A espectroscopia de força de conjunto (EFS) é uma técnica robusta para desdobramento mecânico e detecção em tempo real de um conjunto de estruturas biomoleculares em campos biofísicos e de biossensoriamento.
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Artigo de método
Espectroscopia de Força de Ensemble por Forças de Cisalhamento
Neste artigo
Resumo
Resumo
Técnicas de molécula única baseadas em princípios de fluorescência e mecanoquímicos fornecem sensibilidade superior em sensoriamento biológico. No entanto, devido à falta de recursos de alto rendimento, a aplicação dessas técnicas é limitada em biofísica. A espectroscopia de força de conjunto (EFS) demonstrou alto rendimento na investigação de um conjunto maciço de estruturas moleculares, convertendo estudos mecanoquímicos de moléculas individuais em conjuntos moleculares. Neste protocolo, as estruturas secundárias do DNA (i-motivos) foram desdobradas no fluxo de cisalhamento entre o rotor e o estator de uma ponta do homogeneizador a taxas de cisalhamento de até 77796/s. Os efeitos das taxas de fluxo e tamanhos moleculares sobre as forças de cisalhamento experimentadas pelo motivo i foram demonstrados. A técnica EFS também revelou a afinidade de ligação entre i-motivos de DNA e ligantes. Além disso, demonstramos uma reação química de clique que pode ser acionada por força de cisalhamento (ou seja, química de clique mecano). Esses resultados estabelecem a eficácia do uso da força de cisalhamento para controlar a conformação de estruturas moleculares.
Introdução
Na espectroscopia de força de molécula única1 (SMFS), as propriedades mecânicas de estruturas moleculares individuais têm sido estudadas por instrumentos sofisticados como o microscópio de força atômica, pinças ópticas e pinças magnéticas 2,3,4. Restrito pelo mesmo requisito de direcionalidade das moléculas nas configurações de geração/detecção de força ou pelo pequeno campo de visão em pinças magnéticas e no microscópio de força de centrífuga em miniatura (MCF)5,6,7,8,
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Protocolo
NOTA: Todos os tampões e os reagentes químicos utilizados neste protocolo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação do microscópio de força de cisalhamento
NOTA: O microscópio de força de cisalhamento contém duas partes, uma unidade de reação (homogeneizador) e uma unidade de detecção (microscópio de fluorescência). A ampliação da ocular é de 10x, e a ampliação da lente objetiva (ar) é de 4x.
- Monte o homogeneizador e o microscópio em uma mesa de montagem. Use óculos e ligue o microscópio de fluorescência e, em seguida, ajuste o homogeneizador para garantir qu....
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Resultados
A Figura 1 descreve o desdobramento mecânico e a detecção em tempo real das moléculas do conjunto no EFS. Na Figura 1B, observou-se que a intensidade de fluorescência do DNA i-motif aumentou com a taxa de cisalhamento variando de 9.724 s−1 a 97.245 s−1 em um tampão MES de pH 5,5. Como controle, a intensidade da fluorescência não foi aumentada quando o mesmo DNA i-motif foi cortado a uma taxa de 63.209 s−1 em um t.......
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Discussão
O protocolo descrito neste manuscrito permite a investigação em tempo real do desdobramento de um conjunto de estruturas biomoleculares por força de cisalhamento. Os resultados aqui apresentados ressaltam que as estruturas do i-motivo do DNA podem ser desdobradas pela força de cisalhamento. O desdobramento do i-motivo ligado ao ligante e as reações de clique acionadas por força de cisalhamento foram aplicações de prova de conceito para este método de espectroscopia de força de conjunto.
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse.
Agradecimentos
Este trabalho de pesquisa foi apoiado pela National Science Foundation [CBET-1904921] e pelos Institutos Nacionais de Saúde [NIH R01CA236350] para H. M.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 3K MWCO Amicon | Millipore Sigma | ufc900324 | |
| Ácido ascórbico | VWR | VWRC0143-100G | |
| Calfluor 488 azida | Click Chemistry Tools | 1369-1 | |
| CuCl | Thermo | ||
| Ponta de dispersão | Suíça | PT-DA07 / 2EC-B101 | |
| DNA oligos | IDT | ||
| Dye | IDT | / 5Cy5 / | |
| Microscópio de fluorescência | Janpan | Nikon TE2000-U | |
| Homogeneizador | Suíça | PT 3100D | |
| HPG | Santa Cruz Biotecnologia | cs-295271 | |
| KCl | VWR | VWRC26760.295 | |
| MES | VWR | VWRCE169-500G | |
| Quencher | IDT | / 3IAbRQSp / | |
| TBTA | Tokyo Chemical Industry | T2993 | |
| Tris | VWR | VWRCE133-100G |
Referências
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: Optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Woodside, M. T., et al.
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Reimpressões e permissões
