Organoides intestinais derivados da biópsia e tecnologias de órgãos em chips são combinados em uma plataforma microfisiológica para recapitular a funcionalidade intestinal específica da região.
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Artigo de método
Combinando organoides humanos e tecnologia organ-on-a-chip para modelar funcionalidade específica da região intestinal
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A mucosa intestinal é uma barreira física e bioquímica complexa que cumpre uma miríade de funções importantes. Permite o transporte, absorção e metabolismo de nutrientes e xenobióticos, facilitando uma relação simbiótica com a microbiota e restringindo a invasão de microrganismos. A interação funcional entre vários tipos celulares e seu ambiente físico e bioquímico é vital para estabelecer e manter a homeostase do tecido intestinal. Modelar essas interações complexas e a fisiologia intestinal integrada in vitro é um objetivo formidável com o potencial de transformar a forma como novos alvos terapêuticos e candidatos a medicamentos são descobertos e desenvolvidos.
Organoides e tecnologias organoides e organ-on-a-chip foram recentemente combinados para gerar chips intestinais relevantes para o homem adequados para estudar os aspectos funcionais da fisiologia intestinal e da fisiopatologia in vitro. Organoides derivados das biópsias do intestino delgado (duodeno) e intestino grosso são semeados no compartimento superior de um chip de órgão e, em seguida, expandem com sucesso como monocamadas, preservando as características celulares, moleculares e funcionais distintas de cada região intestinal. Células microvasculares microvasculares específicas do intestino humano são incorporadas no compartimento inferior do chip de órgão para recriar a interface epitelial-endotelial. Esta nova plataforma facilita a exposição luminal a nutrientes, drogas e microrganismos, permitindo estudos de transporte intestinal, permeabilidade e interações hospedeiro-micróbio.
Aqui, um protocolo detalhado é fornecido para o estabelecimento de chips de intestino representando o duodeno humano (chip duodeno) e cólon (chip de cólon), e sua cultura subsequente sob fluxo contínuo e deformações semelhantes à peristalse. Demonstramos métodos para avaliar o metabolismo de drogas e indução CYP3A4 no chip duodeno usando indutores e substratos prototípicos. Por fim, fornecemos um procedimento passo-a-passo para a modelagem in vitro de interferon gama (IFNγ)-mediado ruptura de barreira (síndrome do intestino vazado) em um chip de cólon, incluindo métodos para avaliar a alteração da permeabilidade paracelular, alterações na secreção de citocinas e perfil transcriômico das células dentro do chip.
Introdução
O intestino humano é um órgão complexo e multitarefa capaz de auto-regeneração. É dividido em intestino delgado e grande. A função primária do intestino delgado é digerir ainda mais os alimentos provenientes do estômago, absorver todos os nutrientes e passar o resíduo para o intestino grosso, que recupera a água e os eletrólitos. O intestino delgado é ainda dividido em múltiplas regiões anatomicamente distintas: o duodeno, jejunum e íleo, cada um dos quais é adaptado para executar funções específicas. Por exemplo, o duodeno ajuda a quebrar o chyme (conteúdo estomacal) para permitir a absorção adequada de nutrientes envolvendo proteínas, carboidratos, vitaminas e miner....
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Protocolo
NOTA: Todas as culturas celulares devem ser manuseadas usando uma técnica asséptica adequada.
Os organoides intestinais humanos empregados neste estudo foram obtidos pela Universidade Johns Hopkins e todos os métodos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos aprovados. Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Johns Hopkins University Institutional Review Board (IRB #NA 00038329).
1. Preparação dos reagentes da cultura celular
- Prepare o meio de crescimento organoide humano seguindo as instruções do fabricante (Tabela de Materiais) e suplem....
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Resultados
A Figura 1D resume a linha do tempo da cultura do chip intestinal e ilustra as células endoteliais intestinais e organoides antes e depois de semear o chip. Além disso, demonstra as distintas diferenças morfológicas entre o duodeno e os chips de cólon, destacados pela presença das formações semelhantes a villi no chip duodeno e representativa da pequena arquitetura intestinal.
Figura 3A,B demonstram as respostas de in.......
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Discussão
A combinação de tecnologia organ-on-a-chip e organoides intestinais promete modelagem precisa da fisiologia intestinal humana e da fisiopatologia. Aqui, fornecemos um protocolo passo a passo simples e robusto (delineado na Figura 1) para o estabelecimento do chip intestinal contendo epitélio intestinal pequeno ou colonico derivado da biópsia e células endoteliais microvasculares intestinais co-cultivadas em um dispositivo microfluido. Esta simulação baseada em chip do intestino humano incorp.......
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Divulgações
Gauri Kulkarni, Athanasia Apostolou, Lorna Ewart, Carolina Lucchesi e Magdalena Kasendra são atuais ou ex-funcionários da Emulate Inc. e podem deter capital próprio. A Emulate Inc. é a empresa que fabrica os dispositivos de chip de órgão e publicou patentes relevantes para o trabalho declarado neste artigo.
Agradecimentos
Agradecemos ao Professor Mark Donowitz por fornecer os organoides derivados da biópsia intestinal e Brett Clair por projetar as ilustrações científicas do chip, módulo portátil e cultural. Todas as outras ilustrações científicas foram geradas usando o BioRender.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| intestino delgado Células endoteliais microvasculares intestinais humanas | AlphaBioRegen | ALHE15 | 0,5 células M/ml ; cólon criopreservado |
| Células endoteliais microvasculares intestinais humanas | AlphaBioRegen | ALHE16 | 0,5 células M/ml ; |
| organoides duodenais humanos derivados de biópsia criopreservada | Universidade de John Hopkin | - | Os organoides foram fornecidos pelo professor Mark Donowitz (número do Conselho de Revisão Institucional: NA_00038329). |
| Organoides colônicos humanos derivados de biópsia | Universidade de John Hopkin-Os | organoides foram fornecidos pelo professor Mark Donowitz (número do Conselho de Revisão Institucional: NA_00038329). | |
| Zoë CM-1 e comércio; Módulo de Cultura | Emulate Inc. | - | Módulo de cultura |
| Orb-HM1™ Emular Módulo de Hub | Inc. | - | 5% de CO2, estiramento a vácuo e fonte de alimentação |
| Chip-S1™ Emulador de Chip Esticável | Inc. | - | Cápsula de Organ-Chip |
| ™ Módulos portáteis | Emulate Inc. | - | Módulo portátil |
| UV Light Box | Emulate Inc. | - | - |
| Chip Cradle | Emulate Inc. | - | 1 por prato de cultura quadrado |
| Filtros Steriflip®-HV EMD | Millipore | SE1M003M00 | 0.45 μ m Filtro PVDF |
| Prato Quadrado para Cultura de Células (120 x 120 mm) | VWR | 82051-068-Handheld | |
| aspirador aspirador | Corning | 4930 | - |
| Aspiração pipetas | Corning / Falcon | 357558 | 2 mL, poliestireno, individualmente Pontas de |
| aspiração | - | Estéril (autoclavado) | |
| Sorológico pipetas | - | 2 mL, 5 mL, 10 mL, e 25 mL Pipeta de baixa endotoxina, estéril | |
| P20 | P1000 e pipeta multicanal padrão | ||
| dicas | P20, P200, e Pág. 1000. | ||
| Tubos cônicos ( Proteína LoBind® Tubos) | Eppendorf | 0030122216; 0030122240 | Tubos de 15 mL, 50 mL |
| Eppendorf Tubos® lo-bind | Eppendorf | 022431081 | tubos de 1,5 mL |
| 96 poços placa de parede preta | - | para análise de permeabilidade epitelial | |
| Microscópio (com câmera) | - | Para campo claro imagem | |
| Banho-maria (ou contas) | - | Definido para 37° C | |
| Configuração de vácuo | - | - | Mínimo pressão: -70 kPa |
| Frascos | biotium | 220033 | |
| T75 Frascos | BD Falcon | 353136 | Frasco de cultura de células |
| Emular reagente-1 ( ER-1) | Emular Inc. | - | Solução de revestimento de chip |
| Emulate Reagent-2( ER-2) | Emular Inc. | - | Solução de revestimento de cavacos |
| Dulbecco' s PBS (DPBS) | Corning | 21-031-CV | 1X |
| Grau de Cultura de Células Água | Corning | MT25055CV | |
| Azul Trypan | Sigma | 93595 | Para contagem de células |
| TryplE Express | ThermoFisher Organoides | 12604013 | Científicos dissociação e células do endotélio destacamento solução |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher Científico | 12634028 | Médio |
| IntestiCult™ Meio de Crescimento Organoide (Humano) | Tecnologias de Células-Tronco | 06010 | Meio de Crescimento Organoide |
| Meio de Crescimento de Células Endoteliais MV 2 | Promocell | C-22121 | Meio Endotelial |
| Soro fetal bovino (FBS) | Sigma | F4135 | Soro |
| Primocin™ | Agente antimicrobiano | InvivoGen | ANT-PM-1 |
| Fator de Fixação™ | Cell Systems | 4Z0-210 | para frasco |
| Matrigel - Fator de Crescimento Reduzido | Corning | 356231 | Matriz de membrana basal solubilizada |
| Colágeno IV | Sigma | C5533 | Componente ECM |
| Fibronectina | Corning | 356008 | componente ECM |
| Y-27632 Tecnologias de | células-tronco | 72304 | suplemento de mídia organoide |
| CHIR99021 | Reprocell | 04-0004-10 | suplemento de mídia organoide |
| Solução de recuperação celular | Corning | 354253 | Basement mebrane matrix dissociationsolution |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Sigma | A9576 | 30%, |
| Grau de cultura de células | Corning | MT25055CV | Estéril, Água |
| DMSO | Sigma | D2650 | solvente |
| 3KDa Dextran Cascade Blue | Invitrogen | D7132 | 10 mg em pó |
| Rifampicina (RIF) | Sigma | Cat# R3501 | Indutor de CYP |
| Hidrato de testosterona | Sigma | T1500 | Substrato CYP |
| 1,25-di-hidroxi Vitamina D3 (VD3) | Sigma | Cat# D1530 | Indutor de CYP |
| Acetonitrila com 0,1% (v/v) de ácido fórmico | Sigma | 159002 | Solução de parada |
| LCMS IFN e gama; | Peprotech | 300-02 | |
| 4% Paraformaldeído (PFA) | EMS | 157-4 | Fixativo |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Soro de Burro Normal (NDS) | Sigma | 566460 | |
| anti-Oclusina | ThermoFisher Marcador de | junções apertadas | 33-1500 |
| anti-Claudin 4 | ThermoFisher Marcador de | junções apertadas | 36-4800 |
| anti-E-caderina | Abcam | ab1416 | junções de aderentes epiteliais |
| anti-VE-caderina | Abcam | ab33168 | marcador de junções aderentes endoteliais |
| anti- Zonula Occludens 1 (ZO-1) | Thermo Fischer | 339194 | marcador de junções apertadas |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | mancha nuclear |
| 2-mercaptoetanol | Sigma | M6250 | |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183020 | kit de lise, isolamento e purificação de RNA |
| SuperScript™ IV VILO™ Kit de | transcriptase reversa | Invitrogen | 11756050 |
| TaqMan™ Fast Advanced Master Mix | Applied Biosystems | 4444557 | reagente qPCR |
| QuantStudio™ 5 Sistema de PCR em Tempo Real | Applied Biosystems | A28573 | Ciclador de PCR em tempo real |
| 18S primer | ThermoFisher Scientific | Hs99999901_s1 | Eukaryotic 18S rRNA |
| CYP3A4 primer | ThermoFisher Scientific | Hs00604506_m1 | Citocromo família 3 subfamília A membro 4 |
| Pierce™ Kit de ensaio Coomassie Plus (Bradford) | ThermoFisher Scientific | 23236 | Kit de quantificação de proteínas |
| Tampão de lise MSD Tris | Meso Scale Diagnostics | R60TX-3 | Tampão de lise de proteína |
| Cleaved/Total Caspase-3 Kit de lisado de células inteiras | Meso Scale Diagnostics | K15140D | Kit de detecção de caspase 3 |
| Painel de lesões vasculares V-PLEX 2 Kit humano | Meso Scale | Diagnostics K15198D | |
| V-PLEX Painel Pró-inflamatório Humano II (4-Plex) | Meso Scale Diagnostics | K15053D | |
| Zeiss LSM 880 | Microscópio Zeiss-Confocal | ||
| Zeiss LD plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27 | Zeiss-20X | lentes objetivas de longa distância | |
| Zeiss AXIOvert.A1 | Zeiss-Microscópio | de | campo claro |
| Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1 | Lentes objetivas Zeiss-10X |
Referências
- Fritz, A., et al. Expression of clinically relevant drug-metabolizing enzymes along the human intestine and their correlation to drug transporters and nuclear receptors: An intra-subject analysis. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 124 (3), 245-255 (2019).
- Okumura, R., Takeda, K.
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Reimpressões e permissões
