Este protocolo visa fornecer procedimentos detalhados para coleta, fixação e manutenção de amostras de plantas micoheterotróficas, aplicando diferentes técnicas de microscopia, como microscopia eletrônica de varredura e transmissão, microscopia de luz, confocal e fluorescência para estudar a colonização fúngica em tecidos e sementes geridas com fungos micorrizais.
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Artigo de método
Técnicas de Microscopia para Interpretação da Colonização Fúngica em Tecidos de Plantas Micoheterotróficas e Germinação Simbiótica de Sementes
Neste artigo
Resumo
Resumo
A botânica estrutural é uma perspectiva indispensável para compreender plenamente a ecologia, a fisiologia, o desenvolvimento e a evolução das plantas. Ao pesquisar plantas micoheterotróficas (ou seja, plantas que obtêm carbono de fungos), aspectos notáveis de suas adaptações estruturais, os padrões de colonização tecidual por fungos e a morfomia de órgãos subterrâneos podem iluminar suas estratégias de desenvolvimento e suas relações com a hifa, fonte de nutrientes. Outro papel importante dos fungos simbióticos está relacionado à germinação de sementes de orquídeas; todas as espécies de Orquídeas são micoterróticas durante a germinação e fase de mudas (micoheterotrofia inicial), mesmo as que fotossintetizam em estágios adultos. Devido à falta de reservas nutricionais em sementes de orquídeas, os simmbiontos fúngicos são essenciais para fornecer substratos e possibilitar a germinação. Analisar etapas de germinação por perspectivas estruturais também pode responder a questões importantes sobre a interação dos fungos com as sementes. Diferentes técnicas de imagem podem ser aplicadas para desvendar endofitos de fungos em tecidos vegetais, como são propostos neste artigo. Seções à mão livre e finas de órgãos vegetais podem ser manchadas e depois observadas usando microscopia leve. Um fluorocromo conjugado à aglutina germina de trigo pode ser aplicado aos fungos e co-incubado com Calcofluor White para destacar paredes de células vegetais em microscopia confocal. Além disso, as metodologias de digitalização e microscopia eletrônica de transmissão são detalhadas para orquídeas micterotróficas, e as possibilidades de aplicação desses protocolos em plantas relacionadas são exploradas. A germinação simbiótica das sementes de orquídeas (ou seja, na presença de fungos micorrizais) é descrita no protocolo em detalhes, juntamente com possibilidades de preparação das estruturas obtidas a partir de diferentes estágios de germinação para análises com microscopia de luz, confocal e elétron.
Introdução
A pesquisa estrutural em botânica, abrangendo morfologia vegetal e anatomia, é fundamental na compreensão de todo o organismo 1,2, e fornece perspectivas indispensáveis para integrar e contribuir para o conhecimento sobre a ecologia, fisiologia, desenvolvimento e evolução das plantas3. Os métodos de morfologia e anatomia vegetal atualmente compreendem protocolos, equipamentos e conhecimentos desenvolvidos recentemente, bem como há mais de um séculoatrás, 2. A execução contínua e adaptação dos métodos clássicos (por exemplo, microscopia leve) juntamente com técnic....
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Protocolo
1. Coleta, fixação e manutenção de amostras
NOTA: Plantas totalmente MS geralmente podem ser encontradas na floresta escura abaixo da história12,13, principalmente em áreas úmidas e abundantes em lixo, enquanto parcialmente plantas DE MS podem ser encontradas em florestas mais abertas12,13. As plantas de MS geralmente têm órgãos subterrâneos bem desenvolvidos em uma variedade de formas e tamanhos.
- Ao coletar espécies de MS, explore o solo ao redor da base vegetal, tomando cuidado para não danificar....
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Resultados
Seguindo os estágios essenciais de fixação do tecido vegetal produz estruturas celulares o mais semelhantes possível ao estado vivo, considerando a morfologia, o volume e a organização espacial dos componentes celulares e tecidos16. Observe tais características nas amostras após a fixação química (Figura 4). A Figura 4C-F representa amostras adequadamente fixas sob microscopia leve. Seguir os procedimento.......
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Discussão
As análises de imagem na anatomia e morfologia das plantas têm um importante potencial para cumprir objetivos e ajudar a entender as relações entre as plantas micoheterotróficas e seus endofofados fúngicos indispensáveis, como demonstrado por estudos de órgãos subterrâneos 6,40, análises estruturais da germinação simbiótica das sementes39, e estruturas aéreas e reprodutivas41 . A botânica estrutural, apesar de ter p.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores agradecem financiamento da FAEPEX e fapesp (2015/26479-6). MPP agradece à Capes pela bolsa de mestrado (processo 88887.600591/2021-00) e CNPq. JLSM agradece ao CNPq por bolsas de produtividade (303664/2020-7). Os autores também agradecem o acesso aos equipamentos e assistência prestados pelo LME (Laboratório de Microscopia Eletrônica - IB/Unicamp), INFABiC (Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Fotônica Aplicada à Biologia Celular - Unicamp) e LaBiVasc (Laboratório de Biologia Vascular - DBEF/IB/Unicamp); LAMEB (UFSC) e Eliana de Medeiros Oliveira (UFSC) por contribuições ao protocolo de crioproteção; LME para contribuições ao protocolo TEM.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Acetona | Sigma-Aldrich | 179124 | (para montagem de pontas SEM) |
| Ágar-ágar (AA) | Sigma-Aldrich | A1296 | (para testes de germinação de sementes) |
| Calcofluor White Stain | Sigma-Aldrich | 18909 | corante fluorescente (detecta celulose) |
| Solução tampão de citrato, 0,09M pH 4,8 | Sigma-Aldrich | C2488 | (para coloração de azul de toluidina O) |
| Fita de carbono dupla face condutora | Fisher Scientific | 50-285-81 | (para SEM) |
| Microscópio confocal | Zeiss | (qualquer modelo) | |
| Grades de cobre | Sigma-Aldrich | G4776 | (para TEM) |
| Secador de ponto crítico | Balzers | (qualquer modelo) | |
| Cryostat | Leica Biosystems | (qualquer modelo) | |
| Microscópio de dissecação | Leica Biosystems | (= estereomicroscópio, qualquer modelo) | |
| Entellan | Sigma-Aldrich | 107960 | meio de montagem rápida para microscopia |
| Álcool etílico, puro (≥ 99,5%) | Sigma-Aldrich | 459836 | (= etanol, para processos de desidratação) |
| Solução de formaldeído, 37% | Sigma-Aldrich | 252549 | (para preparação de solução NBF) |
| Solução de formalina, tamponada neutra, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | fixador de tecido histológico |
| Cápsulas de gelatina para TEM | Fisher Scientific | 50-248-71 | para polimerização de resina em TEM) |
| Solução de gelatina, 2% em H2O | Sigma-Aldrich | G1393 | (diluído para preparação de lâminas - adesão a OCT) |
| Solução de glutaraldeído, 25% | Sigma-Aldrich | G6257 | (para Karnovsky ' |
| HistoResin | Leica Biosystems | 14702231731 | kit de inclusão de metacrilato de glicol (GMA) |
| Iodo | Sigma-Aldrich | 207772 | (para preparação de solução Lugol) |
| Nitrato de chumbo (II) | Sigma-Aldrich | 228621 | Pb (NO3)2 (para coloração de contraste TEM) |
| Microscópio de luz | Olympus | (qualquer modelo) | |
| LR Resina acrílica branca | Sigma-Aldrich | L9774 | resina acrílica hidrofílica para |
| TEM Solução Lugol | Sigma-Aldrich | 62650 | (para coloração) |
| Pontas de metal para montagens de amostras | Rave Scientific | (para SEM, modelos diferentes) | |
| Micrótomo | Leica Biosystems | micrótomo rotativo manual ou outro modelo | |
| Ágar aveia (OMA) | Millipore | O3506 | para testes de germinação de sementes) |
| Composto OCT, Tissue-Tek | Sakura Finetek USA | 4583 | meio de incorporação para tecidos congelados |
| Tetróxido de ósmio | Sigma-Aldrich | 201030 | OsO4 (para pós-fixação de TEM) |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | filme |
| termoplástico de vedaçãoParaformaldeído | Sigma-Aldrich | 158127 | (para Karnovsky' s preparação da solução) |
| Solução de poli-L-lisina, 0,1% em H < sub > 2< / sub > O | Sigma-Aldrich | P8920 | (para preparação de lâminas - adesão a OCT) |
| Lâminas de poli-preparação | Sigma-Aldrich | P0425 | lâminas de vidro revestidas de poli-L-lisina |
| Bandejas de copo de moldagem de polietileno | Polysciences | 17177A-3 | (6x8x5 mm, para embutir amostras em resina GMA) |
| Moldagem de polietileno Bandejas de copos | Polysciences | 17177C-3 | (13x19x5 mm, para embutir amostras em resina GMA) |
| Iodeto de potássio | Sigma-Aldrich | 221945 | (para preparação de solução de Lugol) |
| Ágar Batata Dextrose (PDA) | Millipore | 70139 | (para testes de germinação de sementes) |
| Microscópio Eletrônico de Varredura | Jeol | (qualquer modelo) | |
| Silano [(3-Aminopropil)trietoxissilano] | Sigma-Aldrich | A3648 | para preparação de lâminas - adesão OCT) |
| Lâminas de preparação de silano | Sigma-Aldrich | S4651 | revestidas com silano |
| Sílica gel laranja, granulado | Supelco | 10087 | para processos de dessecação) |
| Cacodilato de sódio trihidratado Sigma-Aldrich | C0250 | para tampão de cacodilato de glutaraldeído-sódio) | |
| Hidróxido de sódio | Sigma-Aldrich | S5881 | NaOH (para Karnovsky' s preparação da solução e coloração de contraste TEM) |
| Solução de hipoclorito de sódio | Sigma-Aldrich | 425044 | NaClO (para desinfecção da superfície das sementes) |
| Fosfato de sódio dibásico, anidro | Sigma-Aldrich | 71640 | Na2HPO4 (para solução NBF e preparação de PB) |
| Fosfato de sódio monobásico monohidratado | Sigma-Aldrich | S9638 | NaH2PO4· H2O (para NBF e PB) |
| Revestidor de pulverização catódica | Balzers | (qualquer modelo) | |
| Sacarose | Sigma-Aldrich | S0389 | C12H22O11 (para teste de crioproteção e germinação) |
| Sudan III | Sigma-Aldrich | S4131 | (para coloração) |
| Sudan IV | Sigma-Aldrich | 198102 | (para coloração) |
| Sudan Black B | Sigma-Aldrich | 199664 | (para coloração) |
| Seringa | (3 mL, qualquer marca, para coloração de contraste TEM) | ||
| Unidade de Filtro de Seringa, Millex-GV 0.22 µ m | Millipore | SLGV033R | PVDF, 33 mm, esterilizado por gama (para coloração com contraste TEM) |
| Tek Bond Super Glue 793 | Tek Bond Saint-Gobain | 78072720018 | adesivo de cianoacrilato líquido, viscosidade média |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | (para coloração) |
| Microscópio Eletrônico de Transmissão | Jeol | (qualquer modelo) | |
| Trifeniltetrazólio cloreto | Sigma-Aldrich | T8877 | (para o teste de tetrazólio na germinação de sementes) |
| Citrato trissódico di-hidratado | Sigma-Aldrich | S1804 | Na3< / sub> (C6< / sub>H < sub>5< / sub> O7< / sub>) · 2H2O (para coloração com contraste TEM) |
| Ultramicrótomo | Leica Biosystems | (qualquer modelo) | |
| Acetato de uranilo | Fisher Scientific | 18-607-645 | UO2(CH3COO)2 (para coloração de contraste TEM) |
| Bomba | (qualquer modelo) | ||
| Aglutinina de gérmen de trigo, Alexa Fluor 488 Conjugado | TermoFisher Scientific | W11261 | lectina conjugada com corante fluorescente (detecta resíduos de ácido siálico e N-acetilglucosaminil) |
Referências
- Evert, R. F. Esau’s Plant Anatomy: Meristems, Cells, and Tissues of the Plant Body: Their Structure, Function, and Development. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ, USA. (2006).
- Yeung, E. C. T., Stasolla, C., Sumner, M. J., Huang, B. Q. Plant Microtechniques and Protocols. , Sprin....
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Reimpressões e permissões
