Este protocolo descreve um método para estabelecer e executar um ensaio de arranhão em monocamadas bidimensionais (2D) derivadas de enteróides tridimensionais (3D) isolados de íleo de primatas não humanos.
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Artigo de método
Efeito do ácido hialurônico 35 kDa em um modelo in vitro de lesão e cicatrização do intestino delgado prematuro usando monocamadas derivadas de enteróides
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Ensaios de feridas de arranhões in vitro são comumente usados para investigar os mecanismos e características da cicatrização epitelial em uma variedade de tipos de tecidos. Aqui, descrevemos um protocolo para gerar uma monocamada bidimensional (2D) a partir de enteroides de primatas não humanos tridimensionais (3D) derivados de criptas intestinais do íleo terminal. Essas monocamadas derivadas de enteroides foram então utilizadas em um ensaio de arranhão in vitro para testar a capacidade do hialuronano 35 kDa (HA35), um HA de leite humano, para promover a migração e proliferação celular ao longo da borda da ferida epitelial. Após o cultivo das monocamadas até a confluência, elas foram raspadas manualmente e tratadas com HA35 (50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL) ou controle (PBS). A migração celular e a proliferação para a lacuna foram fotografadas usando um microscópio de luz transmitida equipado para imagens de células vivas. O fechamento da ferida foi quantificado como porcentagem de cicatrização de feridas usando o Wound Healing Size Plugin no ImageJ. A área de arranhão e a taxa de migração celular e a porcentagem de fechamento da ferida foram medidas ao longo de 24 h. O HA35 in vitro acelera a cicatrização de feridas em monocamadas enteroides do intestino delgado, provavelmente através de uma combinação de proliferação celular na borda da ferida e migração para a área da ferida. Esses métodos podem potencialmente ser usados como um modelo para explorar a regeneração intestinal no intestino delgado humano prematuro.
Introdução
A enterocolite necrosante (NEC) é uma das emergências gastrointestinais mais comuns em prematuros1. A doença é caracterizada por inflamação intestinal grave que pode se deteriorar rapidamente para necrose intestinal, sepse e potencialmente morte. Embora a etiologia não seja clara, as evidências sugerem que a NEC é multifatorial e o resultado de uma complexa interação de alimentação, colonização bacteriana anormal e epitélio intestinal imaturo 2,3. Prematuros apresentam aumento da permeabilidade intestinal, colonização bacteriana anormal e baixa capacidade regenerativa de enterócitos
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Protocolo
Todos os procedimentos em animais neste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro de Ciências da Saúde da Universidade de Oklahoma. Após aprovação institucional, amostras de conveniência fetal do intestino delgado de um primata não humano prematuro (PNH, gestação de 90%, babuíno-oliva, Papio anubis) foram obtidas após eutanásia para um estudo separado (Protocolo nº 101523-16-039-I)20.
1. Estabelecimento de enteróides intestinais 3D de primatas não humanos prematuros
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NOTA: A mídia pode ser preparada até 1 seman....
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Resultados
Os efeitos do AH no reparo tecidual e cicatrização de feridas em vários tecidos e órgãos estão bem documentados; no entanto, os efeitos específicos do AH com um peso molecular de 35 kDa na cicatrização e regeneração do intestino delgado fetal ou neonatal são atualmente desconhecidos. Para testar a capacidade do HA35 de promover a cicatrização de feridas em um modelo do intestino delgado fetal ou neonatal, geramos enteroides intestinais 3D a partir do tecido ileal NHP e dissociamos ainda mais esse tecido em células únicas.......
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Discussão
O trato gastrointestinal de um prematuro está sob pressão regenerativa contínua de exposições repetidas a insultos ambientais associados à disbiose, metabólitos e toxinas bacterianas inflamatórias e hipóxia intermitente23,24. Infelizmente, o epitélio intestinal do prematuro é incapaz de estabelecer rapidamente a integridade funcional23, resultando em disfunção de barreira, aumento da permeabilidade intestinal e, em casos graves, inflamação.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar e nenhum conflito de interesses.
Agradecimentos
Este conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde. HC é apoiado pela concessão P20GM134973 dos Institutos Nacionais de Saúde. A KB é apoiada por uma doação da Children's Hospital Foundation (CHF) e da Presbyterian Health Foundation (PHF). Os serviços de imagem de células vivas fornecidos pelo núcleo de Genômica Funcional do Câncer foram apoiados em parte pelo National Institute of General Medical Sciences Grant P20GM103639 e pelo National Cancer Institute Grant P30CA225520 dos Institutos Nacionais de Saúde, concedido ao Centro de Ciências da Saúde Stephenson da Universidade....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Pipeta Sorológica de 10 mL | Fisher Scientific | 13-675-49 | |
| 100x21mm Prato, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 172931 | |
| Tubo cônico de 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| 24-Well, TC-Treated, Placa de Fundo Plano | Corning | 3524 | |
| 37 µ Filtro de Células Reversível M | STEMCELL Technologies | 27215 | |
| Tubo cônico de 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| 70 µ m Filtros de Células Estéreis | Fisher Scientific | FB22-363-548 | |
| Albumina, Bovino (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| CellTiter-Glo Ensaio de Viabilidade de Células 3D | Promega | G9681 | |
| Meio de Eagle Modificado de Dulbecco/Nutriente Mistura de Presunto F-12 (DMEM-F12) com tampão HEPES de 15 mM | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| Gentle Cell Reagente de dissociação | STEMCELL Technologies | 100-0485 | |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov/ij/ | |
| Incucyte S3 Instrumento de Análise de Células Vivas | Sartorius | 4647 | |
| Módulo de Software de Análise de Feridas por Arranhões Incucitários | Sartorius | 9600-0012 | |
| Meio de Crescimento Organoide IntestiCult (Humano) | STEMCELL Technologies | 06010 | Este é o HOGMY, mas sem o Y-27632 ou antibióticos. Também usado como base para HOGM, mas faltando apenas os antibióticos. |
| Lipopolissacarídeos de Escherichia coli O111:B4, purificados por cromatografia de filtração em gel | Millipore Sigma | L3012-10MG | |
| Matrigel Redução do fator de crescimento (TFG), | de Corning | Nunc | |
| MicroWell 96 poços, Nunclon tratado com delta, microplaca de fundo plano | ThermoFisher Scientific | 136101 | |
| PBS (solução salina tamponada com fosfato), 1X [-] Cálcio, Magnésio, pH 7,4 | Corning | 21-040-CM | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Este é um antibiótico de amplo espectro |
| Hialuronato de sódio, grau de pesquisa, HA20K | Lifecore Biomedical | HA20K-1 | |
| TC20 Contador de células automatizado | Empresa: Bio-Rad | 1450102 | |
| Tripsina-EDTA 1X, 0,25% de tripsina | Fisher Scientific | MT25053CI | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 |
Referências
- Lemons, J. A., et al. Very low birth weight outcomes of the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network, January 1995 through December 1996. Pediatrics. 107 (1), 1(2001).
- Burge, K., Vieira, F., Eckert, J., Chaaban, H.
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Reimpressões e permissões
