Summary
通过应用微机电系统技术制造了新开发的具有氧化石墨烯窗口的微图案芯片,实现了各种生物分子和纳米材料的高效和高通量低温电子显微镜成像。
Abstract
使用低温电子显微镜(cryo-EM)对生物分子进行高效和高通量结构分析的一个主要限制是难以制备具有纳米级冰厚度控制的冷冻-EM样品。硅(Si)基芯片具有规则的微孔阵列,氧化石墨烯(GO)窗口图案化在厚度可控氮化硅(SixNy)薄膜上,是通过应用微机电系统(MEMS)技术开发的。采用紫外光刻、化学气相沉积、薄膜干湿蚀刻、二维纳米片材料滴铸等手段,大规模生产了带有GO窗口的微图案芯片。微孔的深度被调节以根据需要控制冰层厚度,具体取决于用于冷冻电镜分析的试样的大小。GO对生物分子的有利亲和力在冷冻-EM样品制备过程中将感兴趣的生物分子集中在微孔内。带有GO窗口的微图案芯片可实现各种生物分子以及无机纳米材料的高通量冷冻电镜成像。
Introduction
低温电子显微镜(cryo-EM)已被开发用于解析蛋白质在其天然状态下的三维(3D)结构1,2,3,4。该技术涉及将蛋白质固定在玻璃体冰的薄层(10-100nm)中,并使用透射电子显微镜(TEM)获取随机定向蛋白质的投影图像,并将样品保持在液氮温度下。获取数千到数百万张投影图像,并通过计算算法5,6用于重建蛋白质的3D结构。为了使用冷冻电镜进行成功分析,冷冻样品制备已经通过对控制印迹条件、湿度和温度的设备进行一次冷冻而实现了自动化。将样品溶液加载到具有孔碳膜的TEM网格上,依次吸墨以除去多余的溶液,然后用液体乙烷暴冻以产生薄的玻璃体冰1,5,6。随着冷冻电镜的进步和样品制备7的自动化,冷冻电镜越来越多地用于解决蛋白质的结构,包括病毒包膜蛋白和细胞膜中的离子通道蛋白8,9,10。致病性病毒颗粒的包膜蛋白结构对于了解病毒感染病理学以及开发诊断系统和疫苗(例如导致COVID-19大流行的SARS-CoV-2 11)非常重要。此外,冷冻电镜技术最近已应用于材料科学,例如用于对电池12,13,14和催化系统14,15中使用的光束敏感材料进行成像,以及分析溶液态16中无机材料的结构。
尽管冷冻电镜和相关技术有了明显的发展,但冷冻样品制备存在局限性,阻碍了高通量3D结构分析。制备具有最佳厚度的玻璃体冰膜对于获得具有原子分辨率的生物材料的3D结构尤为重要。冰必须足够薄,以尽量减少被冰散射的电子的背景噪声,并禁止沿电子束路径1,17的生物分子重叠。然而,如果冰太薄,它会导致蛋白质分子以优选的方向排列或变性18,19,20。因此,玻璃体冰的厚度应根据目标材料的尺寸进行优化。此外,通常需要花费大量精力来制备样品,并在制备的TEM网格上手动筛选冰和蛋白质的完整性。这个过程非常耗时,这阻碍了其高通量3D结构分析的效率。因此,提高冷冻电镜样品制备的可靠性和再现性将提高冷冻电镜在结构生物学和商业药物发现以及材料科学中的利用率。
在这里,我们介绍了用于制造具有氧化石墨烯(GO)窗口的微图案芯片的微加工工艺,该窗口设计用于具有受控冰厚度21的高通量冷冻电镜。微图案芯片是使用微机电系统(MEMS)技术制造的,该技术可以根据成像目的操纵芯片的结构和尺寸。带有GO窗口的微图案芯片具有微孔结构,可以填充样品溶液,并且可以调节微孔的深度以控制玻璃体的冰的厚度。GO对生物分子的强亲和力增强了生物分子的浓度,用于可视化,提高了结构分析的效率。此外,微图案芯片由Si框架组成,为网格19提供高机械稳定性,使其成为在样品制备程序和冷冻电镜成像期间处理芯片的理想选择。因此,通过MEMS技术制造的带有GO窗口的微图案芯片为冷冻电镜样品制备提供了可靠性和再现性,从而实现基于冷冻电镜的高效和高通量结构分析。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 带GO窗口的微图案芯片的制造(图1)
- 沉积氮化硅。
- 在 170 sccm 二氯氢硅烷(SiH 2 Cl 2,DCS)和 38 sccm 氨 (NH 3) 的流量下,在 830 °C 和 150 mTorr 的压力下,在硅晶片的两侧(直径 4 英寸,厚度为100 μm)使用低压化学气相沉积 (LPCVD) 在硅晶片的两侧(Si x Ny)沉积低应力氮化硅 (SixNy)。
- 使用~30 Å/min的沉积速率,通过改变沉积时间将SixNy 厚度控制在25-100 nm以内。
注意:处理硅晶片时应格外小心,因为晶片非常薄且易碎。注意不要在处理或装载晶圆到设备中时弯曲晶圆。
- 图案化光刻胶。
- 在SixNy沉积的Si晶圆上涂上六甲基二硅氮烷(HMDS)溶液,其体积足以覆盖晶圆的整个表面,用旋转涂布机以3,000 rpm的速度旋转涂层30秒,并在95°C的热板上烘烤30秒,以使晶圆表面具有疏水性,从而确保使用光刻胶(PR)具有良好的涂层性能。
- 应用正PR(材料表),其体积足以覆盖晶圆的整个表面,以3,000 rpm旋转涂层30秒,并在热板上以100°C烘烤90秒。旋涂PR的厚度为500 nm。
- 使用对准器将PR涂层的晶圆用紫外线(365nm波长和20 mW / cm2强度)暴露5秒,通过铬掩模(图2A-D)。
- 使用显影剂(材料表)开发PR1分钟,并通过将其浸入去离子(DI)水中2x来冲洗晶圆。通过将N2 气体吹到晶圆表面上来完全干燥PR图案晶圆。
注意:将N2 气体吹到硅晶圆上时应格外小心,因为晶圆非常薄且易碎。不要在垂直于晶圆的方向上以高压吹入N2 气体,因为这可能会导致晶圆断裂。
- 图案化硅xNy。
- 使用实验室构建的反应离子蚀刻机(RIE)在PR图案化之后蚀刻暴露的SixNy ,其中3 sccm六氟化硫(SF6)气体,射频(RF)功率为50 W。这些设置的蚀刻速率为~6 Å/s。根据沉积的SixNy 层的厚度设置蚀刻时间。
注意:蚀刻速率可能会有所不同,需要根据所用RIE设备的规格进行实验室优化。 - 通过将SixNy 图案晶圆在室温下浸入丙酮中30分钟,然后通过将晶圆浸入去离子水中2x来冲洗晶圆来消除PR。通过将N2 气体吹到晶圆表面上完全干燥晶圆。
注意:从溶液中浸入或取出晶圆时应格外小心,因为晶圆可能因溶液的表面张力而断裂。不要浸入或取出平行于溶液表面的晶圆。使用带碳纤维尖端的精密晶圆处理镊子。不要用镊子强烈抓住威化;抬起晶圆的一侧,直到晶圆倾斜到一定角度,在那里它可以从溶液中取出。晶圆在抬起过程中由于牢固的抓地力而弯曲时可能会断裂。
- 使用实验室构建的反应离子蚀刻机(RIE)在PR图案化之后蚀刻暴露的SixNy ,其中3 sccm六氟化硫(SF6)气体,射频(RF)功率为50 W。这些设置的蚀刻速率为~6 Å/s。根据沉积的SixNy 层的厚度设置蚀刻时间。
- 蚀刻硅。
- 通过将KOH粉末溶解在80°C的去离子水中来制备1.5M氢氧化钾(KOH)溶液。
- 将SixNy 图案化晶圆浸入KOH溶液中以蚀刻暴露的Si.将晶圆留在溶液中搅拌,直到可以在图案化SixNy 的另一侧观察到独立的SixNy窗口。
注意:湿法蚀刻时间可能因Si的厚度而异;对于100μm厚的晶圆,湿法蚀刻通常需要几个小时。在Si蚀刻过程中不要将搅拌速度设置得太高,因为独立的SixNy 窗口非常薄,并且可能因流体的流动而断裂。在该实验中,搅拌速率设置为250rpm。 - 通过将蚀刻的晶圆浸入DI水浴中多次来清洁蚀刻晶圆,以消除蚀刻残留物。在空气中干燥威化饼。
注意:从溶液中浸入或取出Si图案晶圆时应格外小心,因为独立的SixNy 窗口非常薄且易碎,并且可能因溶液的表面张力而断裂。晶圆应以一定角度浸没或取出,使晶圆的边缘首先进入和退出溶液。
- 消除 KOH 蚀刻残留物。
- 用镊子轻轻按压芯片阵列的边界,以获得将进行微图案化的芯片阵列(图1B)。
- 在80°C搅拌下制备1.5 M KOH溶液。
- 将芯片阵列浸入KOH溶液中30秒,然后将其浸入去离子水中2倍进行冲洗。通过吹入N2 气体完全干燥切屑。
注意:将芯片浸入溶液中并用N2 气体吹干时应格外小心,因为独立式SixNy 窗口非常薄且易碎。当芯片浸入KOH溶液中时,应停止搅拌。切屑的边缘应首先沿垂直于溶液的方向浸渍,并在平行方向上用N2 气体吹扫。 - 将芯片阵列在空气中完全干燥至少1小时。
- 为公关设置模式。
- 准备一个空白的525μm Si晶圆作为固体支撑。如上所述,用HMDS和正PR旋转涂覆硅晶圆,但在烘烤PR之前,将芯片阵列(独立式SixNy 窗口面朝上)连接到硅晶片上。PR充当晶圆和芯片阵列之间的粘合剂。将附着在芯片阵列上的硅晶片在100°C下在热板上烘烤90秒。
- 如上所述,用HMDS和正向PR旋转涂层芯片组。
- 使用对准器将芯片组与紫外光(365 nm波长;20 mW/cm 2强度)通过铬掩模(图2E,F)暴露5秒。
- 使用显影剂开发 PR 15 秒,将芯片组浸入 DI 水 2 倍冲洗,然后吹 N2 气体使 PR 图案芯片组完全干燥。
- 准备微图案的硅xNy。
- 使用实验室制造的RIE在PR图案化之后蚀刻SixNy,在50 W的RF功率下使用3 sccm SF6气体。
- 消除公关。
- 通过将图案化的芯片集浸入60°C的1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)溶液中并使其过夜来消除PR。将芯片组浸入 DI 水 2x 中冲洗,然后吹 N2 气体使图案芯片组完全干燥。
- 使用100 sccm O2 气体,在150 W的射频功率下,使用O2 等离子体工艺消除PR残留物,使用实验室构建的RIE进行1分钟。
- 冲洗微图案芯片。
- 在80°C下制备1.5 M KOH溶液。
- 将微图案芯片浸入KOH溶液中30秒,以完全消除PR残留物,并通过将其浸入去离子水中2x来冲洗芯片。通过吹入N2 气体完全干燥切屑。
- 将芯片在空气中完全干燥至少1小时。
- 通过滴铸法转移氧化石墨烯(GO)。
- 用去离子水将GO溶液(2毫克/毫升)稀释至0.2毫克/升,超声处理10分钟,以分解GO片的聚集体。将稀释的GO溶液以300× g 离心30秒。
- 辉光放电微图案芯片的Si蚀刻侧,使用辉光放电器(材料表)在15 mA下使芯片表面充满正电荷,持续1分钟。
- 将3μLGO溶液滴入微图案芯片的辉光放电侧,并将滴剂留在芯片上1分钟。1分钟后,用滤纸吸走芯片上多余的GO溶液。
- 用石蜡膜上制备的去离子水滴清洗GO转移芯片,并用滤纸吸走芯片上的去离子水。在GO传输侧重复此过程2x,在另一侧重复1x。将GO转移芯片在室温下干燥过夜。
- 将微图案芯片浸入去离子水中,用GO窗口清洗微图案芯片,并用N2 气体吹干芯片。
2. 冷冻电镜成像
- 准备冷冻样品。
- 使用控制温度、湿度、印迹时间和力的机械式低温浸入机(材料表)制备冷冻样品。将吸墨垫装入吸水器后,确保腔室中的湿度和温度分别保持在100%和15°C。
- 用典型的冷冻镊子拾取微图案芯片,并将镊子装载到冷冻跳入机中。将3μL样品溶液移液到孔图案侧的微图案芯片上,底部有GO窗口。根据样品溶液控制印迹时间和力。
注意:这里,生物标本,即人类免疫缺陷病毒(HIV-1),铁蛋白,蛋白酶体26S,groEL,阿伏铁蛋白颗粒和tau丝蛋白用于冷冻电镜成像。此外,还使用了各种类型的无机材料,如Fe2O3 纳米颗粒(NP),Au纳米颗粒,Au纳米棒和二氧化硅纳米颗粒,用于冷冻电镜成像。对于不同类型的样品,在冷冻柱塞上设置所需的印迹时间和力。 - 印迹过程结束后,立即将装入样品的芯片在液体乙烷中浸入冷冻。将芯片转移到液氮(LN2)中的网格盒中,并在冷冻电镜成像之前将其储存在LN2 中。
- 进行冷冻电镜成像。
- 将冷冻样品加载到冷冻电镜支架上,温度保持在-180°C。
- 将冷冻电镜支架装入TEM中,并以最小剂量系统(MDS)模式观察样品。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
通过MEMS制造和二维GO纳米片转移制备了带有GO窗口的微图案芯片。用于微图案化的芯片被批量生产,从一个4英寸的晶圆中生产了大约500个芯片(图1B和图2A,B)。在光刻过程中,可以使用铬掩模的不同设计(图2)来操纵微图案芯片的设计。制造的微图案芯片具有独立式SixNy膜的受控数量和尺寸。独立式Si x Ny膜的数量控制在48(6x8)至50(5 x 10)之间,尺寸控制在50 x 40μm2至250 x 40μm2(图3A,B,F,G)。每个独立的SixNy膜可以有数十到数百个微孔,直径范围为2-3μm,具有不同的孔间距。制造的微图案芯片具有多达约25,000个GO悬浮孔,而孔的数量也是可控的(图3B-D和图3G-I)。通过拉曼光谱和电子衍射证实了整个空穴中薄GO层的存在。GO窗口的拉曼光谱显示了GO的代表性峰,即1360 cm-1和1590 cm-1的D和G波段,分别为22(图3E)。乘向六边形衍射图案表示窗口由多层GO组成(图3J)。
在LPCVD过程中,通过控制SixNy 在Si晶圆上的沉积厚度,在3个代表性目标深度(25 nm、50 nm和100 nm)中制备了具有GO窗口的微图案芯片,以确认调节微孔深度的可行性。为了评价GO窗口微孔的结构和厚度,获得了带有GO窗口的微图案芯片的40°倾斜和横截面扫描电子显微镜(SEM)图像和原子力显微镜(AFM)图像。清楚地观察到具有GO窗口的微孔的井型结构,微孔的深度对应于目标深度(图4)。结果证实,控制带有GO窗口的微图案芯片的数量和设计是可能的。
为了演示微图案芯片在冷冻电镜成像中的应用,使用微图案芯片制备了各种生物分子和无机NP的冷冻样品。对于生物标本,使用带有GO窗口的微图案芯片用冷冻电镜对HIV-1,铁蛋白,蛋白酶体26S,groEL,嗜铁蛋白颗粒和tau丝蛋白进行成像(图5A-F)。除生物分子外,还使用微图案芯片通过冷冻电镜观察了Fe2O3 NPs,Au NPs,Au纳米棒和二氧化硅NP等无机材料(图5G-J)。
图 1:新开发的带有低温电镜GO窗口的微图案芯片制造过程的示意图和图像。 (A)制造过程中带有GO窗口的微图案芯片的制造工艺和横截面的原理图。(B)每个制造步骤的制造产品的图像。 请点击此处查看此图的大图。
图 2:用于光刻工艺的铬掩模的简要说明 (A,B) 用于大规模生产 4 英寸 Si 晶圆芯片(24 x 24 芯片阵列)的掩模设计、2 x 2 芯片阵列的 (C,D) 设计和 (E,F) 微孔图案设计。 请点击此处查看此图的大图。
(A,F)整个微图案芯片的光学显微镜图像,(B,G)单个微图案SixNy膜的SEM图像,(C,H)微图案的SEM图像,以及(D,I)具有GO窗口的单个微孔的SEM图像。(英、日)通过(E)拉曼光谱和(J)GO窗口的选定区域电子衍射(SAED)图案确认GO处的GO。请点击此处查看此图的大图。
图4:具有GO窗口的微孔的井结构和深度(A-C)具有GO窗口的单个微孔的40°倾斜SEM图像,以及(D-F)具有不同深度(25 nm,50 nm和100 nm)的微图案芯片的横截面SEM图像。(G)原子力显微镜(AFM)3D渲染图像,(H)AFM偏转图像,以及(I)沿红线的线轮廓(H)显示微图案芯片的深度,带有GO窗口,由100nm SixNy膜制成。请点击此处查看此图的大图。
图5:使用带有GO窗口的微图案芯片的各种尺寸的生物材料和无机纳米材料的冷冻电镜图像。 (A)HIV-1病毒颗粒,(B)铁蛋白,(C)蛋白酶体26S,(D)groEL,(E)阿珀里汀,(F)tau蛋白(箭头表示纤维化的tau蛋白),(G)Fe2O3 NP,(H)Au NP,(I)Au纳米棒和(J)二氧化硅NP。 请点击此处查看此图的大图。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
这里介绍了用于生产带有GO窗口的微图案芯片的微加工工艺。制造的微图案芯片旨在通过根据要分析的材料的大小,通过GO窗口控制微孔的深度来调节玻璃体冰层的厚度。使用一系列MEMS技术和2D纳米片转移方法制造了具有GO窗口的微图案芯片(图1)。使用MEMS制造技术的主要优点是其大规模生产能力,以及在光刻过程中使用不同设计的铬掩模来操纵微芯片结构和尺寸的可行性(图2)。低应力的LPCVD沉积SixNy 层确保了数十纳米厚的独立式SixNyy 23,24,25,26的稳定性。然而,纳米级独立式SixNy 层仍然容易受到垂直方向27的力的影响。因此,在处理微图案芯片时需要格外小心,例如浸入溶液或吹干时。此外,微图案芯片的制造工艺使用100μm Si晶圆,这确保了与大多数冷冻电镜试样夹具和自动加载机的兼容性。然而,在制造过程中需要谨慎,以防止脆弱的晶圆破裂。
用光学显微镜和SEM确认了具有GO窗口的微米级孔型结构规则阵列(图3和图4)。此外,用于转移GO的滴铸方法使GO沉积具有高平整度且无明显皱纹(图3D,E,I,J)。微图案芯片适合在冷冻电镜自动加载机中加载,并且在规则阵列中具有数万微米级的孔,可以自动收集大型图像数据以进行单个颗粒分析。此外,SixNy膜和GO支持的微孔的数量和形貌可以在MEMS制造过程中轻松操纵,从而可以根据研究目的进行高通量单颗粒分析和其他冷冻电镜成像实验。此外,通过制造具有纳米级图案孔的芯片,可以促进具有受控厚度的微图案芯片的扩展应用。半导体工业中开发的纳米图案化技术可以用于制造这些芯片28,29,30。
通过制造具有GO窗口的微图案芯片,在三个代表性的目标深度(25 nm,50 nm和100 nm)中,已经证明了调节微孔深度的能力。通过控制Si晶片上SixNy 层的沉积时间,实现了微孔结构的不同深度(图4)。为了评估带有GO窗口的微图案芯片的形态和厚度,用SEM观察从聚焦离子束(FIB)切片获得的器件的横截面,并用AFM测量深度剖面(图4)。在扫描电镜和AFM图像中清晰地显示了带有GO窗口的微孔的井型结构,证实了SixNy 微孔深度的成功控制和GO窗口的转移。使用带有GO窗口的可定制微图案芯片可能会确保在生产用于冷冻电镜成像的最佳冰厚度区域的高成功率。
由于用冷冻电镜观察的材料具有不同的尺寸,因此生产具有适当厚度的玻璃体冰可以确保增强的对比度分辨率,宽的定向覆盖范围以及减少冷冻电镜成像期间结构的变性。为了证明冷冻电镜成像工艺在生物应用中的使用,使用带有GO窗口的微图案芯片对不同尺寸的各种生物样品(包括HIV-1,铁蛋白,蛋白酶体26S,groEL,阿伏铁蛋白和tau蛋白)进行了成像。使用具有GO窗口的微图案芯片清楚地观察到生物分子(图5A-F)。除生物分子外,还使用具有GO窗口的微图案芯片观察了各种类型的无机纳米材料,例如Fe2O3 NPs,Au纳米棒和二氧化硅NP(图5G-J)。微图案芯片和制备方法显示出与各种材料冷冻成像的兼容性。因此,新开发的具有GO窗口的微图案芯片为使用冷冻电镜进行高效和高通量结构分析提供了可靠且可重复的样品制备策略。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
医学硕士、高级硕士、法学硕士和日本特许厅感谢基础科学研究所的财政支持(资助号:10099)。伊巴斯-R006-D1)。S.K.,M.L.和J.P.感谢首尔国立大学(2021年)的创造性先锋研究人员计划的财政支持以及韩国政府资助的NRF赠款(MSIT;授权号NRF-2020R1A2C2101871 和 NRF-2021M3A9I4022936)。M.L.和J.P.感谢浦项制铁TJ公园基金会浦项制铁科学奖学金的财政支持和韩国政府资助的NRF赠款(MSIT;授予编号NRF-2017R1A5A1015365)。J.P.感谢韩国政府资助的NRF赠款的财政支持(MSIT;授予编号NRF-2020R1A6C101A183),以及首尔国立大学工程学院和医学院的跨学科研究计划(2021)。M.-H.K.感谢由韩国政府资助的NRF赠款的财政支持(MSIT;授予编号NRF-2020R1I1A1A0107416612)。作者感谢首尔大学高分子和细胞成像中心(SNU CMCI)的工作人员和工作人员对冷冻电镜实验的不懈努力和坚持不懈。作者感谢国家大学间研究设施中心的S.J.Kim对FIB-SEM实验的帮助。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP) | Sigma Aldrich, USA | 443778 | |
Acetone | |||
AFM | Park Systems, South Korea | NX-10 | |
Aligner | Midas System, South Korea | MDA-600S | |
AZ 300 MIF developer | AZ Electronic Materials USA Corp., USA | 184411 | |
Cryo-EM holder | Gatan, USA | 626 single tilt cryo-EM holder | |
Cryo-plunging machine | Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA | Vitrobot Mark IV | |
Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM) | FEI Company, USA | Helios NanoLab 650 | |
Glow discharger | Ted Pella Inc., USA | PELCO easiGlow | |
Graphene oxide (GO) solution | Sigma Aldrich, USA | 763705 | |
Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+% | Alfa Aesar, USA | 10226590 | |
Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD) | Centrotherm, Germany | LPCVD E1200 | |
maP1205 positive PR | Micro resist technology, Germany | A15139 | |
Potassium hydroxide (KOH), flake | DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea | 6597-4400 | |
Raman Spectrometer | NOST, South Korea | Confocal Micro Raman System HEDA | |
Reactive ion etcher (RIE) | Scientific Engineering, South Korea | Lab-built | |
SEM | Carl Zeiss, Germany | SUPRA 55VP | |
Si wafer | JP COMMERCE, South Korea | 4" Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um | |
Spin coater | Dong Ah Trade Corp., South Korea | ACE-200 | |
TEM | JEOL, Japan | JEM-2100F |
References
- Dillard, R. S., et al. Biological applications at the cutting edge of cryo-electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 24 (4), 406-419 (2018).
- Meyerson, J. R., et al. Self-assembled monolayers improve protein distribution on holey carbon cryo-EM supports. Scientific Reports. 4, (2014).
- Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).
- Xu, B. J., Developments Liu, L. applications, and prospects of cryo-electron microscopy. Protein Science. 29 (4), 872-882 (2020).
- Stewart, P. L. Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews-Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (2), (2017).
- Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
- Darrow, M. C., et al. Chameleon: next generation sample preparation for cryoEM based on spotiton. Acta Crystallographica a-Foundation and Advances. 75, 424 (2019).
- Hite, R. K., Tao, X., MacKinnon, R. Structural basis for gating the high-conductance Ca2+-activated K+ channel. Nature. 541 (7635), 52-57 (2017).
- Zhang, Y., et al. Cryo-EM structure of the activated GLP-1 receptor in complex with a G protein. Nature. 546 (7657), 248-253 (2017).
- Shaik, M. M., et al. Structural basis of coreceptor recognition by HIV-1 envelope spike. Nature. 565 (7739), 318-323 (2019).
- Liu, C., et al. The architecture of inactivated SARS-CoV-2 with postfusion spikes revealed by cryo-EM and cryo-ET. Structure. 28 (11), 1218-1224 (2020).
- Ren, X. C., Zhang, X. Q., Xu, R., Huang, J. Q., Zhang, Q. Analyzing energy materials by cryogenic electron microscopy. Advanced Materials. 32 (24), 1908293 (2020).
- Li, Y. Z., et al. Atomic structure of sensitive battery materials and Interfaces revealed by cryo-electron microscopy. Science. 358 (6362), 506-510 (2017).
- Li, Y. B., Huang, W., Li, Y. Z., Chiu, W., Cui, Y. Opportunities for cryogenic electron microscopy in materials science and nanoscience. Acs Nano. 14 (8), 9263-9276 (2020).
- Kim, Y., et al. Uniform synthesis of palladium species confined in a small-pore zeolite via full ion-exchange investigated by cryogenic electron microscopy. Journal of Materials Chemistry A. 9 (35), 19796-19806 (2021).
- Baumgartner, J., et al. Nucleation and growth of magnetite from solution. Nature Materials. 12 (4), 310-314 (2013).
- Rice, W. J., et al. Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 38-44 (2018).
- D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
- Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918 (2019).
- Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).
- Kang, M. H., et al. Graphene oxide-supported microwell grids for preparing cryo-EM samples with controlled ice thickness. Advanced Materials. 33 (43), 2102991 (2021).
- Johra, F. T., Lee, J. W., Jung, W. G. Facile and safe graphene preparation on solution based platform. Journal of Industrial and Engineering Chemistry. 20 (5), 2883-2887 (2014).
- Yang, C., Pham, J. Characteristic study of silicon nitride films deposited by LPCVD and PECVD. Silicon. 10 (6), 2561-2567 (2018).
- Olson, J. M. Analysis of LPCVD process conditions for the deposition of low stress silicon nitride. Part I: preliminary LPCVD experiments. Materials Science in Semiconductor Processing. 5 (1), 51-60 (2002).
- Zheng, B. R., Zhou, C., Wang, Q., Chen, Y. F., Xue, W. Deposition of low stress silicon nitride thin film and its application in surface micromachining device structures. Advances in Materials Science and Engineering. 2013, 835942 (2013).
- Chuang, W. H., Fettig, R. K., Ghodssi, R. An electrostatic actuator for fatigue testing of low-stress LPCVD silicon nitride thin films. Sensors and Actuators a-Physical. 121 (2), 557-565 (2005).
- Shafikov, A., et al. Strengthening ultrathin Si3N4 membranes by compressive surface stress. Sensors and Actuators a-Physical. 317, 112456 (2021).
- Ng, W. H., et al. Controlling and modelling the wetting properties of III-V semiconductor surfaces using re-entrant nanostructures. Scientific Reports. 8, 3544 (2018).
- Han, D., et al. Nanopore-templated silver nanoparticle arrays photopolymerized in zero-mode waveguides. Frontiers in Chemistry. 7, 216 (2019).
- Escobedo, C. On-chip nanohole array based sensing: a review. Lab Chip. 13, 2445-2463 (2013).