O presente protocolo descreve o método de criação de insetos de peste tortricida nos laboratórios. Os procedimentos para distinguir o sexo dos insetos e extrair ácidos nucleicos para sequenciamento de alto rendimento são estabelecidos usando duas pragas tortricidas.
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Artigo de método
Criação em massa e estudos moleculares em insetos de peste de Tortricidae
Neste artigo
Resumo
Resumo
O tortricidae (Lepidoptera), comumente conhecido como tortrix ou mariposas de rolo compressor, compreende muitas pragas agrícolas e florestais, que causam sérias perdas agrícolas. Para entender a biologia dessas mariposas de pragas, técnicas fundamentais têm sido de alta demanda. Aqui, métodos para criação em massa, observações e estudos moleculares são desenvolvidos usando duas tortrix de chá, Homona magnanima e Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae). Os insetos foram criados em massa com dieta artificial fatiada e mantidos pela endogamia por mais de 100 gerações, considerando suas características biológicas. Insetos têm vários dimorfismos sexuais; portanto, é difícil distinguir o sexo durante os estágios de desenvolvimento, que impediram ensaios subsequentes. O presente trabalho destacou que o sexo das larvas de tortricóides poderia ser determinado observando testículos ou coloração de orceina láctica-actic para visualizar o cromossomo W específico feminino. Além disso, utilizando os métodos de determinação sexual, o presente estudo possibilitou extrações de ácido nucleico a partir de embriões determinados por sexo e aplicação para sequenciamento de alto rendimento. Essas dicas são aplicáveis para outros insetos pragas e facilitarão estudos morfológicos e genéticos.
Introdução
Os insetos lepidopteranos representam mais de 10% de todas as espécies vivas descritas1, e certas espécies de taxas causam danos graves às plantas e graves perdas agrícolas 2,3. Embora estudos moleculares e genéticos tenham sido desenvolvidos usando insetos modelo, como o bicho-da-seda Bombyx mori 4,5, os insetos pragas permanecem sem investigação, em parte devido às dificuldades para criar e manusear 6,7. Portanto, estudos e técnicas fundamentais são necessário....
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Protocolo
1. Coleta de insetos e criação em massa
- Coletar insetos tortricídeos de campos após referênciaspublicadas anteriormente 8,12.
NOTA: As larvas H. magnanima e A. honmai são coletadas de folhas de chá danificadas (Figura 1A); adultos são atraídos usando luz UV portátil de 4 W (comprimento de onda de 365 nm, ver Tabela de Materiais, Figura 1B). - Colete as larvas coletadas (Figura 1C,D) individualmente em um pedaço de dieta artificial em....
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Resultados
Estabelecimento de linhas de hospedagem e sua manutenção
A viabilidade das larvas coletadas em campo é diferentemente atribuída à localização do campo, estações e condições de criação (por exemplo, 90% da viabilidade em Taiwan, Taoyuan, como mostrado em Arai et al.12). Aproximadamente 30%-50% dos pares gerarão a próxima geração como de costume. Para H. magnanima e A. honmai, as matrilinas foram mantidas por endogamia por mais de 100 gerações.
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Discussão
O tortrida compreende várias pragas agrícolas e florestais; o presente estudo apresentou métodos para retrocoterar ao longo de gerações, observar a embriogênese e o sexo dos insetos e realizar análises moleculares utilizando embriões maduros.
Um dos obstáculos para o estudo de insetos de pragas é estabelecer métodos de criação. Especialmente, a endogamia às vezes afeta negativamente a aptidão da espécie. A redução do condicionamento físico pelo inerido, chamada de depressão endogamia, tem sido.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores desejam reconhecer o apoio da Sociedade japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS) Bolsas de Pesquisa para Jovens Cientistas [Grant Number 19J13123 e 21J00895].
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Copo de 1/2 onça | FP CHUPA | CP070009 | criação de insetos; tampa de copo de https://www.askul.co.jp/p/6010417/ |
| 1/2 onça | FP CHUPA | CP070011 | criação de insetos; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether |
| 99,7% de ácido acético | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japão | 36289 | fixação; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | não mostrado | Quantificação de ácidos nucleicos; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument |
| Agilent RNA6000 nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | Quantificação de ácidos nucleicos; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG |
| solução de cloreto de benzalcônio | Nihon Pharmaceutical Co., Ltd | No.4987123116046 | Esterilização; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html |
| Algodão | AOUME | 8-1611-02 | insetos; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1 |
| solução DAPI | Dojindo, Tóquio, Japão | 340-07971 | colorações; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/ |
| Hidrogenofosfato dissódico | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Na2HPO4; |
| https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html kit de quantificação dsDNA HS | Invitrogen | Q33231 | Quantificação de ácidos nucleicos; coluna |
| https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230 Econospin RNA II | Epoch Life Science Inc. | EP-11201 | Extração de RNA; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx |
| Etanol FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japão | 4.98748E + 12 | fixação; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html | |
| Ácido etilenodiamina-N, N, N', N'-tetraacético Sal tetrassódico tetrahidratado (4NA) | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E + 12 | Tampão de lise celular (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html |
| Papel glassine | HEIKO | 2100010 | criação de insetos; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla& utm_medium=cpc& utm_source= Bloco |
| de calor Adw WSC-2620 PowerBLOCK | ATTO, Tóquio, Japão | 4002620 | incubação; https://www.attoeng.site/ |
| heptano | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japão | 4.98748E+12 | fixação; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html |
| INSECTA LF | Nosan Co., Ltd | não mostrado | Dieta artificial; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| ISOGENII | Nippon Gene | 311-07361 | Extração de RNA; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html |
| isopropanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E + 12 | extração de ácidos nucléicos; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html |
| Ácido láctico | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E + 12 | Manchas; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html |
| metanol FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japão | 4.98748E + 12 | fixação; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html | |
| MSV-3500 vórtice | Biosan | BS-010210-TAK | Misturador Voltex; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/ |
| Nano Fotômetro NP 80 | Implen | não mostrado | Quantificação de ácidos nucléicos; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/ |
| Embalagem natural ampla | Inomata química | 1859 | de insetos; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3% 82%A4%E3%83%89 |
| NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit para preparação da biblioteca Illumina | New England BioLabs | E7770S | ; https://www.nebj.jp/products/detail/2039 |
| orceína | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | colorações; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html |
| químicos Co. de FUJIFILM Wako do paraformaldeído. | 160-16061 | fixação; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html | |
| Polioxietileno (20) Monolaurato de Sorbitano | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tween-20; Luz |
| negra UV portátil https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html (comprimento de onda 4W, 365nm) | Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japão | não mostrado | Coleção de insetos; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328 |
| Cloreto de potássio | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html |
| Dihidrogenofosfato de potássio | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen, miliampère, EUA | P36965 | antifade; Solução de |
| proteinase K | Merck | 71049-4CN | ; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049 |
| solução de precipitação de proteínas | Qiagen | 158912 | extração de DNA; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC |
| Qubit V4 | Invitrogen | Q33238 | Quantificação de ácidos nucleicos; |
| https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238 rifampicina | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japão | 4.98748E+12 | Esterilização; Kit de |
| quantificação de RNA HS | Invitrogen | Q32855 | Quantificação de ácidos nucleicos; solução de |
| RNase | Nippon Gene | 313-01461 | Extração de RNA; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html |
| Silk Mate 2S | Nosan Co., Ltd | não mostrado | Dieta artificial; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| Cloreto de sódio | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html |
| químicos Co. de FUJIFILM Wako do | sulfato do Dodecil do sódio | 4.98748E+12 | Tampão de lise celular (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html |
| solução aquosa de hipoclorito de sódio | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japão | 4.98748E+12 | separação de ovos; Cloridrato de |
| tetraciclina | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japão | 4.98748E+12 | Esterilização; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html |
| Tris-HCl | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E + 12 | Tampão de lise celular; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html |
| água destilada ultrapura | Invitrogen | 10977023 | extração de RNA; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015 |
Referências
- Gaston, K. J. The magnitude of global insect species richness. Conservation Biology. 5 (3), 283-296 (1991).
- Pogue, M. A world revision of the genus Spodoptera Guenée (Lepidoptera: Noctuidae). Memoirs of the American Entomological Society<....
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Reimpressões e permissões
