Técnicas de Microscopia para Interpretação da Colonização Fúngica em Tecidos de Plantas Micoheterotróficas e Germinação Simbiótica de Sementes

Resumo

Este protocolo visa fornecer procedimentos detalhados para coleta, fixação e manutenção de amostras de plantas micoheterotróficas, aplicando diferentes técnicas de microscopia, como microscopia eletrônica de varredura e transmissão, microscopia de luz, confocal e fluorescência para estudar a colonização fúngica em tecidos e sementes geridas com fungos micorrizais.

Resumo

A botânica estrutural é uma perspectiva indispensável para compreender plenamente a ecologia, a fisiologia, o desenvolvimento e a evolução das plantas. Ao pesquisar plantas micoheterotróficas (ou seja, plantas que obtêm carbono de fungos), aspectos notáveis de suas adaptações estruturais, os padrões de colonização tecidual por fungos e a morfomia de órgãos subterrâneos podem iluminar suas estratégias de desenvolvimento e suas relações com a hifa, fonte de nutrientes. Outro papel importante dos fungos simbióticos está relacionado à germinação de sementes de orquídeas; todas as espécies de Orquídeas são micoterróticas durante a germinação e fase de mudas (micoheterotrofia inicial), mesmo as que fotossintetizam em estágios adultos. Devido à falta de reservas nutricionais em sementes de orquídeas, os simmbiontos fúngicos são essenciais para fornecer substratos e possibilitar a germinação. Analisar etapas de germinação por perspectivas estruturais também pode responder a questões importantes sobre a interação dos fungos com as sementes. Diferentes técnicas de imagem podem ser aplicadas para desvendar endofitos de fungos em tecidos vegetais, como são propostos neste artigo. Seções à mão livre e finas de órgãos vegetais podem ser manchadas e depois observadas usando microscopia leve. Um fluorocromo conjugado à aglutina germina de trigo pode ser aplicado aos fungos e co-incubado com Calcofluor White para destacar paredes de células vegetais em microscopia confocal. Além disso, as metodologias de digitalização e microscopia eletrônica de transmissão são detalhadas para orquídeas micterotróficas, e as possibilidades de aplicação desses protocolos em plantas relacionadas são exploradas. A germinação simbiótica das sementes de orquídeas (ou seja, na presença de fungos micorrizais) é descrita no protocolo em detalhes, juntamente com possibilidades de preparação das estruturas obtidas a partir de diferentes estágios de germinação para análises com microscopia de luz, confocal e elétron.

Introdução

A pesquisa estrutural em botânica, abrangendo morfologia vegetal e anatomia, é fundamental na compreensão de todo o organismo ^1,2, e fornece perspectivas indispensáveis para integrar e contribuir para o conhecimento sobre a ecologia, fisiologia, desenvolvimento e evolução das plantas³. Os métodos de morfologia e anatomia vegetal atualmente compreendem protocolos, equipamentos e conhecimentos desenvolvidos recentemente, bem como há mais de um século^{atrás, 2}. A execução contínua e adaptação dos métodos clássicos (por exemplo, microscopia leve) juntamente com técnicas mais recentes (por exemplo, microscopia confocal, microtomografia de raios-X) têm a mesma base essencial: conhecimento teórico que permite o desenvolvimento de uma metodologia.

A principal ferramenta na anatomia e morfologia das plantas é a imagem. Apesar do equívoco de que tais análises são observações simples, dando espaço a interpretações subjetivas², analisar e compreender imagens nessa área requer conhecimento dos métodos aplicados (o equipamento, tipo de análise, procedimentos metodológicos), componentes celulares, histoquímica e o corpo vegetal (organização e função tecidual, ontogenia, adaptações morfológicas). Interpretar as imagens obtidas através de uma variedade de métodos pode levar à correlação entre forma e função, decifrando a composição química de uma estrutura, corroborando na descrição da taxa, na compreensão de infecções por fitopatógenos e outras avaliações desse tipo.

Ao pesquisar plantas micoheterotróficas (MH) (ou seja, plantas não fotossintéticas que obtêm carbono de fungos micorrizais ^4,5), aspectos notáveis de suas adaptações estruturais, os padrões de colonização tecidual por fungos e a morfomia de órgãos subterrâneos podem iluminar suas estratégias de desenvolvimento e relações com a hifa, que são a fonte de nutrientes. Os órgãos subterrâneos das plantas de MS geralmente apresentam importantes adaptações relacionadas à sua associação com fungos do solo, por isso é essencial realizar essas investigações anatômicas e morfológicas⁶. Os órgãos aéreos da espécie MH não devem ser ignorados, pois os endófitos também podem estar presentes nesses tecidos, mesmo que não sejam fungos micorrizais (observações pessoais, ainda não publicadas).

Além da essencialidade bem estabelecida da associação de fungos micorrizais com espécies de MS durante todo o seu ciclo^{de vida 7}, todas as espécies de orquídeas, mesmo as autotróficas, têm um estágio micoheterotrófico obrigatório inicial em ambientes naturais. Ocorre porque o embrião das orquídeas é indiferenciado e carece de endosperm ou cotilledons, sendo assim incapaz de se desenvolver e se estabelecer em ambientes naturais sem o apoio nutricional dos parceiros fúngicos ^4,8. Considerando isso, os protocolos simbióticos de germinação podem ser aplicados não apenas às espécies de MS, mas também às orquídeas fotossintestares, com o objetivo de investigar a especificidade orquídea-fungo no desenvolvimento de germinação e protocorma, metodologia muito aplicada em iniciativas de conservação de espécies ameaçadas ^9,10,11.

Nesta montagem de métodos, descrevemos passos importantes envolvidos na coleta, fixação e armazenamento de amostras de plantas de MS para estudos anatômicos (seção 1), análise de superfície e seleção de amostras (seção 2), métodos de secção (à mão livre: seção 3, microtomia: seção 4, criomicrotomia: seção 5), coloração e montagem (seção 6), fluorescência e microscopia confocal de endofitos fúngicos (seção 7), microscopia eletrônica de varredura (seção 8), e microscopia eletrônica de transmissão (seção 9). Além disso, descrevemos um método de germinação simbiótica para sementes de orquídeas (MH e autotrófico, seção 10), pois os métodos de imagem mencionados anteriormente podem ser aplicados com sucesso para analisar a colonização fúngica de sementes, protocormas e mudas no processo de germinação.

Figura 1: Resumição esquemática dos métodos de imagem. Os esquemas fornecem indicações de etapas de protocolo nas quais são detalhadas. Abreviaturas: GMA = methacrilato glicol, OCT = composto de temperatura de corte ideal, SEM = microscopia eletrônica de varredura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

As técnicas de microscopia descritas aqui em detalhes (Figura 1) são precedidas pelas seguintes etapas essenciais: coleta, fixação, desidratação, incorporação e secção de amostras. Como as etapas são variáveis (Figura 1) dependendo da técnica escolhida( s), é importante pensar com antecedência, considerando os fixativos a serem preparados e transportados para o local de coleta, como as amostras devem ser preparadas antes da fixação, os processos de desidratação a serem utilizados (seção 1) e diferentes possibilidades de incorporação e métodos de secção (seções 4, 5, e 9). A Figura 1 resume sequencialmente todas as etapas necessárias para cada técnica de microscopia completamente descrita abaixo.

Protocolo

1. Coleta, fixação e manutenção de amostras

NOTA: Plantas totalmente MS geralmente podem ser encontradas na floresta escura abaixo da história^12,13, principalmente em áreas úmidas e abundantes em lixo, enquanto parcialmente plantas DE MS podem ser encontradas em florestas mais abertas^12,13. As plantas de MS geralmente têm órgãos subterrâneos bem desenvolvidos em uma variedade de formas e tamanhos.

1. Ao coletar espécies de MS, explore o solo ao redor da base vegetal, tomando cuidado para não danificar órgãos subterrâneos, e evite retirar as plantas do solo para evitar desconectar os órgãos aéreos dos subterrâneos.
2. Procure cuidadosamente estruturas aéreas usando uma espátula de jardinagem enquanto explora os órgãos subterrâneos como raízes, caules, rizomas e órgãos de armazenamento, sem danificar essas estruturas.
3. Remova partículas do solo para preservar estruturas frágeis, e lave delicadamente esses órgãos com água da torneira para enxaguar as partículas restantes do solo antes de fixar as amostras.
4. As plantas de MS associadas ao lixo das folhas exigem atenção extra; coletar cuidadosamente órgãos ligados ao material em decomposição através de sua hifa, evitar retirar esses órgãos das estruturas conectadas e colecioná-los cuidadosamente, pois essas partes são altamente delicadas. Preservar estruturas com essas conexões e coletar o lixo também para análise.
5. Se optar por analisar o material fresco utilizando técnicas de imagem, mantenha as amostras em sacos plásticos fechados com umidade adequada, água suficiente evaporando e hidratando a planta, evitando o excesso de água em contato com as amostras. Transporte-as imediatamente para o laboratório e analise as amostras no mesmo dia em que foram coletadas, prestando atenção se as amostras ainda estão preservadas ao analisá-las.
6. Leve fixativos para o local de coleta em recipientes bem selados. Corrija amostras rapidamente após a coleta para microscopia leve (LM) e microscopia eletrônica de varredura (SEM) em qualquer um dos seguintes fixativos: formalina tamponada 10% neutra (NBF¹⁴, Tabela 1) ou solução de Karnovsky (modificada¹⁵, Tabela 2). A solução de Karnovsky pode ser preparada com tampão fosfato de 0,2 M¹⁵, a receita para a qual está descrita na Tabela 3.
7. Para análise por microscopia eletrônica de transmissão (TEM), se sectionia as amostras com uma espessura de 4-3 mm dentro de uma gota de tampão de cacodilato de glutaraldeído-sódio (modificado¹⁶, Tabela 4) em seções menores de 1-2 mm de espessura. Descarte as bordas cortadas fora da gota. Transfira imediatamente as seções para um tubo de coleta com um volume de fixação mais de 10 vezes maior que o volume das amostras, por ser um fixador aditivo (ou seja, suas moléculas são quimicamente adicionadas às proteínas fixas¹⁶).
   ATENÇÃO: Os três fixados descritos são altamente tóxicos. Evite a inalação, especialmente durante seu uso no campo. Prepare todos os fixativos em um capô de fumaça usando luvas. Não misture cacodilato e ácidos, pois o gás arsênico pode ser formado¹⁶.
8. Se as amostras fixas flutuarem no fixador, isso indica a presença de gás nos tecidos vegetais. O ar e outros gases impedem que o fixador penetre toda a amostra². Remova o gás dos tecidos reamostrando-os em partes menores e usando uma bomba de vácuo (-300 a -400 inHg pressão) até que todas as amostras afundem até o fundo da solução¹⁷. Tenha cuidado, pois a pressão excessiva exercida pela bomba pode danificar amostras.
9. Depois de pelo menos 48 h na solução de Karnovsky ou 10% NBF, lave as amostras em 0,2 M PB (Tabela 3) e desidrate-as com uma série de 10%, 30%, 50% e, finalmente, 70% de etanol. Para amostras delicadas, desidratar por 30 minutos em cada concentração; para amostras maiores, desidratar por 1h ou mais.
   NOTA: Uma solução de 70% de etanol é o meio ideal para armazenar amostras. Amostras em 70% de etanol podem ser armazenadas à temperatura ambiente por anos. Não armazene material vegetal por longos períodos nos fixativos, pois remover agentes de fixação é um passo essencial após a fixação².
10. Armazene amostras em glutaraldeído-cacodilato a 4 °C antes de prosseguir para a pósfixação (etapa 9.1).

Formalina tamponada neutra de 10% (NBF)14
passo 1	adicionar 10 mL de solução de formaldeído de 37-40% em 80 mL de água destilada
passo 2	adicionar 0,4 g de monohidrato monobásico fosfato de sódio (NaH2PO4· H2O) para a solução
passo 3	adicionar 0,65 g de fosfato de sódio dibásico, anidra (Na2HPO4)
passo 4	compõem o volume para 100 mL

Tabela 1: 10% de receita de formalina tamponada neutra¹⁴.

Solução de Karnovsky (modificada15)
passo 1	em 20 mL de água destilada a 60-70 °C
passo 2	adicionar 0,8 g de paraformaldeído (para obter 4% c/v), agitação
passo 3	adicionar 1-4 gotas de 40% NaOH e mexer até que a solução fique clara
passo 4	esfrie-o e adicione 30 mL de 0,2 M tampão de fosfato pH 7.2 (Tabela 3)
passo 5	diluir 25% de glutaraldeído em 0,1 M PB (pH 7.2) para obter 1% de glutaraldeído (volume final: ~60 mL)
passo 6	adicionar 1% de glutaraldeído (passo 5) à solução obtida na etapa 4 até fazer até 100 mL de fixação

Tabela 2: Receita de solução de Karnovsky (modificada¹⁵).

Tampão fosfato de 0,2 M (PB) pH 7.2
passo 1	adicionar 14.196 g de fosfato de sódio dibásico, anidro (Na2HPO4) a 400 mL de água destilada
passo 2	adicionar 13,8 g de monohidrato monobásico fosfato de sódio (NaH2PO4· H2O)
passo 3	mexer até que a solução esteja clara
passo 4	ajustar o volume final para 500 mL com água destilada
passo 5	ajustar pH para 7,2
passo 6	para um PB de 0,1 M, diluir 1:1

Tabela 3: 0,2 M receita tampão fosfato.

3% glutaraldeído 0,2 M tampão de cacodilato de sódio (modificado16)
passo 1	Tampão de cacodilato de 0,2 M: adicione 4,28 g de trihidrato de cacodilato de sódio em 100 mL de água destilada
passo 2	ajustar pH para 7,2
passo 3	adicionar 12 mL de 25% glutaraldeído em 25 mL da solução na etapa 2 (0,2 M de tampão de cacodilato pH 7.2)
passo 4	compõem o volume até 100 mL com água destilada

Tabela 4: 3% glutaraldeído 0,2 M receita tampão de cacodilato de sódio (modificado¹⁶).

2. Análise superficial de órgãos em material fixo e não fixo

1. Para analisar a higfa superficial em órgãos, especialmente os subterrâneos, e aqueles em contato com lixo de folhas, observe material fixo ou fresco em um microscópio dissecador (estereoscópio) a uma ampliação de 7,5x ou mais, dependendo das amostras analisadas.
   1. Visualize as amostras imersas no fixador, 70% etanol (se armazenado nele), ou água da torneira no caso de material fresco. Evite a luz direta do microscópio de dissecação, pois pode secar e danificar amostras.
   2. Busca por áreas de interesse nas amostras, guiadas pelos higifados superficiais e rizomorfos. Selecione amostras que contenham áreas com rizomorfos superficiais, pois estes podem ser seccionados para visualizar pelotões e bobinas de higifize dentro de células corticais em raízes e caules.
   3. Após a seleção, siga as etapas 1.6 e 1.9 se as amostras ainda não estiverem fixas. Se desejar, fotografe amostras frescas usando um microscópio leve sem fixação, conforme descrito na seção 3.
   4. Use a câmera acoplada ao estereómico para coletar imagens de superfícies de órgãos, rizomorfos e outras estruturas observadas. Nesses casos, providencie uma cor de fundo adequada para contrastar bem com o material e, se possível, escolha um material de fundo com uma superfície menos áspera (por exemplo, papel).

3. Seções à mão livre de órgãos vegetais

NOTA: Seções à mão livre de órgãos vegetais podem ser desafiadoras, especialmente para estruturas pequenas e finas. No entanto, essas seções de tecidos com endofífitos fúngicos podem, em alguns casos, melhor evince hyphae e outras características em comparação com seções finas.

1. Se sectionia amostras frescas ou fixas com uma lâmina afiada, cortando-as o mais finas possível e colocando-as imediatamente em uma pequena placa de Petri com água (se fresca) ou 70% de etanol (se fixada). Use um pequeno pincel para manipular as seções sem danificá-las.
2. Para facilitar a secção de materiais mais desafiadores (ou seja, órgãos pequenos, finos e flexíveis), cerque a amostra em uma estrutura, por exemplo, poliestireno ou petiole cecropia . Esculpe o suporte para acomodar a amostra e faça uma seção fina da amostra e do suporte completamente.
3. Colora e monte as amostras conforme descrito na seção 6.

4. Incorporar amostras de plantas em resina e secção

1. Desidrata ainda mais as amostras armazenadas em 70% de etanol em 80%, 96% e 2x em 100% etanol, por 30 min a 2h, dependendo do tamanho e composição das amostras.
2. Use um kit de resina de methacrilato glicol (GMA) de acordo com as instruções do fabricante. Verifique Gerrits e Horobin (1996)¹⁸ para mais considerações. Siga a infiltração e incorpore etapas de acordo.
   ATENÇÃO: A resina GMA é tóxica, pode causar reação alérgica e irritação de pele, olhos e mucosa. Use os reagentes em um capô de fumaça e use luvas.
3. Use bandejas de moldagem de polietileno para incorporação, selecionadas pelo tamanho das amostras (por exemplo, 13 mm x 19 mm x 5 mm para amostras maiores, 6 mm x 8 mm x 5 mm para as menores). Preste atenção à orientação amostral desejada dentro do molde e use uma agulha para ajudar a orientar.
4. Deixe para polimerização, de preferência à temperatura ambiente, até se solidificar completamente. O processo de endurecimento geralmente leva algumas horas, embora seja recomendado desenformar os blocos no dia seguinte. Após a polimerização, desprende cuidadosamente os blocos de resina dos moldes e prossiga para fixar os blocos o mais rápido possível para evitar curvas de blocos.
5. Lixe a face do bloco de resina que será anexado, criando uma superfície plana. Cole o bloco de resina a um cuboide de madeira (2 cm x 2 cm x 3 cm recomendado) com um adesivo de cianoacrilato líquido de viscosidade média (ver Tabela de Materiais). Certifique-se de que a resina está completamente ligada para evitar comprometer a secção.
6. Realizar a secção em um microtome rotativo como descrito abaixo.
   ATENÇÃO: As lâminas das facas de microtome são muito afiadas e podem causar acidentes. Certifique-se de manuseá-los seguindo todas as medidas de segurança. Antes de se aproximar da faca (por exemplo, para mudar o bloco, para molizar a resina), tranque o volante grosseiro e coloque a tampa de segurança da lâmina. Armazene lâminas descartáveis em casos apropriados. Tenha muito cuidado ao substituir as lâminas.
   NOTA: Diferentes tipos de facas (por exemplo, descartáveis ou fixas; vidro ou aço) podem ser usadas para seção de resina GMA¹⁸. A qualidade das seções depende de quão afiada a faca é. Certifique-se de que a faca está bem presa e não pode se mover. Facas descartáveis podem precisar ser trocadas regularmente para obter uma melhor secção.
   1. Coloque o cuboide de madeira firmemente no suporte do bloco. Ajuste a orientação da secção usando os parafusos de orientação e certifique-se de um ângulo adequado da faca usando a inclinação da faca. Selecione a espessura das seções; use uma configuração mais grossa para aparamento e uma configuração mais fina para seções selecionadas, uma vez que as seções GMA aderem mais adequadamente ao slide de vidro quando mais finos; a espessura sugerida para tecidos vegetais é de 5-8 μm.
   2. Antes de começar, esfrie o quarto, se necessário, pois temperaturas mais altas pioram a qualidade das seções. Prepare o seguinte para secção: um béquer com água destilada, uma placa quente, pincéis (pelo menos dois), pinças de ponta fina, uma pipeta Pasteur, lâminas de vidro, papel filtro (ou papel de tecido) e um lápis (para identificar as amostras que estão sendo seccionadas).
   3. Ajuste a placa quente para 50 °C e coloque o béquer sobre ela. Preste atenção às diferenças no aquecimento dependendo da área da placa quente (geralmente, a área média aquece mais do que as bordas; aqueça a água no meio, de preferência).
   4. Escolha um slide de vidro, identifique-o com um lápis e enco meia a água quente destilada por toda a superfície do slide. Se necessário, use uma solução (por exemplo, detergente e água, ou 70% de etanol) para quebrar a tensão entre a água e o vidro, de modo que todo o slide esteja igualmente coberto. Alguns tipos de slides devem ser pré-limpos com 70% de etanol para obter a adesão adequada da seção.
   5. Comece avançando gradualmente a face do bloco de resina em direção à lâmina da faca. Não tente a secção sem avançar primeiro o bloco, ou então o equipamento e o bloco podem ser danificados. Se necessário, corte o bloco usando uma espessura maior (10 μm e acima).
   6. Ao se aproximar de uma seção adequada, faça um movimento firme de mão única com o volante, de modo que a seção seja feita de uma só vez. Verifique a umidade da resina. Durante a secção, hidrate regularmente a face do bloco sendo cortado usando um pincel mergulhado em água destilada se houver um problema com seções de enrolamento. Remova o excesso de água com um papel de tecido.
   7. Com um par de pinças de ponta fina, coloque a seção obtida na água sobre o escorregador. Ao entrar em contato com a água, a resina GMA se estende. Se necessário, use um pincel para se desdobrar suavemente e esticar as seções. Use outro pincel para manter constantemente a lâmina livre de detritos de resina. Não alternar entre as pincéis para evitar molhar a lâmina.
   8. Depois de fazer fila em todas as seções desejadas no slide, seque a face inferior do slide e coloque-a acima da placa quente. Remova o excesso de água da parte superior do slide, cortando suavemente com um papel filtro (opcional). As seções aderirão quando a água evaporar do deslizamento. Não deixe os slides muito tempo para evitar que as seções sejam danificadas pelo calor excessivo.
   9. Armazene os slides em uma caixa de slides, longe da poeira e do sol, e use-os para coloração e outros procedimentos. Os slides podem ser armazenados por vários anos.

5. Congelar amostras de plantas e seccionar com um criostat

NOTA: A consideração essencial no tecido biológico criosectioning é reduzir os danos devido à formação de cristais de gelo ao congelar amostras. A crioproteção é geralmente feita infundindo soluções quimicamente inertes, como glicerol ou sacarose^19,20.

1. Um dia antes da seção da amostra, execute as seguintes etapas.
   1. Diluir 100 mL de 0,2 M PB (Tabela 3) em 100 mL de água destilada para obter 200 mL de 0,1 M PB. Preparar 10%, 20% e 30% soluções de sacarose em 0,1 M PB (por exemplo, para uma solução de 10%, adicionar 2 g de sacarose em 20 mL de tampão).
   2. Para amostras frescas, lave-as em 0,1 M PB por 30 minutos. Para amostras fixas, lave-as no mesmo tampão usado para preparar o fixador por 30 minutos. Para amostras em 70% de etanol, hidrate-os em 50% e 30% de etanol e lave em 0,1 M PB por 1h em cada solução.
   3. Incubar as amostras por 2h em 10% de sacarose, 2h em 20% de sacarose e 2h em 30% de sacarose, à temperatura ambiente. Em seguida, incubar durante a noite em 30% de sacarose a 4 °C (ou pelo menos por 3h; o tempo máximo é de 48 h).
2. No dia da secção, prepare 40% e 50% de sacarose em 0,1 M PB; não prepare soluções de sacarose com mais de 12h de antecedência. Incubar por 2h em cada concentração de sacarose, a 4 °C.
3. Para incorporar, em pequenos moldes, faça uma camada de composto OCT (meio de temperatura de corte ideal, usado para incorporar e congelar as amostras) e mantenha-o a -20 °C para congelar. Os moldes podem ser moldes histológicos regulares, embora para facilitar a desoldagem dos blocos, papel ou papel alumínio podem ser feitos usando um pequeno cuboide como moldura e fita adesiva.
4. Depois que a camada inferior do composto OCT estiver congelada nos moldes, trabalhe dentro de uma câmara criostat (ca. -27 °C). Coloque as amostras incubadas em 50% de sacarose nos moldes, na orientação em que serão seccionadas. A face superior de um bloco cuboide é geralmente uma melhor face de secção. Marque no molde onde as amostras são colocadas, para que o bloco possa ser facilmente aparado, e a orientação correta mantida.
5. Cerque as amostras no composto OCT e estoure qualquer bolha de ar tocando as amostras. Congele-os a -20 °C. Com os blocos totalmente congelados, coloque-os dentro da câmara criostat (ca. -27 °C). Desenforme cada um antes de usar e preste atenção às marcas que indicam a localização da amostra dentro do bloco.
6. Como o composto OCT é facilmente cortado com uma lâmina, corte adequadamente os blocos antes de posicioná-los sobre os mandris. Coloque algum composto OCT no mandril criostat e posicione o bloco para que a face superior seja seccionada. Rostos com áreas menores fornecem seções melhores. Aguarde até que o bloco esteja bem ligado ao mandril e teste-o antes de começar a seção.
7. Coloque o mandril firmemente no suporte do mandril. Ajuste a orientação da secção usando os parafusos de orientação. Ajuste o ângulo da faca usando a inclinação da faca. Selecione a espessura das seções. As amostras podem ser seccionadas mais grossas do que as seções de resina usuais. Seções em uma faixa entre 5-20 μm são obtidas com sucesso, com seções mais grossas sendo mais fáceis de fazer (menos curling e menos danos de estruturas).
8. Avance a face do bloco congelado em direção à lâmina da faca. Não tente seccionar sem fazê-lo, ou então o bloco pode ser retirado do mandril e danificado. Se necessário, corte o bloco usando uma espessura maior (10 μm e acima).
9. Ao se aproximar de uma seção adequada, coloque a placa anti-rolo (ou seja, uma placa transparente que manterá a seção) acima da faca e faça um movimento firme de mão única com o volante, de modo que a seção seja feita de uma só vez. Problemas de enrolamento podem ser causados se a placa anti-rolo precisar ser ajustada (geralmente é ajustável em referência à lâmina) ou se houver detritos na lâmina. Limpe a lâmina constantemente com um pincel para remover detritos.
10. Use slides especiais para que as seções se conectem facilmente, como slides silanizados (comercial ou preparado com 2% de aminoalkylsilane na acetona²¹), ou slides preparados com 500 μg/mL poli-L-Lysine em água destilada²¹ ou 0,2% de gelatina (veja detalhes²¹). Mantenha os slides em temperatura ambiente.
11. Para aderir a seção a um slide, levante a placa anti-rolo e faça rapidamente o slide tocar na seção. Como o slide está em temperatura ambiente, a seção derrete imediatamente e adere ao slide. Preste atenção para virar a face tratada do slide para a seção, que pode permanecer acima da faca ou na face interna da placa anti-rolo. Para evitar enrolar as seções, execute esta etapa rapidamente assim que a placa for levantada e tenha cuidado para não contortar a seção.
12. Deixe o slide fora da câmara criostat (em temperatura ambiente) se novas seções forem adicionadas a ela. Depois de aderir a todas as seções desejadas ao slide, mantenha-a dentro da câmara criostat ou no congelador (-20 °C ou abaixo). Não exponha os slides à umidade. Mantenha-os em uma caixa de slides e lembre-se de identificar os slides com um lápis.
    NOTA: Slides e blocos de OCT podem ser armazenados a -20 °C, embora não por muito tempo. Para obter melhores resultados, use os slides e os blocos dentro de alguns dias.

6. Seções de plantas de coloração e endofitos para microscopia leve

NOTA: Muitos tipos de manchas podem ser usadas para seções de plantas. É desafiador manchar diferencialmente fungos endofíticos e tecidos vegetais. Embora não seja um procedimento de coloração, um método para marcar estruturas de fungos é apresentado na seção 7 (fluorescência com um conjugado de aglutina de germe de trigo). Seções à mão livre (explicadas na seção 3), seções de resina (seção 4) e criosections (seção 5) podem ser manchadas, embora as manchas à base de fenol e álcool sejam desafiadoras para essas amostras, pois a resina GMA e o OCT perdem a adesão ao slide nesses casos.

1. Use um ou combine os seguintes métodos habituais de coloração para amostras de plantas.
   1. Toluidina azul O ^22,23, um método muito aplicado para coloração geral de seções vegetais. Prepare uma solução de 0,05% toluidina azul O em fosfato de 0,1 M (pH 6,8) ou tampão citrato de 0,09 M (pH 4,5-4,8), dependendo das espécies e tipos de tecido. Incubar seções de resina GMA por 2-10 min usando um frasco de coloração de slides ou colocando algumas gotas acima das seções se poucos slides estiverem manchados. Lave cuidadosamente com água destilada ou tampão após a incubação e monte os slides com água ou seque-os em uma placa quente para produzir lâminas permanentes conforme descrito na etapa 6.3.
   2. O reagente Lugol² indica a presença de amido. Prepare uma solução de iodo de 5% (I₂) e 10% de iodeto de potássio (KI) em água destilada. Manchas por 2 minutos, adicionando algumas gotas acima do escorregador e, em seguida, lave com água destilada. Este teste histoquímico é geralmente aplicado a slides temporários.
   3. Sudão III, IV e mancha B^24,25 preta para diferentes lipídios. Prepare uma solução de 0,3% Sudão (III, IV ou B preto) em 70% de etanol, aqueça-o até ferver e deixe esfriar. Use o supernaspeuta, filtre-o e incuba seções por 15-30 min em uma placa de Petri fechada. Lave as seções cuidadosamente com 70% de etanol e água destilada. Monte os slides com água (geralmente aplicado apenas a lâminas temporárias).
      NOTA: Como o Sudão é um corante à base de álcool, é mais adequado para seções à mão livre. Conduza a mancha da seção de resina GMA cuidadosamente, pois elas geralmente se desprendem do slide.
2. Para lâminas temporárias, monte as seções em água ou glicerina e observe posteriormente. Sele a mancha com esmalte para preservá-los um pouco mais.
3. Para slides permanentes, monte as seções com resinas sintéticas (por exemplo, meio de montagem rápida, consulte Tabela de Materiais). Goteque algumas gotas do meio de montagem (pode transbordar a tampa), coloque o deslizamento de tampa cuidadosamente para evitar bolhas e use pinos de roupas para pressionar o slide contra o deslizamento até ficar totalmente seco. Remova o excesso de meio de montagem seca com uma lâmina de barbear.

7. Aplicação de um fluorocromo conjugado ao germe de trigo aglutinina em fluorescência e microscopia confocal

NOTA: Este método pode ser aplicado em seções à mão livre (explicadas na seção 3), seções de resina (seção 4) e crioseções (seção 5). As criosecções podem ser adequadas para fins de microscopia confocal, uma vez que amostras mais grossas podem ser fornecidas quando comparadas a seções de resina, mas não tão grossas quanto as à mão livre. Um fluorocromo conjugado à aglutinina germe de trigo (WGA, ver Tabela de Materiais) é aplicado à imagem fúngica na microscopia de fluorescência²⁶. Um microscópio confocal não é essencial, embora possa fornecer imagens tridimensionais claras das estruturas das plantas²⁷.

1. Prepare uma solução de 0,2 mg/mL WGA-fluorocromo conjugado em 0,1 M PB²⁸ (pH 7.2, confira a etapa 5.1.1 e a Tabela 3). Prepare uma solução de 1% Calcofluor Branco em 0,1 M PB (pH 7.2). Prepare pequenas quantidades dessas soluções, pois as seções são incubadas diretamente com elas.
2. Incubar as seções nas lâminas de vidro por 30 minutos na solução conjugada WGA-fluorocromo²⁹, utilizando volume suficiente para cobrir as seções e depois lave em 0,1 M PB.
3. Incubar as seções na solução calcofluor, utilizando volume suficiente como meio de montagem. A solução pode ser mantida durante o período de observação.
4. Coloque tampas nos slides e observe em um microscópio confocal ou um microscópio de luz de fluorescência usando os seguintes filtros: TC/GFP (excitação: 470-440, emissão: 525-550, para WGA-fluorocromo na Tabela de Materiais - fluoresces de parede fúngica verde sob este filtro²⁹) e DAPI (excitação: 358, emissão: 463, para Calcofluor Branco)³⁰.
   NOTA: Imagens tridimensionais podem ser obtidas usando a função série Z no microscópio confocal²⁷.

8. Microscopia eletrônica de varredura de órgãos vegetais

1. Após a fixação de amostras, a realização de desidratação e o armazenamento em 70% de etanol (seção 1), uma possibilidade é cortar amostras para expor qualquer superfície desejada para análise sem, se necessário (por exemplo, tecidos internos, estrutura do ovário). Use uma lâmina afiada e nova e faça cortes com um movimento unidireita, evitando uma aparência danificada dessas áreas no SEM. Se necessário, use um estereoscópio para selecionar as amostras e considere a área de stubs metálicos para determinar os tamanhos da amostra.
2. Desidratar ainda mais amostras para MEI em séries etanolicas: 80%, 96% e 2x em álcool etil absoluto (≥99,8%). Mantenha amostras pequenas e delicadas por 30 minutos em cada concentração e amostras maiores e mais densas por 1h.
3. Dobre pequenos envelopes usando papel de tecido para organizar amostras para os próximos passos, amostras maiores podem ser manuseadas sem um envelope. Identifique os envelopes com um lápis escrevendo uma letra ou um número, e mantenha um registro de todas as amostras em cada uma delas. Mantenha as amostras em etanol absoluto, embora não por muito tempo, e prossiga para a etapa 8.4 o mais rápido possível.
4. Prossiga para a secagem de ponto crítico (CP). Opere uma secadora cp de acordo com os procedimentos operacionais padrão. Coloque amostras em etanol absoluto (fluido intermediário) em uma câmara de pressão. No ponto crítico de CO₂ (31 °C, 7,3 x 10⁶ Pa) o fluido intermediário dissolve-se no fluido de transição (dióxido de carbono líquido), e as amostras são secas³¹.
5. Após a secagem do CP, armazene amostras o mais rápido possível em um recipiente de dessacação, por exemplo, um frasco selado contendo gel de sílica. A umidade atmosférica pode destruir as amostras se reabsorvida³¹.
6. Use estações metálicas para montar as amostras. Antes de montar, coloque luvas para manipular os stubs, mergulhe-os em acetona por 5 minutos para eliminar qualquer gordura e deixe-os secar. Use uma fita adesiva de carbono de dois lados condutor para corrigir amostras no stub, e um estereótipo para ajudar a posicionar amostras, tendo em mente que a visão de cima é a única perspectiva possível em imagens SEM.
7. Manipule amostras com pinças de ponta fina, tomando cuidado, pois a parte da amostra tocada pela pinça é geralmente danificada, por isso tente tocar peças posicionadas longe das áreas de interesse (por exemplo, áreas em contato com a fita). Mantenha os stubs com amostras em uma placa de Petri selada com gel de sílica. Prossiga para a etapa 8.8 o mais rápido possível.
8. Use um cabador de sputter para depositar uma camada de metal, geralmente ouro ou platina, na superfície das amostras em uma atmosfera de baixa pressão de um gás inerte, frequentemente argônio³¹. Siga os procedimentos operacionais padrão ao usar um revestimento sputter. A espessura do revestimento depende da topografia das amostras, geralmente entre 15-40 nm³².
9. Mantenha os stubs revestidos em uma placa de Petri selada com gel de sílica, e desde que o gel de sílica esteja retendo a umidade, as amostras podem ser armazenadas desta forma por semanas. Use um microscópio eletrônico de varredura para analisar as amostras. As amostras em vacuo são atingidas por um feixe de elétrons, e a emissão de sinais de tal interação é interpretada como imagens³¹. Para obter detalhes sobre a operação de um microscópio eletrônico de varredura, leia Jeffree and Read (1991)³¹ e Bozzola e Russell (1999)³².
10. Para reutilizar os stubs, puxe a fita adesiva e esfregue-as com lã de arame. Lave na água da torneira, mergulhe no etanol absoluto e seque-os adequadamente, impedindo a oxidação do metal constituinte.

9. Microscopia eletrônica de transmissão

1. Amostras de prefixo com tampão glutaraldeído-cacodilato, conforme explicado nas etapas 1.7 e 1.10. Após 12-24 h de prefixação, lave as amostras 3x em tampão de cacodilato de 0,2 M (pH 7,25) por 10 minutos. Realize a pósfixação com 1% de tetroxida de ósmio (OsO₄) em tampão de cacodilato de 0,2 M, por 12 h no escuro, à temperatura ambiente. Lave 3x com água destilada por 5 minutos.
   ATENÇÃO: Cacodilato e tetroxida de ósmio são altamente tóxicos e não devem ser inalados. Use-os em capas de fumaça, seguindo as respectivas folhas de dados de segurança.
2. Desidratar as amostras com 30%, 50%, 70% e 96% de etanol, 2x em cada concentração, por 10 minutos. Em seguida, desidratar 3x em álcool absoluto, por 15 minutos cada vez.
3. Infiltrar-se nas amostras em resinas acrílicas hidrofílicas (ver Tabela de Materiais), uma vez com resina 1:1 + etanol absoluto e 3x com resina pura por 8-12 h cada. Realizar polimerização em cápsulas de gelatina a 60 °C até solidificar completamente (12h no máximo¹⁷).
4. Avaliar de perto a orientação das amostras dentro do bloco de resina; corte a parte superior do bloco, com uma lâmina de barbear, fazendo uma forma piramipcional que concentra a amostra na área de secção. Obtenha seções semi-mente (250-500 nm)³³ em um ultramicromo com uma faca de diamante e coloque em lâminas de vidro em poucas gotas de água.
5. Mantenha os slides em uma placa quente a 60 °C. Manche as seções com toluidina azul O como na etapa 6.1.1 e deixe a mancha secar completamente. Lave com cuidado com a água da torneira. Avalie a seção obtida desenhando quatro quadrantes e selecionando o quadrante mais adequado para análise.
6. Corte o bloco para que a forma piramimia concentre o quadrante escolhido na face superior do bloco. Produzir seções ultrathin (50-100 nm)^33,34. A espessura é avaliada de acordo com a cor de interferência das seções: seções com cerca de 70 nm aparecem prata-ouro, com cerca de 100 nm aparecem de ouro, e com cerca de 200 nm aparecem azuis³⁴.
7. Colete as seções ultrathin da água usando redes de cobre e prossiga para o método de coloração de contraste com acetato deuranyl e citrato de chumbo, conforme descrito abaixo.
   1. Prepare uma solução de citrato de chumbo (Tabela 5) e congele a solução final em tubos de microcentrifuus com 1 mL de solução em cada, só descongelando antes do uso.
   2. Prepare uma solução de acetato deuranyl: dissolva 0,625 g de acetato de urano [UO₂(CH₃COO)₂] em 25 mL de água recém-fervida e resfriada. Guarde em um frasco escuro no congelador.
      ATENÇÃO: O nitrato de chumbo é tóxico se ingerido. 1 N NaOH é altamente corrosivo. O acetato deuranyl é radioativo e tóxico. Não deve ser ingerido, inalado ou entrar em contato com a pele.
   3. Ao colorar, coloque ambos os reagentes preparados em seringas separadas de 3 mL com unidades de filtro (poros de 0,22 μm, ver Tabela de Materiais). Prepare uma placa de Petri virada de cabeça para baixo com um filme termoplástico de vedação sobre ele (ver Tabela de Materiais) e dentro de uma placa mais larga, com pelotas NaOH nas bordas como uma armadilha para CO₂³² (ver Figura 2).
   4. Descarte a primeira gota, e sobre o filme coloque uma gota de acetato deuranyl e três gotas de água destilada para cada grade manchada. Faça o mesmo com citrato de chumbo e adicione mais três gotas de água destilada.
   5. Incubar a grade (com o lado opaco para baixo, onde as seções estão) em urano por 30 minutos (tempo variável). Lave 3x nas gotas de água destiladas, secando a grade de cada vez suavemente com papel filtro no lado brilhante. Repita com a queda do citrato de chumbo (30 min) e lave-a.
8. Após pelo menos 4 horas, analise as redes em um microscópio eletrônico de transmissão. Neste microscópio, um feixe de elétrons passa pelas seções em vacuo e a imagem é projetada em uma tela fluorescente. Para obter detalhes sobre a operação de um microscópio eletrônico de transmissão, leia Bozzola e Russell (1999)³².

solução de citrato de chumbo (para coloração de contraste TEM)
passo 1	cercar um béquer com papel alumínio
passo 2	dissolver 0,266 g de nitrato de chumbo [Pb(NO3)2] em 6 mL de água recém-fervida e resfriada destilada
passo 3	agitar por 2 minutos
passo 4	adicionar 0,352 g de citrato de trisódio [Na3(C6H5O7).2H2O] (a solução deve adquirir uma aparência leitosa)
passo 5	agitar por 15 minutos, selar o béquer com papel alumínio e transferir a solução para um béquer de 10 mL
passo 6	adicionar 1,6 mL de 1N NaOH e 2,4 mL de água destilada (a solução deve ser translúcida)
passo 7	se necessário, ajuste o pH perto de 12

Tabela 5: Receita de solução de citrato de chumbo.

Figura 2: Esquema de coloração de contraste com soluções de cite de chumbo e acetato deuranyl. (A) Prepare as placas de Petri, uma virada de cabeça para baixo (no centro) com filme termoplástico para que as gotas possam ser colocadas acima dele, dentro de uma mais ampla. Pelotas NaOH são lugares ao redor do prato central. (B) Gotas de acetato de urano são colocadas nos círculos com a letra U, e gotas de citrato de chumbo nos círculos marcados L. DW indica gotas de água destilada. As grades são manchadas sequencialmente na coluna, de modo que cinco grades podem ser manchadas simultaneamente como representadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

10. Germinação simbiótica de sementes de orquídeas

1. Certifique-se de que as soluções e todos os materiais utilizados na germinação simbiótica das sementes sejam estéreis para evitar contaminação. Comece autoclavando-os por 20 min a 121 °C. As etapas de germinação simbiótica são resumidas na Figura 3.
2. Desinfetar superficialmente frutas e sementes, imergindo-as em solução de hipoclorito de sódio contendo 2% de cloro ativo para 10-15 min para frutas e 7-10 min para sementes, considerando a rigidez e espessura do casaco de sementes⁹. Sementes finas e frágeis podem ser imersas em uma solução de hipoclorito de sódio diluído 1:1. Depois, lave 3x em água destilada autoclavada para remover a solução de hipoclorito.
3. Recuperar as sementes filtrando em tecido serigráfico e usar as sementes para prosseguir com testes de germinação (preferencialmente). Se necessário, armazene-os em envelopes de papel filtro dentro de frascos de vidro com gel de sílica, a 4 °C, feche hermeticamente os frascos e sele-os com filme de aderência. Transfira algumas gotas de água da última lavagem para o ágar de dextrose de batata (PDA, 39 g/L), para avaliar a eficácia do processo de lavagem.
4. Antes de semear sementes no meio da cultura, avalie sua viabilidade através do teste de tetrazolium (opcional) conforme descrito abaixo de³⁵.
   1. Incubar aproximadamente 10 mg de sementes em um tubo de microcentrifuuge com 1 mL de 10% de sacarose em água destilada, por 24 h em temperatura ambiente (cerca de 25 °C), em luz.
   2. Remova a solução de sacarose com uma micropipette e adicione 1 mL de solução de tetrazolium de 1% (cloreto de tripheniltetrazolium) em água destilada. Incubar a 40 °C em um termbloco por 24 h no escuro.
   3. Remova a solução de tetrazolium com uma micropipette e lave as sementes com água destilada 2x ou até que a solução seja removida. Remova todos os líquidos. Se necessário, as sementes podem ser armazenadas no congelador por até uma semana (como na etapa 10.3) antes de serem analisadas.
   4. Resuspenda as sementes em água destilada e analise-as sob um microscópio leve. As sementes viáveis adquirem luz à cor vermelha escura, enquanto as sementes não viáveis mantêm sua cor natural.
5. Realize o seguinte protocolo^{adaptado 9} para germinação simbiótica de sementes de orquídeas.
   1. Incubar as sementes sobre discos de papel filtro autoclavados (1-2 cm de diâmetro) colocados em placas de Petri com meio de cultura de áclon (OMA) (2,5 g/L de flocos de aveia e 7 g/L de ágar, pH 6).
   2. No centro da placa de Petri, inocular um fragmento de meio de cultura (cerca de 1 cm²) contendo micélio do fungo isolado escolhido para o procedimento de germinação. Sele as placas de Petri com filme agarrado e incuba-as no escuro a cerca de 25 °C ou temperatura ambiente, pois é mais adequada para o crescimento fúngico.
   3. Prepare alguns pratos com sementes e sem inoculação fúngica, como um controle negativo para o teste de germinação.
6. Analisar os resultados da germinação semanalmente, coletando dados quantitativos e qualitativos e fotografando protocormes e mudas. A observação de sementes e protocormes deve ser realizada utilizando um estereoscópio para uma avaliação mais precisa da germinação. Use uma fonte de luz vinda de baixo, pois permite maior contraste, possibilitando discriminar o micélio fúngico dos protocormes com mais facilidade.
   1. Coletar amostras em diferentes estágios de desenvolvimento e fixar para análises anatômicas (seção 1). Aplique todas as análises de imagem descritas anteriormente para investigar endofofados fúngicos em sementes, protocormes e mudas durante a germinação (microscopia leve - seções 4, 5 e 6; confocal e fluorescência - seção 7; SEM e TEM - seções 8 e 9).
   2. Gerar resultados quantitativos após a classificação das etapas de acordo com a Tabela 6. Os estágios descrevem o desenvolvimento habitual de sementes de orquídeas micoheterotróficas. Coletar dados semanalmente e tabela com as datas iniciais de cada etapa observada.
   3. Além disso, colete dados quantitativos estimando percentual e taxa de germinação. Conte pelo menos 100 sementes ou defina os campos de contagem³⁵. Demarcar três ou mais campos de contagem por placa de Petri, constituídos por regiões fixas com área padronizada, e avaliar semanalmente. Calcular os dados coletados de acordo com a equação do índice de crescimento (GI):
      
      onde n₀ é o número de sementes contadas na fase 0, N₁ refere-se ao estágio 1, e segue até a fase 6 (registrada como N₆)³⁶.

Figura 3: Resumição esquemática da germinação simbiótica da metodologia de sementes. Os esquemas fornecem indicações de etapas detalhadas no protocolo. Abreviaturas: OMA = ágar de aveia, PDA = ágar de dextrose de batata. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Fase de germinação	Descrição
0	Sem germinação
1	Inchaço do embrião
2	Ruptura de Testa
3	Cabelos absorventes se desenvolvem
4	Projeção de troncos se desenvolve
5	As escalas de proteção (bracts) desenvolvem
6	As primeiras raízes se desenvolvem

Tabela 6: Descrição das etapas de desenvolvimento do protocorm aplicadas às análises periódicas dos testes de germinação. Modificado a partir de estágios descritos em Otero et ^al.36.

Resultados

Seguindo os estágios essenciais de fixação do tecido vegetal produz estruturas celulares o mais semelhantes possível ao estado vivo, considerando a morfologia, o volume e a organização espacial dos componentes celulares e tecidos¹⁶. Observe tais características nas amostras após a fixação química (Figura 4). A Figura 4C-F representa amostras adequadamente fixas sob microscopia leve. Seguir os procedimento...

Discussão

As análises de imagem na anatomia e morfologia das plantas têm um importante potencial para cumprir objetivos e ajudar a entender as relações entre as plantas micoheterotróficas e seus endofofados fúngicos indispensáveis, como demonstrado por estudos de órgãos subterrâneos ^6,40, análises estruturais da germinação simbiótica das sementes³⁹, e estruturas aéreas e reprodutivas⁴¹ . A botânica estrutural, apesar de ter p...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Acetona	Sigma-Aldrich	179124	(para montagem de pontas SEM)
Ágar-ágar (AA)	Sigma-Aldrich	A1296	(para testes de germinação de sementes)
Calcofluor White Stain	Sigma-Aldrich	18909	corante fluorescente (detecta celulose)
Solução tampão de citrato, 0,09M pH 4,8	Sigma-Aldrich	C2488	(para coloração de azul de toluidina O)
Fita de carbono dupla face condutora	Fisher Scientific	50-285-81	(para SEM)
Microscópio confocal	Zeiss		(qualquer modelo)
Grades de cobre	Sigma-Aldrich	G4776	(para TEM)
Secador de ponto crítico	Balzers		(qualquer modelo)
Cryostat	Leica Biosystems		(qualquer modelo)
Microscópio de dissecação	Leica Biosystems		(= estereomicroscópio, qualquer modelo)
Entellan	Sigma-Aldrich	107960	meio de montagem rápida para microscopia
Álcool etílico, puro (≥ 99,5%)	Sigma-Aldrich	459836	(= etanol, para processos de desidratação)
Solução de formaldeído, 37%	Sigma-Aldrich	252549	(para preparação de solução NBF)
Solução de formalina, tamponada neutra, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	fixador de tecido histológico
Cápsulas de gelatina para TEM	Fisher Scientific	50-248-71	para polimerização de resina em TEM)
Solução de gelatina, 2% em H2O	Sigma-Aldrich	G1393	(diluído para preparação de lâminas - adesão a OCT)
Solução de glutaraldeído, 25%	Sigma-Aldrich	G6257	(para Karnovsky '
HistoResin	Leica Biosystems	14702231731	kit de inclusão de metacrilato de glicol (GMA)
Iodo	Sigma-Aldrich	207772	(para preparação de solução Lugol)
Nitrato de chumbo (II)	Sigma-Aldrich	228621	Pb (NO3)2 (para coloração de contraste TEM)
Microscópio de luz	Olympus		(qualquer modelo)
LR Resina acrílica branca	Sigma-Aldrich	L9774	resina acrílica hidrofílica para
TEM Solução Lugol	Sigma-Aldrich	62650	(para coloração)
Pontas de metal para montagens de amostras	Rave Scientific		(para SEM, modelos diferentes)
Micrótomo	Leica Biosystems		micrótomo rotativo manual ou outro modelo
Ágar aveia (OMA)	Millipore	O3506	para testes de germinação de sementes)
Composto OCT, Tissue-Tek	Sakura Finetek USA	4583	meio de incorporação para tecidos congelados
Tetróxido de ósmio	Sigma-Aldrich	201030	OsO4 (para pós-fixação de TEM)
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793	filme
termoplástico de vedaçãoParaformaldeído	Sigma-Aldrich	158127	(para Karnovsky' s preparação da solução)
Solução de poli-L-lisina, 0,1% em H < sub > 2< / sub > O	Sigma-Aldrich	P8920	(para preparação de lâminas - adesão a OCT)
Lâminas de poli-preparação	Sigma-Aldrich	P0425	lâminas de vidro revestidas de poli-L-lisina
Bandejas de copo de moldagem de polietileno	Polysciences	17177A-3	(6x8x5 mm, para embutir amostras em resina GMA)
Moldagem de polietileno Bandejas de copos	Polysciences	17177C-3	(13x19x5 mm, para embutir amostras em resina GMA)
Iodeto de potássio	Sigma-Aldrich	221945	(para preparação de solução de Lugol)
Ágar Batata Dextrose (PDA)	Millipore	70139	(para testes de germinação de sementes)
Microscópio Eletrônico de Varredura	Jeol		(qualquer modelo)
Silano [(3-Aminopropil)trietoxissilano]	Sigma-Aldrich	A3648	para preparação de lâminas - adesão OCT)
Lâminas de preparação de silano	Sigma-Aldrich	S4651	revestidas com silano
Sílica gel laranja, granulado	Supelco	10087	para processos de dessecação)
Cacodilato de sódio trihidratado Sigma-Aldrich		C0250	para tampão de cacodilato de glutaraldeído-sódio)
Hidróxido de sódio	Sigma-Aldrich	S5881	NaOH (para Karnovsky' s preparação da solução e coloração de contraste TEM)
Solução de hipoclorito de sódio	Sigma-Aldrich	425044	NaClO (para desinfecção da superfície das sementes)
Fosfato de sódio dibásico, anidro	Sigma-Aldrich	71640	Na2HPO4 (para solução NBF e preparação de PB)
Fosfato de sódio monobásico monohidratado	Sigma-Aldrich	S9638	NaH2PO4· H2O (para NBF e PB)
Revestidor de pulverização catódica	Balzers		(qualquer modelo)
Sacarose	Sigma-Aldrich	S0389	C12H22O11 (para teste de crioproteção e germinação)
Sudan III	Sigma-Aldrich	S4131	(para coloração)
Sudan IV	Sigma-Aldrich	198102	(para coloração)
Sudan Black B	Sigma-Aldrich	199664	(para coloração)
Seringa			(3 mL, qualquer marca, para coloração de contraste TEM)
Unidade de Filtro de Seringa, Millex-GV 0.22 µ m	Millipore	SLGV033R	PVDF, 33 mm, esterilizado por gama (para coloração com contraste TEM)
Tek Bond Super Glue 793	Tek Bond Saint-Gobain	78072720018	adesivo de cianoacrilato líquido, viscosidade média
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	T3260	(para coloração)
Microscópio Eletrônico de Transmissão	Jeol		(qualquer modelo)
Trifeniltetrazólio cloreto	Sigma-Aldrich	T8877	(para o teste de tetrazólio na germinação de sementes)
Citrato trissódico di-hidratado	Sigma-Aldrich	S1804	Na3< / sub> (C6< / sub>H < sub>5< / sub> O7< / sub>) · 2H2O (para coloração com contraste TEM)
Ultramicrótomo	Leica Biosystems		(qualquer modelo)
Acetato de uranilo	Fisher Scientific	18-607-645	UO2(CH3COO)2 (para coloração de contraste TEM)
Bomba			(qualquer modelo)
Aglutinina de gérmen de trigo, Alexa Fluor 488 Conjugado	TermoFisher Scientific	W11261	lectina conjugada com corante fluorescente (detecta resíduos de ácido siálico e N-acetilglucosaminil)