O estudo da cicatrização de feridas associadas à lesão musculoesquelético muitas vezes requer a avaliação de interações in vitro entre células schwann (SCs), queratinócitos e fibroblastos. Este protocolo descreve o isolamento, acultura e a caracterização dessas células primárias do prepúcio humano.
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Artigo de método
Isolamento, cultura e caracterização de células primárias de schwann, queratinócitos e fibroblastos de Foreskin Humano
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este protocolo descreve métodos de isolamento, condições de cultivo e caracterização de células primárias humanas com alto rendimento e viabilidade usando rápida dissociação enzimática da pele. Queratinócitos primários, fibroblastos e células Schwann são todos colhidos do prepúcio de recém-nascido humano, que está disponível seguindo o padrão de procedimentos de cuidado. A pele removida é desinfetada, e a gordura subcutânea e músculo são removidos usando um bisturi. O método consiste na separação enzimática e mecânica de camadas epidérmicas e dérmicas, seguida de digestão enzimática adicional para obter suspensões unicelulares de cada uma dessas camadas de pele. Finalmente, as células únicas são cultivadas em meios de cultura celular apropriados seguindo protocolos padrão de cultura celular para manter o crescimento e a viabilidade ao longo de semanas. Em conjunto, este protocolo simples permite o isolamento, acultura e a caracterização dos três tipos de células a partir de um único pedaço de pele para avaliação in vitro de modelos de nervo da pele. Além disso, essas células podem ser usadas juntas em co-culturas para medir seus efeitos uns sobre os outros e suas respostas ao trauma in vitro na forma de arranhões realizados roboticamente na cultura associada à cicatrização de feridas.
Introdução
As células primárias derivadas do tecido vivo e cultivadas sob condições in vitro se assemelham muito ao estado fisiológico1, tornando-as um modelo ideal para investigar processos fisiológicos e fisiofósicos. A pele contém vários tipos de células, incluindo queratinócitos, fibroblastos, sebocítos, melanócitos e células schwann (SCs), que podem ser isoladas e cultivadas para experimentos in vitro . Não foram descritos métodos para isolar e cultivar queratinócitos, fibroblastos e SCs, de um único pedaço de pele. O objetivo deste protocolo é duplo: 1) estabelecer um método confiável e reprodutível para o isolamento e cultivo de S....
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Protocolo
A aquisição e o uso de tecido foreskin humano desidentificado para fins de pesquisa foram revisados e receberam a determinação de "não pesquisa humana" pelo Penn State College of Medicine Institutional Review Board (IRB #17574).
NOTA: Seguindo o protocolo abaixo, 2,4 x 106 queratinócitos, 4,4 x 106 fibroblastos e 1,1 x 106 SCs são obtidos de um único prepúcio. Em geral, essas células primárias podem ser usadas para 3 passagens, dependendo das condições experimentais.
1. Isolamento das células primárias e condições culturais
- Procedimento de separação de e....
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Resultados
O prepúcio neonatal normal foi utilizado para o isolamento de queratinócitos epidérmicos primários e SCs e fibroblastos dérmicos. As células primárias isoladas foram cultivadas em suas respectivas mídias de cultura celular contendo fatores de crescimento. Após a semeadura de SCs e fibroblasto em frascos de cultura, a maioria das células aderiu ao fundo do frasco dentro de 2 h. No caso dos queratinócitos, a maioria dos queratinócitos aderiu por 24h. Os queratinócitos primários epidérmicos isolados atingiram 85% de confluê.......
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Discussão
Este protocolo descreve um método para isolar três populações de células distintas de um único pedaço do prepúcio, ou seja, queratinócitos, fibroblastos e células Schwann. Existem alguns protocolos de isolamento disponíveis para isolar queratinócitos e fibroblastos 2,3,5,6, mas nenhum descreve o isolamento de SC. Além das principais células estruturais da pele, queratinócitos e fibroblastos, a.......
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Divulgações
Todos os outros autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Fadia Kamal e ao Dr. Reyad Elbarbary por nos permitir usar instrumentos de laboratório e suporte técnico. Este trabalho foi apoiado por subvenções do NIH (K08 AR060164-01A) e do DOD (W81XWH-16-1-0725) a J. C. E. além do apoio institucional do Centro Médico Hershey da Universidade Estadual da Pensilvânia.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,22 µ M filtros estéreis (Unidade de Filtro de Seringa Millex-GP, polietersulfona) | MilliporeSigma | SLGPR33RS | |
| 70 µ Filtros de células M | CELLTREAT | 229483 | |
| 100 µ Filtros de células M | CELLTREAT | 229485 | |
| Seringas descartáveis de 1 mL | BD Luer-Lok | BD-309659 | |
| Seringas descartáveis de 5 mL (Seringa estéril, uso único) | BD Luer-Lok | BD309646 | |
| Seringas descartáveis de 10 mL | BD Luer-Lok | BD305462 | |
| 1% TritonX-100 | Sigma | X100-1L | Preparado no momento do uso |
| 4% solução de paraformaldeído | ThermoFisher Scientific | J19943. K2 | Pronto para usar e armazenar a 4 ° C |
| 5% BSA | Sigma | A7906-100G | Preparado no momento do uso |
| 70% etanol | Pharmco | 111000200 | |
| Antibiótico | ScienCell Research | 503 | |
| Chemometec Vial1- | Fisher Scientific | NC1420193 | |
| Collagenase | Gibco | 17018-029 | |
| Coverslip | Fisherbrand | 12544D 22*50-1.5 | |
| Dispase I | Sigma-Aldrich | D46693 | |
| DMEM meio basal | ScienCell Research | 9221 | |
| salina tamponada com fosfato de Dulbecco livre de Ca2+ e Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-031-CV) | |
| Nunc 15 mL Tubos de centrífuga cônicos estéreis de polipropileno | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
| Nunc Tubos de centrífuga cônicos estéreis de polipropileno 50 mL | ThermoFisher Scientific | 339653 | |
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL | Fisherbrand | 02-681-5 | |
| Soro fetal bovino (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10082147 | |
| Meio completo de fibroblastos | ScienCell Research | 2331 | |
| IgG de cabra anti-camundongo (H + L) Anticorpo secundário altamente adsorvido de cabra, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | Diluição (1: 500) |
| Anticorpo secundário de cabra anti-Rabbit IgG (H + L) de adsorção cruzada, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Diluição (1: 500) |
| Solução salina tamponada de Hanks (tampão HBSS) | Lonza | CC-5022 | |
| Prepúcio | Tecido de prepúcio humano não identificado para fins de pesquisa (Conselho de Revisão Institucional - IRB # 17574). | ||
| Meio de queratinócitos KGM-GOLD (KGM ouro e suplementos) | Lonza | 00192151 e 00192152 | |
| anticorpo de actina de músculo liso alfa de camundongo | ThermoFisher Scientific | 14-9760-82 | Diluição (1:200) |
| Anticorpo de citoqueratina14 de camundongo | Abcam | ab7800 | Diluição (1:100) |
| Anticorpo S100 de camundongo | ThermoFisher Scientific | MA5-12969 | Diluição (1:200) |
| Multi câmara (4 poços de lâmina de vidro) | Tab-Tek | 154526 | |
| NucleoCounter -Via1- | Chemometec | 941-0012 | |
| Poly-L-Lysisne (PLL) | ScienCell Research | 32503 | |
| ProLong Gold Anti-fade Mountant com DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Rabbit K10 anticorpo | Sigma-Aldrich | SAB4501656 | Diluição (1:100) |
| Anticorpo p75-NTR de coelho | Millipore | AB1554 | Diluição (1:500) |
| Vimentina de coelho | ProteinTech | 10366-1-AP | Diluição (1:200) |
| Meio de cultura de células Schwann | ScienCell Research | 1701 | |
| Pinças de precisão DUMONT retas com pontas extra finas Dumostar, 5 | ROTH | LH75.1 | Esterilizar com álcool 70% antes de usar |
| Tesoura IRIS, afiada / afiada. Comprimento 4– 3/8"(111mm) | Codman | 54-6500 | Esterilize com álcool 70% antes de usar |
| Lâmina cirúrgica esterilizada - afiada (Lâminas de Borda Única Econômica Duro) | Empresa de lâminas de barbear | 94-0120 | Esterilize com álcool 70% antes de usar |
| Frasco de cultura T25 | Corning | 353109 | |
| Tampão de neutralização de tripsina (TNS) | Lonza | CC-5002 | |
| Tripsina / EDTA | Microscópio invertido Lonza | CC-5012 | |
| ZEISS | Axio Observer 7- Axiocam 506 mono - ndash; Microscópio Apotome.2 | Para imunofluorescência de lâmina de câmara contendo células coradas | |
| Microscópio invertido | ZEISS | Primovert | Para visulaizar/observar a fixação ou descolamento de células |
Referências
- Hawksworth, G. M. Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies. Human & Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).
- Green, H., Kehinde, O., Thomas, J.
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Reimpressões e permissões
