Summary
Aquí, presentamos tres protocolos de análisis de datos para imágenes de angiografía fluoresceínica (AF) y tomografía de coherencia óptica (OCT) en el estudio de la oclusión de la vena retiniana (OVR).
Abstract
Los avances en las herramientas de imágenes oftálmicas ofrecen un nivel de acceso sin precedentes a los investigadores que trabajan con modelos animales de lesión neurovascular. Para aprovechar adecuadamente esta mayor traducción, es necesario idear métodos reproducibles para extraer datos cuantitativos de estas imágenes. La tomografía de coherencia óptica (OCT) puede resolver la histología de la retina a una resolución micrométrica y revelar diferencias funcionales en el flujo sanguíneo vascular. Aquí, delineamos lecturas vasculares no invasivas que utilizamos para caracterizar el daño patológico después del insulto vascular en un modelo de ratón optimizado de oclusión de la vena retiniana (OVR). Estas lecturas incluyen análisis de imágenes en vivo de la morfología de la retina, desorganización de las capas internas de la retina (DRIL) medida de isquemia capilar y medidas de angiografía fluoresceínica del edema retiniano y la densidad vascular. Estas técnicas corresponden directamente a las utilizadas para examinar a los pacientes con enfermedad retiniana en la clínica. La estandarización de estos métodos permite la comparación directa y reproducible de modelos animales con fenotipos clínicos de enfermedad oftálmica, aumentando el poder de traducción de los modelos de lesión vascular.
Introduction
La enfermedad neurovascular es un importante problema de salud responsable de accidentes cerebrovasculares isquémicos, una de las principales causas de mortalidad y morbilidad, y enfermedades vasculares retinianas que conducen a la pérdida de visión 1,2. Para modelar la enfermedad neurovascular, empleamos un modelo de ratón de oclusión de la vena retiniana (OVR). Este modelo no es invasivo y utiliza técnicas de imagen in vivo similares a las utilizadas para examinar a las personas con enfermedad vascular retiniana en un entorno clínico. Por lo tanto, el uso de este modelo aumenta el potencial traslacional de los estudios que utilizan este modelo. Al igual que con todos los modelos de ratón, es fundamental maximizar la reproducibilidad del modelo.
Las enfermedades vasculares de la retina son una causa importante de pérdida de visión en personas menores de 70 años. La OVR es la segunda enfermedad vascular retiniana más frecuente después de la retinopatía diabética3. Las características clínicas características de la OVR incluyen lesión isquémica, edema retiniano y pérdida de visión como consecuencia de la pérdida neuronal 3,4. Se han desarrollado y refinado modelos de ratón de OVR utilizando fotocoagulación con láser de los principales vasos para replicar patologías clínicas clave observadas en la OVR humana 5,6,7. Los avances en imágenes oftálmicas también permiten la replicación de herramientas de diagnóstico no invasivas utilizadas en humanos, a saber, la angiografía fluoresceínica (AF) y la tomografía de coherencia óptica (OCT)6. La angiografía fluoresceínica permite observar la fuga debida a la ruptura de la barrera hematoretiniana (BRB), así como la dinámica del flujo sanguíneo en la retina, incluidos los sitios de oclusión, utilizando la inyección de fluoresceína, un pequeño colorante fluorescente 8,9. La imagen de OCT permite la adquisición de imágenes transversales de alta resolución de la retina y el estudio del grosor y la organización de las capas retinianas10. Históricamente, el análisis de las imágenes de AF ha sido en gran medida cualitativo, lo que limita el potencial de comparación directa y reproducible entre los estudios. Recientemente, se han desarrollado varios métodos para la cuantificación del espesor de la capa en imágenes OCT, aunque actualmente no existe un protocolo de análisis estandarizado y el sitio de adquisición de imágenes OCT varía11. Para aprovechar adecuadamente estas herramientas, se necesita una metodología de análisis de datos estandarizada, cuantitativa y replicable. En este artículo, presentamos tres lecturas vasculares utilizadas para evaluar el daño patológico en un modelo de ratón de fuga de RVO-fluoresceína, grosor de la capa de OCT y desorganización de las capas de retina.
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Protocol
Este protocolo sigue la declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión. Los experimentos con roedores fueron aprobados y monitoreados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Columbia.
NOTA: Las imágenes se realizaron en ratones machos C57BL / 6J de 2 meses de edad que pesaban aproximadamente 23 g.
1. Preparación de reactivos para imágenes de la retina
- Preparación de solución inyectable de fluoresceína.
NOTA: La fluoresceína es muy sensible a la luz. Protéjalo de la luz y úselo poco después de la preparación.- Diluir la fluoresceína a una concentración del 1% en solución salina estéril.
- Preparación de ketamina/xilazina
- Diluir ketamina y xilazina en solución salina estéril en consecuencia para la siguiente concentración: ketamina (80-100 mg / kg) y xilazina (5-10 mg / kg).
- Solución salina estéril
- Prepare una jeringa de 5 ml con una aguja de 26 g con solución salina estéril.
2. OCT e imágenes con fluoresceína
- Encienda la caja de luz del microscopio de imágenes de retina, la máquina OCT y la plataforma de ratón calentado.
- Encienda el equipo y abra el programa de imágenes.
- Agregue una gota de fenilefrina y tropicamida a cada ojo.
- Inyecte 150 μL de anestesia (ketamina (80-100 mg/kg) y xilazina (5-10 mg/kg)) por vía intraperitoneal (IP). Determine la profundidad de la anestesia pellizcando el dedo del pie y espere hasta que el animal no responda. Aplique ungüento oftálmico o lágrimas artificiales en ambos ojos.
- Coloque el ratón en la plataforma.
- Ajuste la altura y el ángulo de la plataforma hasta que la vista del fondo de ojo de la retina sea clara y enfocada. Tome una foto del fondo de ojo.
- Abra el software de imágenes y OCT. En el programa OCT, ajuste el empujón a 5.
- Tome una imagen de OCT a 75 μm distal de la quemadura. Repita para los otros tres cuadrantes de la retina.
- Inyectar 100 μL de fluoresceína al 1% IP.
- Cambie la cámara a un filtro de 488 nm. Aumente la ganancia de la cámara a 5.
- Tome una foto del fondo de ojo exactamente 5 minutos después de la inyección de fluoresceína.
NOTA: Evite la exposición prolongada del ojo a la luz de la cámara en el ajuste máximo, ya que la fluoresceína puede exacerbar el fotodaño retiniano. Mantenga la fuente de luz apagada hasta que haya transcurrido el tiempo de espera de 5 minutos y el mouse esté listo para la obtención de imágenes.
3. Cuidados posteriores
- Inyecte 1 ml de solución salina IP estéril. Aplique gotas lubricantes para los ojos en ambos ojos. Aplique ungüento oftálmico o lágrimas artificiales en ambos ojos.
- Observe al ratón mientras se recupera de la anestesia. Regrese a la jaula con otros animales solo cuando esté completamente recuperado, generalmente después de unos 40 minutos.
4. Evaluación de los criterios de exclusión
- Abra la imagen del fondo de ojo tomada a las 24 h después del procedimiento para evaluar los criterios de exclusión. Excluya el ojo si se identifica alguno de los siguientes criterios.
- Evaluar si la imagen tiene cero oclusiones
- Evalúe la imagen para el número de vasos ocluidos.
NOTA: Una oclusión exitosa generalmente tiene algo de pigmentación púrpura en o alrededor de la quemadura, vaso muy delgado o discontinuo a través de la quemadura, apariencia débil o inexistente del vaso fuera del área de la quemadura y decoloración retiniana por hipoxia. Si todo el recipiente se puede ver a través de la quemadura blanca por el láser, el recipiente no pudo ocluir. A veces, el vaso aparecerá parcialmente obstruido, pero si parece ininterrumpido fuera de la quemadura, es probable que el vaso no ocluya. - Para casos ambiguos, use imágenes de AF en el mismo punto de tiempo para evaluar las oclusiones. En estas imágenes, una oclusión aparecerá como una ruptura en la continuidad de un recipiente, a menudo con una estrechación del vaso circundante.
- Si se identifican cero oclusiones, excluir el ojo del análisis, ya que la OVR se considera ineficaz.
NOTA: Las oclusiones generalmente se resuelven a las 48-72 h después de la OVR, y la presencia de oclusiones ya no debe usarse como criterio de exclusión en estos puntos temporales.
- Evalúe la imagen para el número de vasos ocluidos.
- Evaluar las imágenes del fondo de ojo y la OCT para detectar un desprendimiento excesivo de retina
NOTA: La acumulación de líquido subretiniano es común después de la inducción de la RVO y causa la separación de la retina neural del EPR. Los criterios de exclusión para el desprendimiento excesivo de retina se definen de la siguiente manera: OCT será completamente invisible o algunas capas aparecerán increíblemente distorsionadas. La calidad de imagen es pobre, con una pérdida de resolución de las capas plexiformes externas y RPE. La separación entre la retina neural y la coroides es mayor de lo que permite el campo de visión de la OCT. En la imagen del fondo de ojo, el tono de la retina será casi completamente blanco, con algunas manchas púrpuras. Parte de la retina puede aparecer distorsionada y desenfocada. Esto se debe a que se ha desprendido y está a una distancia focal diferente que el resto de la retina.- Si la evaluación de las imágenes de un ojo determina un desprendimiento periférico o completo de la retina, excluir el ojo del análisis.
- Excluir imágenes con evidencia de catarata corneal
NOTA: Una catarata corneal aparece como un punto blanco opaco en la córnea del ratón. Las cataratas generalmente ocurren debido a una lubricación insuficiente de los ojos mientras el animal está anestesiado y pueden evitarse en gran medida teniendo cuidado de aplicar ungüento para los ojos generosamente. Las cataratas generalmente se pueden identificar antes de la obtención de imágenes mediante la inspección del animal. Los ratones que han desarrollado cataratas deben ser excluidos del conjunto de datos sin necesidad de someterse al proceso de imagen. En las imágenes, las cataratas oscurecerán la retina de la cámara y la OCT aparecerá deformada. - Evaluar la imagen para detectar hemorragia excesiva
NOTA: La hemorragia excesiva se puede identificar como cantidades de líquido rojo en la imagen, que generalmente oscurecen el fondo retiniano, el vaso y la quemadura. Estas áreas de líquido rojo serán de un rojo más brillante y opaco que las manchas púrpuras que son normales en la OVR exitosa. Las hemorragias aparecen en la capa de células ganglionares en las imágenes de OCT e interfieren con la capacidad de visualizar otras capas de la retina debajo de la hemorragia.- Si se determina que la imagen tiene una hemorragia excesiva, excluya el ojo del análisis.
5. Procesamiento de imágenes con fluoresceína
- Abra la imagen de fluoresceína en el software de procesamiento de imágenes.
- Duplicar la imagen
- Usando una herramienta de selección, rastree cuidadosamente los vasos principales.
- Los vasos principales son las venas y arterias más gruesas que irradian desde el disco óptico. Ignore cualquier vaso que se ramifique de estos recipientes.
- Si la fuga impide que el contorno del recipiente se vea cerca del sitio de oclusión, trace a través de la fuga en la ubicación aproximada del recipiente (mantenga el espesor, conecte el último punto visible al siguiente punto visible).
- En la primera imagen, elimine la selección, dejando solo el fondo. Guarde esta imagen enmascarada.
- Mueva la selección a la segunda imagen, invierta la selección y elimine, aislando los vasos. Guarde esta imagen enmascarada.
- Abra las dos imágenes en ImageJ. Abra la imagen de fondo y mida la densidad integrada.
- Abra la imagen del recipiente, seleccione el contorno de los recipientes y luego mida la intensidad media.
- Divida la densidad integrada del fondo por la intensidad media de los vasos, generando la relación de fuga para el ojo.
- Registre esta relación de fuga para cada ojo en una cohorte experimental.
- Para controlar aún más el fondo, normalice los ojos experimentales a la proporción media de fugas de los ojos de control no lesionados.
NOTA: Para crear una cuantificación estandarizada de la fuga de fluoresceína en la imagen FA, este cálculo utiliza una relación de la densidad de fondo (donde estará presente la fuga) con el brillo de los vasos principales para crear resultados que controlan la variación en el brillo de una imagen a otra y se pueden cuantificar de manera confiable. Los ojos que no están dañados no tienen fugas y teóricamente deberían tener proporciones de cero. Las relaciones calculadas a partir de estos ojos de control no dañados, por lo tanto, representan ruido de fondo, y este valor se utiliza para normalizar aún más los valores experimentales.
6. Grosor de la capa retiniana
- Abra la imagen de OCT en el software de procesamiento de imágenes.
- Trazar los bordes de la capa de células ganglionares, la capa plexiforme interna, la capa nuclear interna, la capa plexiforme externa, la capa fotorreceptora y la capa de EPR. Mide el grosor medio de cada capa.
- Repita para las imágenes de OCT de los otros tres cuadrantes de la retina. Promedie los espesores medios de la capa en los cuatro cuadrantes para obtener el grosor medio de cada capa retiniana para el ojo.
- Repita para cada ojo en la cohorte experimental.
7. Desorganización de las capas internas de la retina (DRIL)
- Abra la imagen de OCT en ImageJ.
- Con la herramienta de línea, mida la distancia donde el borde superior de la capa plexiforme externa es indistinto.
NOTA: Es importante diferenciar entre DRIL y áreas de visibilidad deficiente de la capa causadas por artefactos de imágenes. La mala calidad de imagen de la OCT puede invalidar un ojo para el análisis DRIL si no es posible una resolución de imagen suficiente. Las imágenes con DRIL suelen tener otras regiones o capas retinianas que están claramente resueltas y organizadas, lo que puede ser un buen indicador de una calidad de imagen suficiente.- Mida horizontalmente desde la latitud donde comienza la desorganización hasta la latitud donde el borde superior de la capa plexiforme externa vuelve a ser visible, si es que lo hace. Incluso si la capa plexiforme externa se desplaza hacia arriba o hacia abajo verticalmente, mida perfectamente horizontalmente.
- Puede haber múltiples áreas de desorganización separadas por áreas sin desorganización. Mide estos individualmente y calcula la suma de las distancias.
- Divida la duración de la desorganización por la longitud total de la retina visible en cada imagen de OCT para obtener la proporción de desorganización de la imagen.
- Repita la medición y el cálculo de las imágenes de OCT de los otros tres cuadrantes de la retina.
- Tome la media de las proporciones de desorganización de las cuatro imágenes de OCT. Este número representa la desorganización promedio para toda la retina. Repita para cada ojo en la cohorte experimental.
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Representative Results
Estos métodos de análisis permiten la cuantificación de la patología retiniana capturada por imágenes de AF y OCT. Los experimentos de los que se extraen los datos representativos utilizaron ratones machos C57BL / 6J que sirvieron como controles no lesionados o se sometieron al procedimiento RVO y recibieron gotas para los ojos de tratamiento Pen1-XBir3 o gotas para vehículos Pen1-Saline para vehículos. El modelo de lesión RVO involucró la irradiación láser (532 nm) de las venas principales en cada ojo de un ratón anestesiado después de una inyección de rosa bengala en la vena de la cola, un colorante fotoactivador12. Tres pulsos de láser fueron entregados a una distancia promedio de 375 μm del centro del nervio óptico para inducir la fotocoagulación y ocluir los vasos12. El uso efectivo del procedimiento RVO se demuestra en Avrutsky et al.12, y más detalles sobre la optimización del método RVO se detallan en Colón Ortiz et al.13. La Figura 1A muestra ejemplos de imágenes de AF y OCT de ambos grupos. Debido a la naturaleza variable de la formación de oclusión y la estabilización a través del proceso de fotocoagulación, se pueden observar diferentes grados de daño. En algunas retinas, el daño inducido por el procedimiento de RVO introduce patologías oftálmicas que hacen que las imágenes de la retina no sean adecuadas para el análisis. Después de la adquisición, las imágenes deben evaluarse primero para determinar los criterios de exclusión para garantizar un análisis óptimo y resultados confiables. Estos criterios de exclusión, delineados en la Figura 1B, incluyen desprendimiento de retina, hemorragia y cataratas. Como se puede observar en el ejemplo de imágenes de fondo de ojo y OCT, estas patologías impiden la obtención de imágenes claras de OCT, lo que hace que las retinas no sean adecuadas para el análisis de datos. Además, es posible que algunas retinas no contengan oclusiones estables; Estas imágenes no modelan con precisión el daño isquémico-hipóxico y deben excluirse del análisis.
La ruptura de la barrera hemato-retiniana contribuye a la patogénesis de la OVR14,15. La evaluación de la cantidad de fugas de los vasos es un indicador útil de la permeabilidad de los vasos inducida por lesiones. La imagen FA permite la visualización de esta fuga, pero una serie de factores, como las diferencias en la velocidad de circulación, afectan la intensidad bruta de las imágenes de FA y hacen una cuantificación consistente16,17. Nuestro método controla esta variabilidad normalizando la intensidad observada en la retina a la intensidad media de la vasculatura mayor. Esto proporciona una relación de fuga para cada imagen de la retina que se puede comparar con otras y analizar. La Figura 2A muestra las imágenes enmascaradas utilizadas para este cálculo, separando la vasculatura principal de las otras áreas de la retina. La capacidad de cuantificar la fluoresceína permite la comparación de la gravedad de la lesión y la eficacia del tratamiento, así como el estudio de los cambios en la fuga a lo largo del curso del tiempo de la lesión (Figura 2B), que puede ser un efecto demasiado sutil para demostrarlo solo con informes cualitativos.
Las imágenes de OCT permiten el análisis del impacto de la RVO en las capas retinianas individuales y el grosor general de la retina. La figura 3A muestra una delineación de las capas de la retina en una imagen de OCT. El trazado de los límites de cada capa (Figura 3B) permite varias vías de análisis. La cuantificación del grosor de cada capa retiniana resulta útil, ya que la respuesta edematosa inicial tiene un efecto más profundo en las capas internas de la retina. Las trazas también permiten el estudio del grosor total de la retina y el análisis segregado de las capas retinianas internas frente a externas. La Figura 3C proporciona un análisis de un curso temporal del daño de la OVR, donde se puede observar la hinchazón inflamatoria inicial de las capas retinianas y el eventual adelgazamiento degenerativo. Trazar el grosor de cada capa a lo largo del tiempo revela diferentes dinámicas para las capas plexiforme interna y nuclear interna, donde la capa nuclear interna experimenta una respuesta mucho mayor a la lesión inicial, pero la capa plexiforme interna demuestra un adelgazamiento más severo después de que el edema inicial se ha estabilizado y regresa a la línea de base (Figura 3D ). Esto otorga una comprensión más precisa de los impulsores de la respuesta en diferentes puntos de tiempo. También probamos la efectividad de un inhibidor de caspasa para mitigar la hinchazón y proteger contra la degeneración eventual, con análisis que revelaron diferentes efectos en capas individuales.
La desorganización de las capas internas de la retina (DRIL) es otra característica de la OCT utilizada como medida diagnóstica de la isquemia en la retinopatía diabética, así como una medida predictiva de la agudeza visual en la ovvr18,19. En las imágenes de OCT, DRIL se manifiesta como una desaparición del límite superior de la capa plexiforme externa12, mezclando las capas plexiforme externa e interna nuclear (Figura 4A). La Figura 4B muestra dos ejemplos de imágenes OCT con áreas resaltadas de DRIL. Expresamos DRIL como una proporción de la longitud total de la retina, promediando cuatro secciones transversales de OCT. Esta medida nos permite comparar cuantitativamente grupos experimentales; La Figura 4C presenta un ejemplo de análisis, donde se comparó la desorganización retiniana de dos grupos experimentales para investigar la eficacia de un inhibidor en la mitigación del daño retiniano en la OVR.
Figura 1: Imágenes obtenidas de imágenes de angiografía fluoresceínica (AF) y tomografía de coherencia óptica (OCT). (A) Ejemplos de imágenes de FA y OCT de retinas 24 h después de la OVR y controles no lesionados. (B) Imagen del fondo de ojo y OCT de los diferentes criterios de exclusión: desprendimiento excesivo de retina, hemorragia, catarata corneal y ausencia de oclusiones. La distancia de adquisición de OCT se indica mediante la directriz verde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Cuantificación de la fuga de fluoresceína. (A) Separación de la imagen de FA en los vasos y el fondo para el análisis (B) Cuantificación de la fuga de fluoresceína de los ojos de ratones C57BL/6J ocluidos en la vena retiniana (RVO) que recibieron 10 mg de gotas oftálmicas inhibidoras de Pen1-XBir3 (N = 17) o gotas oftálmicas para vehículos Pen1-Saline (N = 13) a las 24 h y 48 h después del procedimiento. La lectura de intensidad de la imagen de fondo se normaliza a la lectura de intensidad media de la imagen del recipiente. La media de la lectura de intensidad para ratones RVO se normaliza aún más a los controles no lesionados. Las barras de error muestran la media con SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cuantificación del grosor de la capa retiniana en imágenes de OCT. (A) Retina no lesionada con las capas retinianas individuales etiquetadas: capa de células ganglionares, capa plexiforme interna, capa nuclear interna, capa plexiforme externa, capa fotorreceptora, EPR y coroides. (B) Ejemplo de trazas de capas de imágenes OCT tomadas de ratones control no lesionados y 24 h post-RVO C57/BL6. (C) Cuantificación del cambio en el grosor total de la retina y el grosor intrarretiniano observado en imágenes de OCT de retinas de ratones C57BL / 6J a las 4 h, 24 h, 48 h, 72 h y 8 días después de la OVR. (D) Cuantificación del cambio de espesor en las capas plexiformes internas y nucleares internas de retinas de ratones C57BL / 6J a las 24 h, 48 h y 8 días después de la OVR para ratones C57BL / 6J que recibieron 10 mg de gotas oftálmicas inhibidoras de Pen1-XBir3 (N = 14) o gotas oculares para vehículos Pen1-Saline (N = 15) inmediatamente después del procedimiento de RVO y 24 h después de la RVO. Las barras de error muestran la media con SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cuantificación de la desorganización de las capas internas de la retina (DRIL) observada en imágenes de OCT post-RVO. En las imágenes de OCT, DRIL se indica por la pérdida de una clara delineación entre las capas plexiformes nucleares internas y externas. (A) Ejemplos de secciones de la retina con y sin DRIL en imágenes de OCT. (B) Áreas de DRIL en imágenes OCT de dos regiones en un ratón C57BL / 6J 24 h después de RVO, indicadas por líneas blancas. DRIL se mide horizontalmente a través de la imagen en lugar de seguir la forma de la retina. (C) Cuantificación de la proporción de la longitud de la retina donde se observó DRIL a las 24 h y 48 h después de la OVR para los ojos de ratones C57BL / 6J que recibieron 2,5 mg de gotas oftálmicas inhibidoras de Pen1-XBir3 (N = 19) o gotas oftálmicas de vehículos con solución salina Pen1 (N = 21) después del procedimiento de RVO. Las barras de error muestran la media con SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Las imágenes no invasivas de la retina de roedores presentan una vía para estudiar la patología y desarrollar intervenciones. Estudios previos han desarrollado y optimizado un modelo de ratón de OVR, limitando la variabilidad y permitiendo la traducción fiable de patologías clínicas comunes en la retina murina 5,7,13. Los desarrollos en la tecnología de imagen oftálmica permiten además el uso de técnicas clínicas de imagen in vivo como FA y OCT en animales de experimentación, otorgando la capacidad de comparar modelos de ratón con perfiles de enfermedades humanas 6,12,15. Sin embargo, para maximizar la información que se puede extraer de estas imágenes y el potencial traslacional general del modelo, existe la necesidad de métodos cuantitativos estandarizados, reproducibles y rigurosos para analizar imágenes. Aquí presentamos métodos de análisis que permiten representaciones cuantitativas de la gravedad del daño, lo que permite comparaciones más precisas y confiables entre ratones y entre grupos experimentales. Estos análisis incluyen la cuantificación de fugas en imágenes de AF, la cuantificación del espesor medio de la capa y las áreas de DRIL en imágenes de OCT.
Un factor crítico en el análisis exitoso radica en la calidad de las imágenes adquiridas. Las imágenes de OCT mal resueltas pueden provocar dificultades para rastrear capas individuales y una incapacidad para distinguir la desorganización interna de la retina de la mala calidad de la imagen. Al obtener imágenes, es importante tener cuidado en el posicionamiento del mouse en la plataforma, asegurándose de que la imagen del fondo de ojo esté enfocada, el nervio óptico esté relativamente centrado y la sección transversal de la retina sea horizontal a través de la imagen. La lubricación constante de los ojos mientras el animal está anestesiado también es importante, especialmente cuando el mismo animal es fotografiado varios días. Una lubricación insuficiente puede provocar cataratas corneales, que oscurecen la retina y la hacen inadecuada para la obtención de imágenes. Varias patologías de la retina pueden ocurrir en las imágenes de RVO, lo que hace que las imágenes no sean adecuadas para el análisis. Estos incluyen desprendimiento excesivo de retina y hemorragia excesiva, que, además de comprometer en gran medida la calidad de las imágenes, también representan un grado de daño que es demasiado grave para usar como modelo de RVO. Además, es posible que todos los buques ocluidos se reperfundan completamente poco después de la lesión, lo que no modelará con precisión el daño de la OVR y debe usarse como criterio de exclusión. Sin embargo, es importante tener en cuenta que las oclusiones exitosas se resolverán naturalmente a las 48-72 h después de la lesión, y la presencia de oclusiones como criterio de exclusión se utiliza mejor en o antes de 24 h después del procedimiento. Colón Ortiz et al.13 detallan las mejores prácticas para limitar la variabilidad y calibrar la lesión en un modelo optimizado para el procedimiento de OVR. La identificación y el juicio de los criterios de exclusión también es un paso crítico para el análisis de imágenes. Como esto depende en gran medida de la discreción del evaluador, es importante que los evaluadores estén cegados a los grupos de tratamiento y practiquen la consistencia en el juicio de la gravedad de la patología. Existen algunas limitaciones en la aplicación de estos métodos, particularmente en la práctica de obtener imágenes del mismo ratón en múltiples puntos de tiempo. Existe un límite a la frecuencia con la que un ratón puede ser anestesiado para obtener imágenes, lo que requiere la prueba y el ajuste de los puntos de tiempo para determinar el curso óptimo del tiempo. Nuestros estudios emplean puntos de tiempo de imagen a las 4 h, 24 h, 48 h y 8 días, que hemos encontrado que capturan etapas de lesión inicial, respuesta inflamatoria aguda y lesión a largo plazo12. Además, ciertas cepas de ratón son más propensas al desarrollo de cataratas corneales, que incluyen varios modelos de ratones diabéticos, lo que puede conducir a un gran número de exclusiones o cursos de tiempo incompletos20,21. Los estudios que utilizan tales líneas de ratón pueden necesitar adaptar el tamaño del grupo experimental o los puntos de tiempo de imagen dependiendo de la sensibilidad de la córnea.
La angiografía con fluoresceína se ha utilizado en gran medida cualitativamente para observar y clasificar patologías retinianas como fugas, así como patrones de alteración del flujo sanguíneo RVO6. Recientemente, se han realizado esfuerzos para desarrollar un análisis cuantitativo de AF en modelos animales, como el cálculo del área vascular y la tortuosidad16 y el análisis de regresión lineal de la temporalidad de la intensidad de la imagen17. La segmentación de los vasos principales del fondo de ojo se ha utilizado anteriormente, pero en un análisis de píxeles de la dinámica de relleno y descomposición, lo que demuestra la variabilidad en la intensidad de la imagen en diferentes ratones17. Además, se observó el potencial de sesgo en la interpretación del agrupamiento de fluoresceína17. El método cuantitativo discutido aquí apunta a la fuga de fluoresceína de la vasculatura retiniana principal, indicativo de la descomposición del BRB, que se ha demostrado que desempeña un papel en la lesión de la RVO11,12,14. Un análisis alternativo de fugas cuantifica la fuga de colorante en soportes planos retinianos22. Sin embargo, los análisis post-mortem invasivos son menos adecuados para los estudios de la línea de tiempo de la lesión por RVO dentro de un solo ratón, donde la fuga se estudia en múltiples puntos temporales. Los análisis del área de fuga de fluoresceína en diferentes etapas de la enfermedad retiniana han sido utilizados previamente en estudios clínicos y correlacionados con otras patologías de enfermedades observadas23. Este método permite un aprovechamiento similar de las imágenes de AF para estudiar la fuga del vaso in vivo, lo que permite el estudio de la dinámica de fugas dentro de la línea de tiempo de la lesión por RVO. Como la selección del área de fuga se basa en la selección del evaluador de una región, potencialmente introduce una mayor cantidad de variabilidad a través de la subjetividad. Además, dado que los estudios del modelo de lesión de RVO discutidos aquí investigan la fuga en toda la retina, hemos optado por utilizar una técnica de enmascaramiento para el cálculo. Este método de fuga refleja una faceta diferente del daño de la OVR de las reveladas por el análisis de rastreo de capas DRIL y OCT, y la correlación con estas medidas permite la creación de un perfil de enfermedad más preciso.
Presentamos dos métodos para la evaluación de imágenes OCT. La inflamación aguda y la posterior degeneración de las capas retinianas es un sello distintivo de la lesión por OVR 6,12. La metodología de rastreo de capas OCT detallada aquí permite el estudio preciso de capas individuales y revela efectos más sutiles y diferencias en la dinámica en diferentes regiones de la retina. Esta técnica de análisis se basa en otros protocolos comúnmente utilizados para la cuantificación del grosor de la capa retiniana en imágenes de OCT. Este método aborda la variación entre los protocolos en el área utilizada para estimar el grosor de la capa, así como el número de mediciones tomadas en la imagen11. Como el adelgazamiento no es uniforme dentro de cada capa de la retina, es poco probable que los métodos que utilizan menos mediciones puntuales den una imagen completa de los efectos de la lesión. El metanálisis de múltiples estrategias de medición para el grosor de la capa retiniana informó que los protocolos que promedian en áreas más grandes de la imagen de OCT mostraron una mayor correlación con la gravedad de la enfermedad, así como una mayor repetibilidad11. Al promediar toda la imagen, este método captura una representación más precisa del adelgazamiento de la retina presente en la lesión por OVR a largo plazo. Los estudios también difieren en términos de la ubicación donde se toman las imágenes de OCT: muchos estudios se centran en imágenes del nervio óptico. Por el contrario, el método presentado se centra en relación con las oclusiones. Un desarrollo reciente en el análisis de imágenes de OCT humana es el uso de algoritmos de aprendizaje automático para clasificar y cuantificar características24. Tales análisis podrían ser una dirección futura prometedora para el análisis de imágenes de retina animal.
Además, presentamos una traducción de DRIL, una medida clínica de isquemia capilar, en un modelo de roedor. En humanos, se ha encontrado que DRIL es un predictor de pérdida de agudeza visual y diferencias de grosor retiniano y ha demostrado alta sensibilidad diagnóstica y especificidad18,19. La cuantificación del DRIL en ratones midiendo la proporción de la retina que está desorganizada ha demostrado correlación con la fracción de venas ocluidas, la amplitud de la onda ERG b a los 7 días después de la OVR y el adelgazamiento de la retina a los 8 días después de la OVR12. Una alternativa a la medición de DRIL es el uso de HYPOX-4 para medir la hipoxia retiniana y el daño isquémico. HYPOX-4 une el clorhidrato de anime de pimonidazol, un marcador de hipoxia, con una sonda fluorescente para detectar la hipoxia retiniana25. La mayoría de los protocolos que utilizan HYPOX-4 son invasivos y requieren un análisis de montaje plano de la retina, que puede ser menos adecuado para la construcción de líneas de tiempo de lesiones, aunque recientemente se ha probado un protocolo de imagen in vivo que utiliza una sonda HYPOX-425. El análisis DRIL también es útil como una lectura rápida del daño retiniano, ya que las mediciones individuales en cada imagen OCT son más eficientes en el tiempo que los análisis como el trazado de la capa retiniana. Sin embargo, cabe señalar que estas medidas no son intercambiables y revelan diferentes patologías retinianas. Más bien, deben usarse en concierto, donde DRIL se puede usar como una lectura inicial para el tamaño del efecto o la eficacia de la intervención, y el rastreo de capas se puede emplear posteriormente para un análisis exhaustivo de los efectos más sutiles en las capas de la retina.
Estos métodos son de naturaleza ortogonal, lo que permite la creación de un perfil de enfermedad para cada sujeto experimental. Como las patologías reportadas por cada uno de estos métodos son distintas, no se garantiza que escalen proporcionalmente, y obtener una imagen más holística de la patología permitirá una investigación más rigurosa de las diferentes configuraciones de manifestación del daño por OVR. La capacidad de maximizar la cantidad de información que se puede extraer de la imagen de cada animal experimental reducirá el número de animales necesarios para sacar conclusiones significativas, mejorando la eficiencia del proceso experimental. La aplicación de estos métodos en protocolos de RVO recientemente refinados permite una mayor reproducibilidad y estudio de la traducción de fenotipos clínicos en modelos animales. Más allá del estudio de los modelos de RVO, el uso de estos métodos tiene aplicaciones a otros modelos de enfermedades de la retina que emplean imágenes de FA y OCT. Ejemplos de tales modelos de ratón incluyen los de edema macular relacionado con la edad (DMAE)26, edema macular diabético (EMD)23, neovascularización coroidea (NVC)27, uveoretinitis autoinmune experimental (EAU)28 y retinopatía del prematuro (ROP)15. Estos métodos pueden generalizarse aún más a los estudios que utilizan imágenes de AF y OCT en el estudio de modelos de estas enfermedades en otras especies. Estas cuantificaciones también son sensibles a cambios más sutiles en el mecanismo de la enfermedad, lo que las hace útiles en la evaluación de la eficacia del tratamiento, como en la Figura 3D y la Figura 4C. La utilidad también se extiende al uso de imágenes en pruebas de toxicidad en estudios de tolerabilidad de compuestos farmacológicos. La estandarización y reproducibilidad de estos protocolos de análisis puede servir para mejorar la validez traslacional de modelos animales y ampliar nuestra comprensión de la patogénesis y fisiopatología de la enfermedad retinovascular.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Programa de Becas de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias (NSF-GRFP) DGE - 1644869 (a CKCO), el Instituto Nacional del Ojo (NEI) 5T32EY013933 (a AMP), el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (RO1 NS081333, R03 NS099920 a CMT) y el Departamento de Defensa del Ejército / Fuerza Aérea (DURIP a CMT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AK-Fluor 10% | Akorn | NDC: 17478-253-10 | light-sensitive |
| Carprofen | Rimadyl | NADA #141-199 | keep at 4 °C |
| GenTeal | Alcon | 00658 06401 | |
| Image J | NIH | ||
| InSight 2D | Phoenix Technology Group | OCT analysis software | |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Phenylephrine | Akorn | NDCL174478-201-15 | |
| Phoenix Micron IV | Phoenix Technology Group | Retinal imaging microscope | |
| Phoenix Micron Meridian Module | Phoenix Technology Group | Laser photocoagulator software | |
| Phoenix Micron Optical Coherence Tomography Module | Phoenix Technology Group | OCT imaging software | |
| Phoenix Micron StreamPix Module | Phoenix Technology Group | Fundus imaging and acquisition targeting | |
| Photoshop | Adobe | ||
| Refresh | Allergan | 94170 | |
| Tropicamide | Akorn | NDC: 174478-102-12 | |
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
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