 tardias e adultos contêm apenas ~1.000 células somáticas (incluindo algumas células multinucleares, poliploides), células germinativas, e (se o animal é uma hermafrodita gravid) prole no útero¹. No entanto, esses animais são protegidos por uma cutícula que deve ser interrompida para extrair o DNA genômico². Os métodos padrão para preparar o modelo de DNA genômico nematode para PCR envolvem múltiplas etapas e levam várias horas. Os animais são primeiro congelados em tampão de lise de verme contendo proteinase K (−70 °C ou abaixo) por pelo menos 15-45 min (mais tempo é recomendado por alguns protocolos)3,4,5,6. Este passo abre os animais.

Após o congelamento, os animais são incubados por 1h a 60-65 °C para o proteinase K funcionar, em seguida, a enzima é inativada por 15-30 min a 95 °C. O proteinase K destrói os núcleos que degradam o DNA. A inativação da proteinase K antes do PCR é importante para evitar que a proteinase K degrade a polimerase do DNA. Os dois protocolos baseados em kits descritos aqui são métodos rápidos, confiáveis e econômicos para extrair DNA genômico de um único animal ou alguns nematoides para pesquisas diárias e aplicações laboratoriais de ensino. O kit utilizado foi originalmente otimizado pelo fabricante para extrair DNA de tecido animal, saliva e cabelo⁷. Ele usa uma solução proprietária de preparação de tecidos e solução de extração para células de lise e torna o DNA genômico acessível. Uma solução proprietária de neutralização neutraliza então os componentes que podem inibir o PCR (por exemplo, sais, íons e moléculas de ligação Mg²⁺).

Ao genotipar, um único animal pode ser testado. Ao determinar se uma cepa é homozigosa, testar seis ou mais descendentes de um único animal dá alta confiança de que uma linha é homozigosa ou não (há uma chance de 0,02% de escolher aleatoriamente seis descendentes mutantes homozigos de um pai heterozigoso [(1/4)⁶ × 100% = 0,02%]). Este método 1) é simples, com menos passos do que o método proteinase K, e 2) diminui o tempo de preparação do modelo para 15 min. Os resultados deste trabalho demonstram que o protocolo desenvolvido funciona robustamente na extração de DNA genômico de um único ou poucos worms, que podem ser usados de forma confiável para aplicações a jusante que não requerem DNA altamente purificado, incluindo PCR.

1. C. elegans manutenção

NOTA: As cepas N2 (tipo selvagem) e blmp-1(tm548) C. elegans foram mantidas nas placas padrão de nematode growth media (NGM) a 20 °C.

1. Prepare as placas de NGM dissolvendo 23,005 g de pó NGM em 973 mL de água em um frasco de 2 L. Cubra a abertura do frasco com papel alumínio (ou tampa autoclavável que permita a ventilação) e fixe a cobertura com fita autoclave. Autoclave para dissolver o pó e esterilizar o conteúdo com um ciclo de esterilização de pelo menos 30 min.
2. Esfrie o médio a 60 °C em banho-maria.
3. Ao meio resfriado, adicione 25 mL de fosfato estéril de 1 M (KH₂PO₄), pH 6.0; 1 mL de solução de cloreto de cálcio de 1 M; e 1 mL de solução de sulfato de magnésio de 1 M.
4. Mexa o meio em uma placa de mexida magnética para obter uma mistura homogênea e para evitar o resfriamento e a solidificação irregulares (~5 min). Certifique-se de que a barra de rebuliço gire rápido o suficiente para criar um vórtice, mas não tão rápido que as bolhas sejam introduzidas (~250-300 rpm).
5. Despeje ~25 mL do meio em cada placa de Petri de 10 cm (~40 placas no total). Seque as placas à temperatura ambiente durante a noite (tipicamente 16-25 °C).
6. Cresça uma colônia de Escherichia coli OP50 em 30-50 mL de caldo LB durante a noite a 37 °C.
7. Semente cada placa com 500 μL de cultura E. coli OP50 e deixe-as secar em temperatura ambiente antes do uso (tipicamente 16-25 °C)⁸. Armazene as placas a 4 °C por até 3 semanas.
8. Transfira C. elegans para placas semeadas usando uma picareta de arame ou outro método e deixe-os crescer para L4 ou estágio adulto na temperatura necessária para a cepa (tipicamente 16-25 °C, 1-2 dias se os animais foram banhados famintos como dauers, 3-4 dias se os animais foram banhados como embriões)⁸.

2. Extração de DNA de um único verme

NOTA: Este método é útil para extrair DNA de um único verme (um verme em 1,8 μL de volume total). Uma mistura mestra pode ser feita se vários vermes serão lysed ao mesmo tempo.

1. Programe um termociclador para um ciclo a 55 °C por 10 min seguido de 95 °C para 3 min (programa de lise).
2. Alíquota 0,8 μL da solução de extração do kit para a parede interna de um tubo PCR de 0,2 mL no gelo. Adicione 0,2 μL da solução de preparação tecidual do kit à gota da solução de extração. Misture por pipetação.
3. Identifique um L4 ou um animal adulto sob um microscópio dissecando⁹. Para identificar hermafroditas L4, procure uma vulva característica que seja visível como um meio-círculo pálido no meio do animal. Identifique hermafroditas adultas procurando os maiores animais na placa que podem ter embriões ovais visíveis em seu útero.
4. Usando uma picareta de fio de platina, transfira o animal selecionado para a solução¹⁰.
5. Centrifugar o tubo brevemente (2-3 s, ≤6.000 rpm /2.000 × g) à temperatura ambiente para coletar o conteúdo na parte inferior do tubo.
6. Coloque o tubo no termociclador e execute o programa de lise definido na Etapa 2.1.
7. Quando o programa estiver completo, centrifufique brevemente o tubo e coloque-o no gelo. Adicione 0,8 μL da solução de neutralização do kit à mistura. Misture por pipetação.
8. Centrifugar o tubo brevemente à temperatura ambiente (2-3 s, ≤6.000 rpm /2.000 × g).
9. Use diretamente o lise para PCR ou armazene-o a 4 °C ou −20 °C para uso futuro.
   NOTA: O DNA extraído é estável a 4 °C ou -20 °C por pelo menos 6 meses⁷.

3. Extração de DNA de alguns indivíduos

NOTA: Este método é útil para extrair DNA de alguns vermes. Uma mistura mestra pode ser preparada se várias cepas serão líssedas ao mesmo tempo.

1. Programe o termociclador para um ciclo a 55 °C por 10 min seguido de 95 °C para 3 min (programa de lise).
2. Alíquota 2,0 μL da solução de extração do kit para a parede interna de um tubo PCR de 0,2 mL no gelo. Adicione 0,5 μL da solução de preparação tecidual do kit à solução de gotícula de extração. Misture por pipetação.
3. Identifique L4 ou animais adultos sob um microscópio de dissecação⁹. Hermafroditas L4 têm uma vulva característica que é visível como um meio-círculo pálido no meio do animal. Hermafroditas adultas são os maiores animais na placa e podem ter embriões ovais visíveis em seu útero.
4. Usando uma picareta de fio de platina, transfira alguns animais para a solução: 9 animais produzem 1 animal equivalente ao DNA genômico por 0,5 μL de lise, e 16 animais produzem ~1 animal equivalente ao DNA genômico em 0,25 μL (3,5 nematoides/μL)¹⁰.
   NOTA: É difícil transferir mais de 16 animais para este volume.
5. Centrifugar o tubo brevemente à temperatura ambiente (2-3 s, ≤6.000 rpm /2.000 × g).
6. Coloque o tubo no termociclador e execute o programa de lise definido na Etapa 3.1.
7. Quando o programa estiver completo, centrifufique brevemente o tubo e coloque-o no gelo. Adicione 2 μL da solução de neutralização do kit à mistura. Misture por pipetação.
8. Centrifugar o tubo brevemente à temperatura ambiente (2-3 s, ≤6.000 rpm /2.000 × g).
9. Use diretamente a lise para PCR ou armazene-a a 4 °C ou −20 °C para uso futuro.
   NOTA: O DNA extraído é estável a 4 °C ou -20 °C por pelo menos 6 meses⁷.

4. Reação do PCR

NOTA: Uma aplicação a jusante desta técnica de lise de verme, detectando uma mutação de exclusão usando uma polimerase rápida, é descrita. A eficácia dos dois protocolos de lise de vermes na produção de DNA de modelo genômico para PCR bem sucedido em diluições a 1/^{50 de} um worm por reação também é demonstrada.

1. Extrair DNA de um único verme e 16 vermes usando cepas de n2 e mutantes do tipo selvagem, como descrito acima no Passo 2 e Passo 3.
2. Prepare diluições de 2, 10, 20 e 50 vezes de DNA de um único verme de animais N2 selvagens.
3. Configure as reações do PCR seguindo o protocolo do fabricante usando primers específicos para a sequência de interesse e mix mestre pcr de início quente (Tabela 1 e Tabela 2). Use 1 μL de DNA não diluído ou 2 μL de DNA diluído como modelo em cada reação.
4. Confirme os produtos PCR por eletroforese de gel e imagem¹¹.

O DNA genômico de um único ou alguns adultos do tipo selvagem foi extraído usando o kit comercial ou o protocolo tradicional de lise para comparar a eficácia desses dois métodos. Esses lises foram então usados como modelos para PCR para amplificar um alvo maior de ~2.100 bp (codificação blmp-1) ou um alvo menor de ~500 bp (codificando uma parte do sma-10). Ambos os métodos produziram com sucesso produtos PCR apropriados (Figura 1A).

Em seguida, foi demonstrada a capacidade do DNA genômico extraído do kit para servir de modelo para uma variedade de polimerases de DNA. O DNA genômico extraído foi usado como modelo para amplificar um produto de 0,5 kb usando quatro polímerases que possuem diferentes capacidades (incluindo velocidade, fidelidade e tamanho do produto). Produtos de tamanhos esperados foram gerados por essas polimerases usando modelo de uma única lise adulta ou de uma lise de nove adultos (Figura 1B). A sequência de modelo e fidelidade das polimerases pcr para amplificar corretamente a sequência de modelos pode ser confirmada por sequenciamento (Figura Suplementar S1). Este resultado demonstra que o DNA genômico extraído dos protocolos do kit fornece um modelo adequado para uma gama de polímerases.

A eficácia do PCR foi testada utilizando diferentes concentrações do DNA genômico extraído de um único animal usando o kit comercial. O DNA foi diluído por 2,10, 20 ou 50 vezes, e o equivalente a cerca de metade, um décimo, um vigésimo e um quinquagésimo de um verme por reação foi usado para PCRs. Essas concentrações de modelo de DNA suportavam a amplificação de um alvo maior de ~2,1 kb ou um alvo menor de ~0,5 kb (Figura 1C)12. Enquanto observou-se um rendimento dependente da concentração de DNA do produto PCR de 0,5 kb, o rendimento do produto PCR de 2,1 kb apareceu equivalente em todas as reações.

Para demonstrar que esses protocolos produzem DNA genômico de C. elegans adequado para genotipagem pcr, o DNA genômico foi extraído de mutantes de tipo selvagem e 16 selvagens e blmp-1 (blmp-1(tm548)). O gene blmp-1 codifica um fator de transcrição com papéis importantes na migração de células de ponta distal, tamanho do corpo e desenvolvimento 12,13,14,15,16. O mutante BLMP-1 tem uma exclusão de 810 bp que remove partes do exon 3 e intron 315. Foram projetados primers que resultam em um produto de 2.134 bp quando o modelo de DNA do tipo selvagem é usado e um produto de 1.324 bp se o DNA blmp-1(-) for usado. Os produtos PCR dos tamanhos apropriados foram detectados usando 1 μL de um único verme (cerca de 0,5 vermes por reação) ou 16-wormsis de animais encenados L4 (3,5 vermes por reação) (Figura 1D). Este resultado mostra que o DNA genômico extraído do kit usando qualquer protocolo fornece modelos igualmente eficazes para linhas de PCR para genótipo.

Esses resultados mostram que as preparações genômicas de DNA de C. elegans usando um kit comercial de extração de DNA de tecido de animais únicos e múltiplos podem ser usadas de forma confiável como modelos para PCR.

Figura 1: Preparações de DNA utilizando um kit comercial de nematoides únicos e nematoides múltiplos permitem amplificação robusta por PCR. Os produtos PCR foram carregados em gel de 1% de agarose em 1x tampão TAE (5 μL (A,B) ou 10 μL (C,D) e executados em 90-100 V por 30 min a 2 h. Uma escada de DNA de 2 troncos foi usada para todos os géis. (A) Comparação da lise de DNA por kit com os métodos tradicionais proteinase K para criar modelo usando dois conjuntos de primer. Adultos do tipo selvagem foram lysed, e o equivalente a um animal foi usado como modelo para todas as reações. Pista 1-4, 2,1 kb produto. Faixa 1, PCR de lise de verme único por proteinase K. Lane 2, PCR de lise de verme único pelo método do kit. Pista 3, PCR de lysis de verme de nove vermes por proteinase K. Lane 4, PCR de lysis de verme de nove vermes pelo método do kit. Pista 5-8, 0,5 kb produto. Pista 5, PCR de lise de verme único por proteinase K. Lane 6, PCR de lise de verme único pelo método do kit. Raia 7, PCR de lysis de verme de nove vermes por proteinase K. Lane 8, PCR de lysis de verme de nove vermes pelo método do kit. (B) O método do kit para lise de DNA fornece um modelo adequado para PCR por múltiplas polimerases. Adultos do tipo selvagem foram lysed usando o método do kit, e o equivalente a metade de um animal foi usado como modelo PCR para um produto de 0,5 kb. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes de polimerase. Pista 1, PCR de uma única lise de verme com uma polimerase de alta velocidade. Pista 2, PCR de uma lise de nove vermes com uma polimerase de alta velocidade. Pista 3, PCR de uma única lise de verme com uma polimerase Taq . Pista 4, PCR de uma lise de nove vermes com uma polimerase Taq . Pista 5, PCR de uma única lise de verme com uma polimerase de alta fidelidade. Pista 6, PCR de uma lise de nove vermes com uma polimerase de alta fidelidade. Pista 7, PCR de uma única lise de verme com uma polimerase de alta velocidade e alta fidelidade. Pista 8, PCR de uma lise de nove vermes com uma polimerase de alta velocidade e alta fidelidade. (C) Diluições de uma lise de verme L4 tipo selvagem fornecem modelo para PCR. Pista 1-5, 2,1 kb produto. Pista 6-10, alvo de 0,5 kb. Pista 1 e pista 6, DNA não diluído. Pista 2 e pista 7, DNA 2 vezes diluído. Pista 3 e pista 8, DNA diluído 10 vezes. Pista 4 e pista 9, DNA diluído 20 vezes. Pista 5 e pista 10, DNA diluído 50 vezes. (D) Genotipagem do lócus blmp-1 por PCR usando 1 μL de preparações de DNA de um e 16 vermes como modelo. Faixa 1, PCR de lise de verme único tipo selvagem. Raia 2, PCR de blmp-1(-) lise de verme único. Pista 3, PCR de lise de vermes tipo selvagem 16. Raia 4, PCR de blmp-1(-) 16-worm lysis. Abreviaturas: prep = método de preparação; kb = quilobase; st. = estágio nematode; dil. = diluição do DNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Lista de primers.

Tabela 2: Componentes de reação do PCR.

Figura Suplementar S1: Sequenciamento para confirmação da qualidade do DNA genômico preparado com um kit comercial. Os resultados de duas reações de sequenciamento correspondem completamente à sequência esperada de mais de 1.600 nucleotídeos de DNA amplificados por uma polimerase de alta velocidade e alta fidelidade (Pol E) a partir de uma lise de 16 vermes (Tabela 1, Tabela 2A e Tabela 2D). As extremidades de leitura de sequenciamento foram aparadas para remover leituras básicas de baixa qualidade. O alinhamento foi realizado utilizando-se a ferramenta de alinhamento de sequência múltipla EMBL-EBI MUSCLE (MUltiple Sequence Comparison by Log-Expectation)17. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.