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Artigo de método

Isolamento, cultura e caracterização de células primárias de schwann, queratinócitos e fibroblastos de Foreskin Humano

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DOI:

10.3791/63776

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23 de março de 2022

 ,  ,  , 
1Department of Orthopaedics and Rehabilitation, Center for Orthopaedic Research and Translational Science (CORTS), The Pennsylvania State University College of Medicine, 2Department of Dermatology, The Pennsylvania State University College of Medicine

Neste artigo

Resumo

O estudo da cicatrização de feridas associadas à lesão musculoesquelético muitas vezes requer a avaliação de interações in vitro entre células schwann (SCs), queratinócitos e fibroblastos. Este protocolo descreve o isolamento, acultura e a caracterização dessas células primárias do prepúcio humano.

Resumo

Este protocolo descreve métodos de isolamento, condições de cultivo e caracterização de células primárias humanas com alto rendimento e viabilidade usando rápida dissociação enzimática da pele. Queratinócitos primários, fibroblastos e células Schwann são todos colhidos do prepúcio de recém-nascido humano, que está disponível seguindo o padrão de procedimentos de cuidado. A pele removida é desinfetada, e a gordura subcutânea e músculo são removidos usando um bisturi. O método consiste na separação enzimática e mecânica de camadas epidérmicas e dérmicas, seguida de digestão enzimática adicional para obter suspensões unicelulares de cada uma dessas camadas de pele. Finalmente, as células únicas são cultivadas em meios de cultura celular apropriados seguindo protocolos padrão de cultura celular para manter o crescimento e a viabilidade ao longo de semanas. Em conjunto, este protocolo simples permite o isolamento, acultura e a caracterização dos três tipos de células a partir de um único pedaço de pele para avaliação in vitro de modelos de nervo da pele. Além disso, essas células podem ser usadas juntas em co-culturas para medir seus efeitos uns sobre os outros e suas respostas ao trauma in vitro na forma de arranhões realizados roboticamente na cultura associada à cicatrização de feridas.

Introdução

As células primárias derivadas do tecido vivo e cultivadas sob condições in vitro se assemelham muito ao estado fisiológico1, tornando-as um modelo ideal para investigar processos fisiológicos e fisiofósicos. A pele contém vários tipos de células, incluindo queratinócitos, fibroblastos, sebocítos, melanócitos e células schwann (SCs), que podem ser isoladas e cultivadas para experimentos in vitro . Não foram descritos métodos para isolar e cultivar queratinócitos, fibroblastos e SCs, de um único pedaço de pele. O objetivo deste protocolo é duplo: 1) estabelecer um método confiável e reprodutível para o isolamento e cultivo de SCs dérmicas e 2) para utilizar um método eficiente e robusto para o isolamento de queratinócitos, fibroblastos e SCs de um único prepúcio humano.

Atualmente, existem protocolos estabelecidos para isolar os queratinócitosda pele 2,3,4 e os fibroblastos 5,6. Esses estudos descrevem o isolamento de queratinócitos, fibroblastos ou ambos da pele, mas nenhum protocolo aborda como estabelecer culturas de SCs primários da pele humana. Estudos recentes sugerem que as SCs neuronais modulam os processos celulares querat e fibroblasto e regulam as funções fisiológicas normais da pele7. As SCs são, portanto, críticas à homeostase da pele e contribuem substancialmente para a fisiologia regular que influencia o comportamento dos tipos de células da pele vizinhas presentes8. Portanto, um protocolo que permite o isolamento de cada um desses tipos de células é ideal para experimentos in vitro envolvendo comunicação celular-célula ou conversa cruzada entre tipos de células.

Este protocolo descreve o estabelecimento de culturas celulares individuais de células primárias a partir de um único pedaço de pele. Este protocolo é particularmente útil quando a quantidade de tecido disponível é limitada. Além disso, o isolamento de todos os três tipos de células de um único doador permite comparações robustas entre tipos de células ou experimentos de co-cultura, ao mesmo tempo em que mitiga a influência da genética durante o experimento desejado.

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Protocolo

A aquisição e o uso de tecido foreskin humano desidentificado para fins de pesquisa foram revisados e receberam a determinação de "não pesquisa humana" pelo Penn State College of Medicine Institutional Review Board (IRB #17574).

NOTA: Seguindo o protocolo abaixo, 2,4 x 106 queratinócitos, 4,4 x 106 fibroblastos e 1,1 x 106 SCs são obtidos de um único prepúcio. Em geral, essas células primárias podem ser usadas para 3 passagens, dependendo das condições experimentais.

1. Isolamento das células primárias e condições culturais

  1. Procedimento de separação de epiderme e derme
    1. Adquirir prepúcio neonatal seguindo o padrão de procedimentos de cuidado por um médico sob protocolos de regulação hospitalar aprovados. O médico determina o tempo de circuncisão após o nascimento e a quantidade de pele removida.
    2. Coloque o prepúcio excisado em um tubo de microcentrifuuge contendo 8-10 mL de meio basal de Dulbecco modificado (DMEM) e transporte imediatamente o prepúcio para o laboratório de cultura celular para isolamento de células. Enxágüe a pele duas vezes com 20-25 mL de 1x linha salina tamponada de fosfato de Dulbecco (DPBS) contendo 1x antibiótico/antimíctico.
      NOTA: Para viabilidade celular máxima, o prepúcio excisado deve ser colocado a 4 °C até o processamento, e as células devem ser colhidas dentro de 24h.
    3. Depois de enxaguar em DPBS/antibióticos, mergulhe o prepúcio em 25-30 mL de meio basal DMEM gelado por 10-15 min em um prato de cultura de tecido de 10 cm. Realize todas as etapas de processamento em uma capa de cultura de tecido usando técnica estéril.
    4. Usando um bisturi, corte cuidadosamente o prepúcio aberto e exponha a dermis e o tecido adiposo subcutâneo.
    5. Remova o tecido adiposo subcutâneo usando fórceps, lâmina de bisturi e tesoura, conforme necessário. Descarte o tecido adiposo. Corte o prepúcio limpo em três a cinco pedaços menores.
    6. Transfira peças de pele para um tubo cônico estéril contendo 16-20 mL de meio dispase-I/DMEM (4 mg/mL em meio basal DMEM).
    7. Misture as peças da pele no tubo cônico por inversão, intermitentemente, durante os primeiros 30 minutos de incubação com dispase-I. Em seguida, coloque o tubo cônico a 4 °C por 16-18 h, tendo em mente a imersão das peças da pele em dispase-I/media.
      NOTA: A solução despase-I deve ser preparada pouco antes da adição utilizando meio basal DMEM frio, filtrado com um coador de 0,22 μm e mantido a 4 °C.
    8. Após a digestão durante a noite com dispase-I, remova os pedaços da pele e coloque-os em um prato seco, estéril, cultura. Desenrolar cada pedaço de pele para que a camada epidérmica externa esteja tocando o prato da cultura.
    9. Usando dois conjuntos de fórceps, separe cuidadosamente a epiderme da derme. Comece na borda do tecido e retire a epiderme da derme.
      NOTA: Se a camada de epiderme é difícil de separar da derme, a digestão dispase-I não foi suficiente. Opções de solução de problemas: 1) devolver peças de pele à solução despase-I/DMEM e incubar por mais 2-3 h a 4 °C; 2) coloque as peças da pele em despase fresca-I/DMEM e incubar a 4 °C por mais 2-3 h.
    10. Use a epiderme e a derme separadas para isolar queratinócitos (epiderme) e fibroblastos e células schwann (derme).
      NOTA: Siga os passos abaixo para obter condições específicas de isolamento e cultura de tipos celulares.
  2. Isolamento de queratinócitos da epiderme
    1. Adicione 5 mL de soro fisiológico hepes tampão (HBS) a um prato de cultura de 10 cm e adicione os fragmentos separados de epiderme. Incubar em temperatura ambiente (RT) por 10 minutos.
    2. Após a incubação do HBS, colete a solução HBS em um tubo cônico de 50 mL. Adicione 5 mL de tampão de neutralização de trippsina (TNB) (Tabela de Materiais) em um tubo cônico de 50 mL e reserve.
    3. Adicione 3 mL de solução de trippsina aos fragmentos epidérmicos. Incubar a 37 °C por 10 min.
    4. Agitar suavemente os fragmentos epidérmicos usando fórceps até que a solução de trypsin se torne turva.
    5. Adicione a solução de trippsina/queratinócitos ao HBS e TNB contendo tubo na etapa 1.2.2.
    6. Para quaisquer fragmentos epidérmicos remanescentes que não tenham dissolvido na digestão inicial da trippsina, adicione 3 mL de 0,25% de trippsina/ácido etilenodiaminetetraacético (EDTA). Incubar a 37 °C por 10 min e repetir as etapas 1.2.4 e 1.2.5.
    7. Adicione 2 mL de soro bovino fetal (FBS) à solução trypsin/EDTA contendo tubos de solução HBS e TNB.
    8. Centrifugar o tubo de coleta contendo HBS/TNB/trypsin e queratinócitos a 870 x g por 5 min a 4 °C.
    9. Aspire o supernasal e resuspenha a pelota celular em 3 mL de meio de crescimento completo de queratinócitos (Tabela de Materiais).
    10. Filtre a suspensão celular com um filtro estéril de 100 μM em um tubo cônico estéril de 50 mL para remover detritos.
    11. Quantifique o número do celular e a viabilidade celular.
      NOTA: Aqui, foi utilizado um dispositivo especializado de amostragem e coloração celular (Tabela de Materiais) para quantificar o número do celular e a viabilidade seguindo as instruções do fabricante.
    12. Placas de cultura de sementes conforme necessário para experimentos. A densidade de semeadura recomendada é de ~45.000 células/cm2.
    13. Coloque as placas de cultura em uma incubadora a 37 °C em 5% de CO2 por 2 dias para permitir que os queratinócitos aderam ao prato.
    14. Após 2 dias, aspire qualquer célula não aderida. Refrescar a mídia da cultura celular a cada dois dias até que os queratinócitos alcancem a confluência desejada para experiências de passagem ou a jusante (50%-80% de confluência).
  3. Isolamento de células schwann (SCs) e fibroblastos da derme
    1. Frascos T25 pré-revestimento com poli-L-lysine (PLL, 0,01 μg/μL) utilizando 5 mL de 1x DPBS. Coloque os frascos pré-revestidos a 37 °C por 3h. Lave a matriz de revestimento PLL duas vezes usando 1x DPBS (5 mL).
      NOTA: Os frascos T25 podem ser preparados com antecedência.
    2. Enxágüe as peças isoladas da dermes com 5 mL de meio basal DMEM.
    3. Pique a derme em pequenos pedaços com tesoura ou bisturi.
    4. Digerir a dermis picada com 5 mL de colagenase (2 mg/mL em meio basal DMEM) a 37 °C por 2,5 h. Triturar suavemente a dermis picada com uma ponta de pipeta a cada 30 minutos até que a dermis dissocia completamente.
    5. Filtre a suspensão da célula com um coador de células de 70 μM. É necessário aplicar força mecânica usando uma seringa de 1 mL para filtrar totalmente a suspensão.
    6. Diluir a suspensão celular filtrada com 5 mL de meio DMEM completo (meio basal DMEM + 5% FBS + 1x de antibiótico) para parar a atividade enzimática da colagemnase.
    7. Centrifugar a suspensão celular a 870 x g por 5 min em RT para pelotar as células.
    8. A partir desta pelota celular, tanto os fibroblastos quanto os SCs serão obtidos. Resuspenda a pelota celular em 2 mL de MEM médio completo para dividir as células (suspensão/tubo celular de 1 mL) e centrífuga a 870 x g por 5 min no RT.
    9. Para a cultura das SCs, siga os passos 1.3.10-1.3.17 e para a cultura do fibroblasto, siga os passos 1.3.18-1.3.22.
    10. A partir do passo 1.3.8, aspire o supernatante. Resuspenda a pelota de célula em 5 mL de meio completo DMEM fresco.
    11. Quantifique o número do celular e a viabilidade.
      NOTA: Aqui, foi utilizado um dispositivo especializado de amostragem e coloração celular (Tabela de Materiais) para quantificar o número do celular e a viabilidade seguindo as instruções do fabricante.
    12. Semente os frascos T25 pré-revestidos com 5 mL de células resuspended a uma densidade de 4,0 x 103 células/mL. Incubar o frasco a 37 °C na presença de 5% de CO2 durante a noite (~12-16 h de incubação).
    13. Após 16 h, confirme a adesão celular por microscopia (Tabela de Materiais) a 10x de ampliação.
    14. Remova as células não aderentes e lave o frasco 3x com 5 mL de 1x DPBS.
    15. Adicione 5 mL de 10 μM arabinoside (agente antimitótico, mata fibroblastos) em meio completo DMEM. Incubar o frasco a 37 °C na presença de 5% de CO2 por 24 h.
    16. Aspire o arabinoside citosine contendo meio do frasco. Enxágüe o frasco 3x com 5 mL de 1x DPBS.
    17. Rechee o frasco de cultura com 5 mL de SCs meio de cultura completa (Tabela de Materiais) e incubar a 37 °C na presença de 5% de CO2 por 48 h. Atualizar SC completo meio de cultura a cada dois dias até que os SCs atinjam 80% de confluência.
    18. Aspire o supernasciante da camada dérmica dissociada (passo 1.3.8) e resuspense a pelota celular com 5 mL de fibroblasto meio completo (fibroblasto meio basal + 5% FBS + 1x antibiótico).
    19. Quantifique o número celular e a viabilidade celular.
      NOTA: Aqui, foi utilizado um dispositivo especializado de amostragem e coloração celular (Tabela de Materiais) para quantificar o número do celular e a viabilidade seguindo as instruções do fabricante.
    20. Plaque os fibroblastos a uma densidade celular de 4,0 x 103 células/mL em frascos de cultura T25 (não pré-revestidos) usando 5 mL de fibroblasto meio completo. Incubar a 37 °C na presença de 5% de CO2 durante a noite (~12-16 h de incubação).
    21. Após 16-24 h, confirme a adesão celular por microscopia (Tabela de Materiais) à ampliação de 10x. Aspirar células não aderentes do frasco e lavar o frasco duas vezes com 5 mL de 1x DPBS.
    22. Adicione 5 mL de fibroblasto fresco médio completo e incubar a 37 °C na presença de 5% de CO2 por 48 h. Refrescar o meio de cultura a cada dois dias até que os fibroblastos atinjam a confluência desejada para ensaios de passagem ou a jusante (50%-80% de confluência).

2. Verificação de queratinócitos epidérmicos, SCs dérmicos e marcadores proteicos de fibroblastos por imunofluorescência

  1. Dia 1- Reveste lâminas de vidro de câmara e células desprendimento
    1. Slides de vidro de câmara de 4 poços pré-casaco com colágeno-I para queratinócitos, ou PLL para SCs ou, apenas 1x DPBS para fibroblastos (0,5 mL cada poço). Certifique-se de revestir toda a superfície. Incubar lâminas de câmara a 37 °C por 2 h. Durante a incubação, prepare as células.
    2. Após as células cultivadas atingirem 50%-80% de confluência, lave os frascos com 1x DPBS 3x (1 mL para cada poço).
    3. Despeente as células aderidas com 5 mL de 0,25% de solução trypsin-EDTA (TE) incubando a 37 °C na presença de 5% de CO2 por 2 min, até que as células comecem a se tornar redondas. Visualize o descolamento celular com microscopia (Tabela de Materiais) em ampliação de 10x.
    4. Após a incubação, transfira a solução TE contendo células para um tubo cônico com soro bovino fetal de 5 mL (FBS).
    5. Adicione 5 mL de tampão de neutralização de trippsina (TNB) ao frasco de cultura e, em seguida, transfira o conteúdo para o tubo de centrífuga acima mencionado (células com TE e FBS). Visualize o descolamento celular com microscopia (Tabela de Materiais) em ampliação de 10x.
      NOTA: TNB ou FBS ou ambos podem ser usados para neutralizar a atividade de trippsina.
    6. Centrifugar o tubo cônico contendo células/TE/TNB a 870 x g por 5 min. Transfira o supernatante para outro tubo e resuspense a pelota celular no meio de cultura completa correspondente. Meça a viabilidade celular mencionada na etapa 1.2.11.
    7. Enxágüe os slides de vidro de câmara pré-revestidos (passo 2.1.1) com 1x DPBS (1 mL para cada poço) 3x.
    8. Seque semi-seque as lâminas dentro da capa da cultura tecidual e queratinócitos de sementes, SCs ou fibroblastos a uma densidade apropriada (30.000 células/0,5 mL/câmara) em um meio de cultura celular completa apropriado.
    9. Incubar os slides da câmara a 37 °C durante a noite para permitir que as células aderam.
  2. Dia 2- Bloqueando o deslizamento de vidro da câmara com o Bovine Serum Albumin (BSA) e a incubação de anticorpos primários
    1. Aspire a mídia celular dos slides da câmara e lave 3x com 1 mL de 1x DPBS.
    2. Fixar as células aderidas com 4% de paraformaldeído em 1x DPBS (1 mL para cada poço) e incubar por 15 min em RT dentro da capa de cultura tecidual.
    3. Aspirar 4% de paraformaldeído dos slides da câmara e lavar os slides da câmara 3x com 1x DPBS (1 mL para cada poço).
    4. Permeabilize as membranas celulares com 1% TritonX-100 em 1x DPBS (1 mL para cada poço) e incubar por 15 min na RT.
    5. Aspire a solução de bloqueio dos slides da câmara, lave 3x com 1x DPBS (1 mL para cada poço) para 30 s e depois aspire 1x DPBS do poço.
    6. Bloqueie os slides da câmara com 5% de BSA (0,5 mL para cada poço) e incubar por 45 min no RT.
    7. Aspire a solução de bloqueio dos slides da câmara, lave 3x com 1x DPBS (1 mL para cada poço) para 30 s cada e, em seguida, aspire 1x DPBS do poço.
    8. Diluir os anticorpos primários com 5% de BSA (0,2 mL para cada poço) (Diluições de anticorpos primários: Queratinítos: citokeratin do rato 14 anticorpos (1:100) e, anticorpo citokeratin 10 (1:100); Células schwann: anticorpo S100 do rato (1:200) e anticorpo do fator de crescimento do nervo do coelho (p75-NTR) (1:500); Fibroblastos: anticorpo de vimentina de coelho (1:200) e anticorpo de músculo alfa-liso do rato (α-SMA) anticorpo (1:200)).
    9. Adicione os anticorpos primários às células correspondentes no deslizamento de vidro da câmara e incubar por cerca de 15-16 h (durante a noite) a 4 °C em uma câmara umidificada.
    10. Aspire os anticorpos primários dos slides da câmara, lave 3 vezes com 1x DPBS (1 mL para cada poço) para 30 s cada e, em seguida, aspire 1x DPBS do poço.
    11. Diluir os anticorpos secundários (Anti-coelho de cabra IgG Anticorpo Secundário-Alexa Fluor 488 (1:500) e Anti-Rato de Cabra IgG Anticorpo Secundário-Alexa Fluor 594 (1:500)) com 0,5% BSA. Adicione anticorpo secundário adequado a cada poço (0,2 mL para cada poço). Incubar por 45 min na RT.
    12. Aspire o anticorpo secundário dos slides de câmara, lave 3x com 1x DPBS (1 mL para cada poço) para 30 s cada e, em seguida, aspire 1x DBPS do poço.
    13. Remova a junta no slide da câmara de 4 poços usando removedor de junta. Tente não deixar nenhum adesivo no slide, pois isso interfere com a aplicação do deslizamento de tampas. Adicione uma gota de meio de montagem com 4',6-diamidino-2-fenilôdole (DAPI). Alternativamente, contra-colorindo os poços com DAPI e use um meio de montagem que não contenha rótulos.
    14. Coloque cuidadosamente a mancha de cobertura no deslizamento de vidro evitando bolhas de ar e sele a extremidade da tampa com cola. Observe padrões de coloração de imunofluorescência por microscopia (Tabela de Materiais) a 10x e/ou 20x de ampliação.

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Resultados

O prepúcio neonatal normal foi utilizado para o isolamento de queratinócitos epidérmicos primários e SCs e fibroblastos dérmicos. As células primárias isoladas foram cultivadas em suas respectivas mídias de cultura celular contendo fatores de crescimento. Após a semeadura de SCs e fibroblasto em frascos de cultura, a maioria das células aderiu ao fundo do frasco dentro de 2 h. No caso dos queratinócitos, a maioria dos queratinócitos aderiu por 24h. Os queratinócitos primários epidérmicos isolados atingiram 85% de confluê...

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Discussão

Este protocolo descreve um método para isolar três populações de células distintas de um único pedaço do prepúcio, ou seja, queratinócitos, fibroblastos e células Schwann. Existem alguns protocolos de isolamento disponíveis para isolar queratinócitos e fibroblastos 2,3,5,6, mas nenhum descreve o isolamento de SC. Além das principais células estruturais da pele, queratinócitos e fibroblastos, a...

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Divulgações

Todos os outros autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer ao Dr. Fadia Kamal e ao Dr. Reyad Elbarbary por nos permitir usar instrumentos de laboratório e suporte técnico. Este trabalho foi apoiado por subvenções do NIH (K08 AR060164-01A) e do DOD (W81XWH-16-1-0725) a J. C. E. além do apoio institucional do Centro Médico Hershey da Universidade Estadual da Pensilvânia.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,22 µ M filtros estéreis (Unidade de Filtro de Seringa Millex-GP, polietersulfona)MilliporeSigmaSLGPR33RS
70 µ Filtros de células MCELLTREAT229483
100 µ Filtros de células MCELLTREAT229485
Seringas descartáveis de 1 mLBD Luer-LokBD-309659
Seringas descartáveis de 5 mL (Seringa estéril, uso único)BD Luer-LokBD309646
Seringas descartáveis de 10 mLBD Luer-LokBD305462
1% TritonX-100SigmaX100-1LPreparado no momento do uso
4% solução de paraformaldeídoThermoFisher ScientificJ19943. K2Pronto para usar e armazenar a 4 ° C
5% BSASigmaA7906-100GPreparado no momento do uso
70% etanolPharmco111000200
AntibióticoScienCell Research503
Chemometec Vial1-Fisher ScientificNC1420193
CollagenaseGibco17018-029
CoverslipFisherbrand12544D 22*50-1.5
Dispase ISigma-AldrichD46693
DMEM meio basalScienCell Research9221
salina tamponada com fosfato de Dulbecco livre de Ca2+ e Mg2+ (DPBS)Corning  21-031-CV)
Nunc 15 mL Tubos de centrífuga cônicos estéreis de polipropilenoThermoFisher Scientific339651
Nunc Tubos de centrífuga cônicos estéreis de polipropileno 50 mLThermoFisher Scientific339653
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mLFisherbrand02-681-5
Soro fetal bovino (FBS)ThermoFisher Scientific10082147
Meio completo de fibroblastosScienCell Research2331
IgG de cabra anti-camundongo (H + L) Anticorpo secundário altamente adsorvido de cabra, Alexa Fluor 594InvitrogenA11032Diluição (1: 500)
Anticorpo secundário de cabra anti-Rabbit IgG (H + L) de adsorção cruzada, Alexa Fluor 488InvitrogenA11008Diluição (1: 500)
Solução salina tamponada de Hanks (tampão HBSS)LonzaCC-5022
PrepúcioTecido de prepúcio humano não identificado para fins de pesquisa (Conselho de Revisão Institucional - IRB # 17574).
Meio de queratinócitos KGM-GOLD (KGM ouro e suplementos)Lonza00192151 e 00192152
anticorpo de actina de músculo liso alfa de camundongoThermoFisher Scientific14-9760-82Diluição (1:200)
Anticorpo de citoqueratina14 de camundongoAbcamab7800Diluição (1:100)
Anticorpo S100 de camundongoThermoFisher ScientificMA5-12969Diluição (1:200)
Multi câmara (4 poços de lâmina de vidro)Tab-Tek154526
NucleoCounter -Via1-Chemometec941-0012
Poly-L-Lysisne (PLL)ScienCell Research32503
ProLong Gold Anti-fade Mountant com DAPIInvitrogenP36935
Rabbit K10 anticorpoSigma-AldrichSAB4501656Diluição (1:100)
Anticorpo p75-NTR de coelhoMilliporeAB1554Diluição (1:500)
Vimentina de coelhoProteinTech10366-1-APDiluição (1:200)
Meio de cultura de células SchwannScienCell Research1701
Pinças de precisão DUMONT retas com pontas extra finas Dumostar, 5ROTHLH75.1Esterilizar com álcool 70% antes de usar
Tesoura IRIS, afiada / afiada. Comprimento 4– 3/8"(111mm)Codman54-6500Esterilize com álcool 70% antes de usar
Lâmina cirúrgica esterilizada - afiada (Lâminas de Borda Única Econômica Duro)Empresa de lâminas de barbear94-0120Esterilize com álcool 70% antes de usar
Frasco de cultura T25Corning353109
Tampão de neutralização de tripsina (TNS)LonzaCC-5002
Tripsina / EDTAMicroscópio invertido LonzaCC-5012
ZEISSAxio Observer 7- Axiocam 506 mono - ndash; Microscópio Apotome.2Para imunofluorescência de lâmina de câmara contendo células coradas
Microscópio invertidoZEISSPrimovertPara visulaizar/observar a fixação ou descolamento de células
Solução humano

Referências

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