Summary
כאן אנו מציגים שלושה פרוטוקולי ניתוח נתונים עבור אנגיוגרפיה פלואורסצנטית (FA) וטומוגרפיה של קוהרנטיות אופטית (OCT) במחקר של חסימת ורידים ברשתית (RVO).
Abstract
ההתקדמות בכלי הדמיה אופתלמיים מציעה רמה חסרת תקדים של גישה לחוקרים העובדים עם מודלים של בעלי חיים של פגיעה נוירו-וסקולרית. כדי למנף כראוי את יכולת התרגום הגדולה הזו, יש צורך להמציא שיטות הניתנות לשחזור של ציור נתונים כמותיים מתמונות אלה. הדמיית טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT) יכולה לפתור היסטולוגיה של הרשתית ברזולוציית מיקרומטר ולחשוף הבדלים תפקודיים בזרימת הדם הווסקולרי. כאן, אנו מגדירים קריאות כלי דם לא פולשניות שבהן אנו משתמשים כדי לאפיין נזק פתולוגי לאחר עלבון כלי דם במודל עכבר אופטימלי של חסימת ורידים ברשתית (RVO). קריאות אלה כוללות ניתוח הדמיה חיה של מורפולוגיה ברשתית, חוסר ארגון של שכבות פנימיות ברשתית (DRIL) של איסכמיה נימית, ומדדי אנגיוגרפיה פלואורסצנטית של בצקת רשתית וצפיפות כלי דם. טכניקות אלה תואמות ישירות את אלה המשמשים לבדיקת חולים עם מחלת רשתית במרפאה. סטנדרטיזציה של שיטות אלה מאפשרת השוואה ישירה וניתנת לשחזור של מודלים של בעלי חיים עם פנוטיפים קליניים של מחלות עיניים, ומגדילה את כוח התרגום של מודלים של פגיעה בכלי הדם.
Introduction
מחלות נוירו-וסקולריות הן בעיה בריאותית מרכזית האחראית לשבץ איסכמי, הגורם המוביל לתמותה ותחלואה, ולמחלות כלי דם ברשתית המובילות לאובדן ראייה 1,2. כדי ליצור מודלים של מחלות נוירו-וסקולריות, אנו משתמשים במודל עכברי של חסימת ורידים ברשתית (RVO). מודל זה אינו פולשני ומשתמש בטכניקות הדמיה דומות של in vivo לאלה המשמשות לבדיקת אנשים עם מחלות כלי דם ברשתית במסגרת קלינית. השימוש במודל זה מגדיל אפוא את הפוטנציאל התרגומי של מחקרים המשתמשים במודל זה. כמו בכל דגמי העכברים, חיוני למקסם את יכולת השחזור של המודל.
מחלות כלי דם ברשתית הן גורם מרכזי לאובדן ראייה אצל אנשים מתחת לגיל 70. RVO היא מחלת כלי הדם השנייה בשכיחותה ברשתית אחרי רטינופתיה סוכרתית3. המאפיינים הקליניים האופייניים ל-RVO כוללים פגיעה איסכמית, בצקת ברשתית ואובדן ראייה כתוצאה מאובדן עצבי 3,4. מודלים של עכברים של RVO באמצעות פוטוקואגולציה בלייזר של כלי שיט עיקריים פותחו ושוכללו כדי לשכפל פתולוגיות קליניות מרכזיות שנצפו ב- RVO 5,6,7 אנושי. ההתקדמות בהדמיה אופתלמית מאפשרת גם שכפול של כלי אבחון לא פולשניים המשמשים בבני אדם, כלומר, אנגיוגרפיה פלואורסצנטית (FA) וטומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT)6. אנגיוגרפיה פלואורסצנטית מאפשרת תצפית על דליפה עקב פירוק מחסום הדם-רשתית (BRB) וכן דינמיקה של זרימת הדם ברשתית, כולל אתרי חסימה, באמצעות הזרקת פלואורסצין, צבע פלואורסצנטי קטן 8,9. הדמיית OCT מאפשרת רכישת תמונות חתך ברזולוציה גבוהה של הרשתית וחקר העובי והארגון של שכבות הרשתית10. ניתוח תמונות FA היה מבחינה היסטורית איכותי במידה רבה, מה שמגביל את הפוטנציאל להשוואה ישירה וניתנת לשחזור בין מחקרים. לאחרונה פותחו מספר שיטות לכימות עובי שכבה בהדמיית OCT, אם כי אין כיום פרוטוקול ניתוח סטנדרטי והאתר של רכישת תמונות OCT משתנה11. על מנת למנף כראוי כלים אלה, יש צורך במתודולוגיית ניתוח נתונים סטנדרטית, כמותית וניתנת לשכפול. במאמר זה אנו מציגים שלוש קריאות כלי דם כאלה המשמשות להערכת נזק פתולוגי במודל עכבר של דליפת RVO-פלואורסצין, עובי שכבת OCT וחוסר ארגון של שכבות הרשתית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה תואם את הצהרת האגודה לחקר ראייה ועיניים (ARVO) לשימוש בבעלי חיים בחקר העיניים והראייה. ניסויים במכרסמים אושרו ונוטרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת קולומביה.
הערה: ההדמיה נעשתה על עכברים זכרים C57BL/6J בני חודשיים ששקלו כ-23 גרם.
1. הכנת ריאגנטים להדמיית רשתית
- הכנת תמיסת פלואורסצין להזרקה.
הערה: פלואורסצין רגיש מאוד לאור. יש להגן מפני אור ולהשתמש בו זמן קצר לאחר ההכנה.- יש לדלל פלואורסצין לריכוז של 1% במי מלח סטריליים.
- הכנת קטמין/קסילזין
- יש לדלל קטמין וקסילזין בתמיסת מלח סטרילית בהתאם לריכוז הבא: קטמין (80-100 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (5-10 מ"ג/ק"ג).
- תמיסת מלח סטרילית
- הכן מזרק 5 מ"ל עם מחט 26 גרם עם מלוחים סטריליים.
2. OCT והדמיית פלואורסצין
- הפעל את תיבת התאורה של מיקרוסקופ הדמיית הרשתית, את מכשיר ה-OCT ואת פלטפורמת העכבר המחוממת.
- הפעל את המחשב ופתח את תוכנית ההדמיה.
- הוסיפו טיפה אחת של פנילפרין וטרופיקמיד לכל עין.
- להזריק 150 μL של הרדמה (קטמין (80-100 מ"ג / ק"ג) וקסילזין (5-10 מ"ג / ק"ג)) intraperitoneally (IP). קבע את עומק ההרדמה על ידי צביטה בבוהן והמתן עד שהחיה לא מגיבה. יש למרוח משחת עיניים או דמעות מלאכותיות על שתי העיניים.
- התאימו את העכבר לרציף.
- התאימו את הגובה והזווית של הפלטפורמה עד שהתצוגה של פונדוס הרשתית תהיה ברורה וממוקדת. צלם תמונה של הפונדוס.
- פתח את תוכנת ההדמיה וה- OCT. בתוכנית OCT, התאם את הנדנוד ל-5.
- צלם תמונת OCT במרחק של 75 מיקרומטר דיסטלי מהכוויה. חזור על הפעולה עבור שלושת הרבעים האחרים של הרשתית.
- להזריק 100 μL של 1% פלואורסצין IP.
- החלף את המצלמה למסנן של 488 ננומטר. הגדל את רווח המצלמה ל-5.
- צלם תמונה של הפונדוס בדיוק 5 דקות לאחר הזרקת פלואורסצין.
הערה: הימנע מחשיפה ממושכת של העין לאור המצלמה בהגדרה מרבית, מכיוון שפלואורסצאין עלול להחמיר את נזקי הרשתית. יש להרחיק את מקור האור עד שחלף זמן ההמתנה של 5 דקות והעכבר מוכן להדמיה.
3. טיפול לאחר הטיפול
- להזריק 1 מ"ל של IP מלוחים סטרילי. יש למרוח טיפות עיניים עם חומר סיכה על שתי העיניים. יש למרוח משחת עיניים או דמעות מלאכותיות על שתי העיניים.
- התבונן בעכבר כשהוא מתאושש מהרדמה. חזרו לכלוב עם בעלי חיים אחרים רק לאחר החלמה מלאה, בדרך כלל לאחר כ-40 דקות.
4. הערכה לקריטריונים לאי-הכללה
- פתח את תמונת הפונדוס שצולמה בשעה 24 שעות לאחר ההליך כדי להעריך קריטריונים לאי-הכללה. אל תכלול את העין אם אחד מהקריטריונים הבאים מזוהה.
- הערך אם לתמונה יש אפס חסימות
- הערך את התמונה עבור מספר כלי ההסתרה.
הערה: חסימה מוצלחת כוללת בדרך כלל פיגמנטציה סגולה כלשהי על הכוויה או סביבה, כלי דם דק מאוד או לא רציף דרך הצריבה, מראה כלי דם קלוש או לא קיים מחוץ לאזור הכוויה, ושינוי צבע הרשתית מהיפוקסיה. אם ניתן לראות את כל הכלי דרך הכוויה הלבנה על ידי הלייזר, הכלי לא הצליח להסתיר. לפעמים הכלי ייראה חסום חלקית, אבל אם הוא נראה ללא הפרעה מחוץ לכוויה, סביר להניח שהכלי לא הסתתר. - במקרים מעורפלים, השתמש בהדמיית FA באותה נקודת זמן כדי להעריך חסימות. בתמונות אלה, חסימה תופיע כשבירה בהמשכיות של כלי השיט, לעתים קרובות עם התחדדות של כלי השיט שמסביב.
- אם מזוהים אפס חסימות, להוציא את העין מן הניתוח, כמו RVO נחשב יעיל.
הערה: הסתרות נפתרות בדרך כלל על ידי 48-72 שעות לאחר RVO, ואין להשתמש עוד בנוכחות של חסימות כקריטריון אי הכללה בנקודות זמן אלה.
- הערך את התמונה עבור מספר כלי ההסתרה.
- להעריך את תמונות הפונדוס וה-OCT לניתוק יתר של הרשתית
הערה: הצטברות נוזל תת-קרקעי נפוצה לאחר אינדוקציה של RVO, וגורמת להפרדה של הרשתית העצבית מ-RPE. קריטריונים לא כוללים לניתוק יתר של הרשתית מוגדרים באופן הבא: OCT יהיה בלתי ניתן לצפייה לחלוטין, או ששכבות מסוימות ייראו מעוותות להפליא. איכות התמונה ירודה, עם אובדן רזולוציה של שכבות plexiform ו- RPE חיצוניות. ההפרדה בין הרשתית העצבית לבין הכורואיד גדולה ממה ששדה הראייה OCT מאפשר. בתמונת הפונדוס, גוון הרשתית יהיה לבן כמעט לחלוטין, עם כתם סגול כלשהו. חלק מהרשתית עשוי להיראות מעוות ולא ממוקד. הסיבה לכך היא שהוא התנתק ונמצא במרחק מוקד שונה משאר הרשתית.- אם הערכת התמונות מעין קובעת ניתוק היקפי או מלא של הרשתית, אל תכלול את העין מהניתוח.
- לא לכלול תמונות עם עדות לקטרקט הקרנית
הערה: קטרקט הקרנית מופיע כנקודה לבנה אטומה על הקרנית של העכבר. קטרקט מתרחש בדרך כלל עקב שימון לא מספיק של העיניים בזמן שבעל החיים מורדם וניתן להימנע ממנו במידה רבה על ידי הקפדה על מריחת משחת עיניים בנדיבות. בדרך כלל ניתן לזהות קטרקט לפני ההדמיה על ידי בדיקת החיה. עכברים שפיתחו קטרקט צריכים להיות מחוץ למערך הנתונים ללא צורך לעבור את תהליך ההדמיה. בהדמיה, קטרקט יסתיר את הרשתית מהמצלמה, וה- OCT ייראה מעוות. - להעריך את התמונה עבור דימום מוגזם
הערה: ניתן לזהות דימום מוגזם ככמויות של נוזל אדום בתמונה, בדרך כלל תוך טשטוש רקע הרשתית, כלי הדם והכוויה. אזורים אלה של נוזל אדום יהיו אדומים בהירים ואטומים יותר מאשר הכתמים הסגולים הרגילים ב-RVO מוצלח. דימומים מופיעים בשכבת תאי הגנגליון בהדמיית OCT ומפריעים ליכולת לדמיין שכבות רשתית אחרות מתחת לדימום.- אם התמונה נקבעת שיש דימום מוגזם, להוציא את העין מן הניתוח.
5. עיבוד תמונה פלואורסציני
- פתח את תמונת הפלואורסצין בתוכנת עיבוד התמונה.
- שכפול התמונה
- באמצעות כלי בחירה, לעקוב בקפידה אחר הכלים העיקריים.
- כלי הדם העיקריים הם הוורידים והעורקים העבים יותר המקרינים מתוך הדיסק האופטי. התעלמו מכל כלי שיט המסתעפים מכלי שיט אלה.
- אם דליפה מונעת את קווי המתאר של כלי השיט מלהיראות ליד אתר החסימה, עקבו אחר הדליפה במיקום המשוער של כלי השיט (שמרו על עובי, חברו את הנקודה הגלויה האחרונה לנקודה הנראית הבאה).
- בתמונה הראשונה, מחק את הבחירה והשאר רק את הרקע. שמור תמונה מוסווית זו.
- הזיזו את הבחירה לתמונה השנייה, הפכו את הבחירה ומחקו, תוך בידוד הכלים. שמור תמונה מוסווית זו.
- פתחו את שתי התמונות ב-ImageJ. פתח את תמונת הרקע ומדוד את הצפיפות המשולבת.
- פתח את תמונת כלי השיט, בחר את קווי המתאר של כלי השיט ולאחר מכן מדוד את העוצמה הממוצעת.
- חלקו את הצפיפות המשולבת של הרקע בעוצמה הממוצעת של כלי הדם, ויצרו את יחס הדליפה לעין.
- רשום את יחס הדליפה הזה עבור כל עין בקבוצת ניסוי.
- כדי להגביר את השליטה על הרקע, נרמלו את העיניים הניסיוניות ליחס הדליפה הממוצע של עיני בקרה לא פגועות.
הערה: על מנת ליצור כימות סטנדרטי של דליפת פלואורסצין בתמונת FA, חישוב זה משתמש ביחס של צפיפות הרקע (היכן תהיה הדליפה) עם בהירות כלי הדם העיקריים כדי ליצור תוצאות השולטות בשונות בבהירות מתמונה לתמונה וניתן לכמת אותן באופן מהימן. עיניים שאינן פגומות אינן דולפות ובאופן תיאורטי אמורות להיות בעלות יחסים של אפס. היחסים המחושבים מעיני בקרה לא פגומות אלה, אם כן, מייצגים רעשי רקע, וערך זה משמש לנרמול נוסף של ערכים ניסיוניים.
6. עובי שכבת הרשתית
- פתח את תמונת OCT בתוכנת עיבוד התמונה.
- עקוב אחר הגבולות של שכבת תאי הגנגליון, שכבת הפרספקס הפנימית, השכבה הגרעינית הפנימית, שכבת הפלקסיפורם החיצונית, שכבת הפוטורצפטור ושכבת RPE. מדוד את העובי הממוצע של כל שכבה.
- חזרו על הפעולה לקבלת תמונות OCT משלושת הרבעים האחרים של הרשתית. ממוצע עובי השכבה הממוצע על פני ארבעת הרבעים כדי לקבל את העובי הממוצע של כל שכבת רשתית לעין.
- יש לחזור על הפעולה עבור כל עין בקבוצת הניסוי.
7. חוסר ארגון של שכבות פנימיות ברשתית (DRIL)
- פתחו את תמונת ה-OCT ב-ImageJ.
- בעזרת הכלי קו, מדוד את המרחק שבו הגבול העליון של שכבת הפרספקס החיצונית אינו ברור.
הערה: חשוב להבדיל בין DRIL לבין אזורים בעלי נראות שכבה לקויה הנגרמת על-ידי ממצאי הדמיה. איכות תמונה ירודה של OCT עלולה לפסול עין לניתוח DRIL אם רזולוציית תמונה מספקת אינה אפשרית. תמונות עם DRIL יכללו בדרך כלל אזורים אחרים או שכבות רשתית שנפתרו ואורגנו בבירור, מה שיכול להוות אינדיקציה טובה לאיכות תמונה מספקת.- מדוד אופקית מקו הרוחב שבו מתחיל חוסר הארגון ועד לקו הרוחב שבו הגבול העליון של שכבת הפלקסיפום החיצונית הופך שוב לגלוי, אם בכלל. גם אם שכבת הפרספקס החיצונית זזה כלפי מעלה או כלפי מטה אנכית, יש למדוד בצורה אופקית מושלמת.
- ייתכנו מספר אזורים של אי-ארגון המופרדים על-ידי אזורים ללא אי-ארגון. מדוד אותם בנפרד וחשב את סכום המרחקים.
- חלקו את אורך אי-הארגון באורך הכולל של הרשתית הנראית בכל תמונת OCT כדי לקבל את יחס אי-הארגון של התמונה.
- חזור על המדידה והחישוב עבור תמונות OCT משלושת הרבעים האחרים של הרשתית.
- קח את הממוצע של יחסי חוסר הארגון מארבע תמונות OCT. מספר זה מייצג את חוסר הארגון הממוצע עבור הרשתית כולה. יש לחזור על הפעולה עבור כל עין בקבוצת הניסוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שיטות ניתוח אלה מאפשרות כימות של פתולוגיה רשתית שנלכדה על ידי הדמיית FA ו- OCT. בניסויים שמהם מופקים הנתונים המייצגים נעשה שימוש בעכברים זכרים C57BL/6J ששימשו כבקרות לא מרוסנות או עברו את הליך ה-RVO וקיבלו טיפות עיניים לטיפול Pen1-XBir3 או טיפות עיניים של Pen1-Saline. מודל הפציעה של RVO כלל את קרינת הלייזר (532 ננומטר) של הוורידים העיקריים בכל עין של עכבר מורדם בעקבות הזרקת ורד-וריד של ורד בנגל, צבע פוטואקטיבטור12. שלוש פעימות לייזר הועברו במרחק ממוצע של 375 מיקרומטר ממרכז עצב הראייה כדי לגרום לפוטוקואגולציה ולסתום את כלי הדם12. שימוש יעיל בהליך RVO מודגם ב- Avrutsky et al.12, ופרטים נוספים על אופטימיזציה של שיטת RVO מפורטים ב- Colón Ortiz et al.13. איור 1A מציג דוגמאות של תמונות FA ו-OCT משתי הקבוצות. בשל האופי המשתנה של היווצרות חסימה וייצוב באמצעות תהליך הפוטוקואגולציה, ניתן להבחין בדרגות שונות של נזק. בחלק מהרשתיות, הנזק שנגרם על ידי הליך RVO מציג פתולוגיות עיניים שהופכות את תמונות הרשתית לבלתי מתאימות לניתוח. לאחר הרכישה, יש להעריך תחילה תמונות עבור קריטריונים לאי-הכללה כדי להבטיח ניתוח אופטימלי ותוצאות אמינות. קריטריוני ההדרה האלה, המפורטים באיור 1B, כוללים ניתוק רשתית, דימום וקטרקט. כפי שניתן לראות בתמונות הדוגמה של פונדוס ו- OCT, פתולוגיות אלה מונעות הדמיה ברורה של OCT, מה שהופך את הרשתיות ללא מתאימות לניתוח נתונים. בנוסף, ייתכן שחלק מהרשתיות לא יכילו חסימות יציבות; תמונות אלה אינן מדגימות במדויק נזק איסכמי-היפוקסי ויש לשלול אותן מהניתוח.
התמוטטות מחסום הרשתית בדם תורמת לפתוגנזה של RVO14,15. הערכת כמות הדליפה מכלי הדם היא אינדיקטור שימושי לחדירות כלי הנגרמת על ידי פציעה. הדמיית FA מאפשרת הדמיה של דליפה זו, אך מספר גורמים, כגון הבדלים בקצב הסירקולציה, משפיעים על העוצמה הגולמית של תמונות FA ויוצריםכימות עקבי של 16,17. השיטה שלנו שולטת בשונות זו על ידי נרמול העוצמה הנצפית ברשתית לעוצמה הממוצעת של כלי הדם העיקריים. זה מספק יחס של דליפה עבור כל תמונת רשתית שניתן להשוות לאחרים ולנתח. איור 2A מדגים את תמונות המסכות המשמשות לחישוב זה, ומפרידות את כלי הדם העיקריים משאר האזורים של הרשתית. היכולת לכמת פלואורסצין מאפשרת השוואה של חומרת הפציעה ויעילות הטיפול, כמו גם מחקר של שינויים בדליפה במהלך זמן הפציעה (איור 2B), שעשויים להיות בעלי השפעה עדינה מכדי להדגים באמצעות דיווח איכותי בלבד.
הדמיית OCT מאפשרת ניתוח ההשפעה של RVO על שכבות רשתית בודדות ועובי הרשתית הכולל. איור 3A מראה תיחום של שכבות הרשתית בתמונת OCT. התחקות אחר הגבולות של כל שכבה (איור 3B) מאפשרת מספר אפיקי ניתוח. כימות העובי של כל שכבת רשתית מוכיח את עצמו כמועיל, שכן לתגובה הראשונית של הרשתית יש השפעה עמוקה יותר על שכבות הרשתית הפנימיות. עקבות מאפשרים גם לחקור את עובי הרשתית הכולל וניתוח מופרד של שכבות הרשתית הפנימית לעומת החיצונית. איור 3C מספק ניתוח של מהלך זמן של נזק ל-RVO, שבו ניתן לראות את הנפיחות הדלקתית הראשונית של שכבות הרשתית ואת הדילול הניווני בסופו של דבר. התוויית העובי של כל שכבה לאורך זמן חושפת דינמיקה שונה עבור שכבת הפרספקס הפנימית והשכבה הגרעינית הפנימית, שבהן השכבה הגרעינית הפנימית חווה תגובה הרבה יותר גדולה לפגיעה הראשונית, אך שכבת הפלקסיפורם הפנימית מדגימה דילול חמור יותר לאחר שהבצקת הראשונית התייצבה וחזרה לנקודת ההתחלה (איור 3D ). זה מעניק הבנה מדויקת יותר של מניעי התגובה בנקודות זמן שונות. בדקנו גם את היעילות של מעכב קספאז בהפחתת נפיחות והגנה מפני ניוון בסופו של דבר, כאשר ניתוח גילה השפעות שונות בשכבות בודדות.
חוסר הארגון של שכבות הרשתית הפנימיות (DRIL) הוא תכונה נוספת של OCT המשמשת כמדד אבחון של איסכמיה ברטינופתיה סוכרתית, כמו גם מדד ניבוי של חדות הראייה ב- RVO18,19. בהדמיית OCT, DRIL מתבטא בהיעלמות של הגבול העליון של שכבת הפלקסיפום החיצונית12, תוך מיזוג השכבות החיצוניות-פרספקס והפנימיות יחד (איור 4A). איור 4B מציג שתי דוגמאות של תמונות OCT עם אזורים מודגשים של DRIL. אנו מבטאים DRIL כשיעור מאורך הרשתית הכולל, ממוצע על פני ארבעה חתכי OCT. מדד זה מאפשר לנו להשוות באופן כמותי בין קבוצות ניסוי; איור 4C מציג ניתוח לדוגמה, שבו הושווה חוסר הארגון ברשתית של שתי קבוצות ניסוי כדי לחקור את היעילות של מעכב בהפחתת נזק לרשתית ב-RVO.
איור 1: תמונות המתקבלות מאנגיוגרפיה פלואורסצנטית (FA) ומהדמיית טומוגרפיה של קוהרנטיות אופטית (OCT). (A) דוגמאות לתמונות FA ו-OCT מרשתיות 24 שעות לאחר RVO ובקרות שלא נפגעו. (B) הדמיית פונדוס ו-OCT של קריטריוני ההדרה השונים: ניתוק יתר ברשתית, דימום, קטרקט בקרנית, וללא חסימות. מרחק רכישת OCT מסומן על ידי ההנחיה הירוקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: כימות של דליפת פלואורסצין. (A) הפרדת תמונת ה-FA לתוך כלי הדם והרקע לניתוח (B) כימות דליפת פלואורסצין מעיניהם של עכברי C57BL/6J עם ורידים סמויים (RVO) המקבלים 10 מ"ג של טיפות עיניים מעכבות Pen1-XBir3 (N = 17) או טיפות עיניים של כלי רכב Pen1-Saline (N = 13) ב-24 שעות ו-48 שעות לאחר ההליך. קריאת העוצמה של תמונת הרקע מנורמלת לקריאת העוצמה הממוצעת מתמונת הכלי. הממוצע של עוצמת הקריאה עבור עכברי RVO מנורמל עוד יותר לפקדים שאינם נגועים. קווי שגיאה מראים ממוצע עם SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: כימות עובי שכבת הרשתית בתמונות OCT. (A) רשתית לא מרוסנת עם שכבות רשתית בודדות המסומנות: שכבת תאי גנגליון, שכבת פרספקס פנימית, שכבה גרעינית פנימית, שכבת פלקסיפורם חיצונית, שכבת פוטורצפטור, RPE וכורואיד. (B) דוגמה לעקבות שכבה של תמונות OCT שצולמו מעכברי בקרה לא נגועים ועכברי 24 שעות לאחר RVO C57/BL6. (C) כימות השינוי בעובי הרשתית הכולל ובעובי התוך-רשתית שנצפה בהדמיית OCT של רשתיות עכברים C57BL/6J ב-4 שעות, 24 שעות, 48 שעות, 72 שעות ו-8 ימים לאחר RVO. (D) כימות שינוי העובי בשכבות הפנימיות של הפרספקס הפנימי והגרעיני הפנימי של רשתיות עכברים C57BL/6J ב-24 שעות, 48 שעות ו-8 ימים לאחר RVO עבור עכברי C57BL/6J המקבלים 10 מ"ג של טיפות עיניים מעכבות Pen1-XBir3 (N = 14) או טיפות עיניים של כלי רכב Pen1-Saline (N = 15) מיד לאחר הליך RVO ו-24 שעות לאחר RVO. קווי שגיאה מראים ממוצע עם SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: כימות של חוסר הארגון של שכבות הרשתית הפנימיות (DRIL) שנצפו בתמונות OCT לאחר RVO. בתמונות OCT, DRIL מסומן על ידי אובדן של תיחום ברור בין השכבות הגרעיניות הפנימיות והחיצוניות. (A) דוגמאות למקטעים של הרשתית עם ובלי DRIL בהדמיית OCT. (B) אזורים של DRIL בהדמיית OCT של שני אזורים בעכבר C57BL/6J 24 שעות לאחר RVO, מסומנים על ידי קווים לבנים. DRIL נמדד אופקית על פני התמונה במקום לעקוב אחר צורת הרשתית. (C) כימות היחס בין אורך הרשתית כאשר DRIL נצפה ב-24 שעות ו-48 שעות לאחר RVO עבור עיניהם של עכברי C57BL/6J שקיבלו 2.5 מ"ג של טיפות עיניים מעכבות Pen1-XBir3 (N = 19) או טיפות עיניים של רכב Pen1-Saline (N = 21) לאחר הליך RVO. קווי שגיאה מראים ממוצע עם SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הדמיית רשתית מכרסמים לא פולשנית מציגה דרך לחקור פתולוגיה ולפתח התערבויות. מחקרים קודמים פיתחו וייעלו מודל עכברי של RVO, המגבילים את השונות ומאפשרים תרגום אמין של פתולוגיות קליניות נפוצות ברשתית מורין 5,7,13. התפתחויות בטכנולוגיית דימות עיניים מאפשרות עוד יותר שימוש בטכניקות הדמיה קליניות in vivo כגון FA ו- OCT בחיות ניסוי, ומעניקות את היכולת להשוות מודלים של עכברים עם פרופילים של מחלות אנושיות 6,12,15. עם זאת, כדי למקסם את המידע שניתן לחלץ מתמונות אלה ואת הפוטנציאל התרגומי הכולל של המודל, יש צורך בשיטות כמותיות סטנדרטיות, ניתנות לשחזור וקפדניות לניתוח תמונות. כאן אנו מציגים שיטות ניתוח המאפשרות ייצוגים כמותיים של חומרת הנזק, ומאפשרות השוואות מדויקות ואמינות יותר בין עכברים ובין קבוצות ניסוי. ניתוחים אלה כוללים כימות דליפה בתמונות FA, כימות עובי שכבה ממוצע ואזורים של DRIL בתמונות OCT.
גורם קריטי בניתוח מוצלח טמון באיכות התמונות שנרכשו. תמונות OCT שנפתרו בצורה גרועה עלולות להוביל לקושי במעקב אחר שכבות בודדות ולחוסר יכולת להבחין בין חוסר ארגון ברשתית הפנימית לבין איכות תמונה ירודה. בעת ההדמיה, חשוב לדאוג למיקום העכבר על הפלטפורמה, ולוודא שתמונת הפונדוס ממוקדת, עצב הראייה מרוכז יחסית, וחתך הרשתית אופקי לרוחב התמונה. שימון עקבי של העיניים בזמן שהחיה מורדמת חשוב גם הוא, במיוחד כאשר אותה חיה מצולמת מספר ימים. שימון לא מספיק עלול לגרום לקטרקט הקרנית, אשר יסתיר את הרשתית ויהפוך אותה ללא מתאימה להדמיה. פתולוגיות רשתית שונות עלולות להתרחש בהדמיית RVO, מה שהופך את התמונות ללא מתאימות לניתוח. אלה כוללים ניתוק רשתית מוגזם ודימום מוגזם, אשר, יחד עם פגיעה רבה באיכות ההדמיה, מייצגים גם מידה של נזק כי הוא חמור מדי לשימוש כמודל של RVO. בנוסף, כל כלי השיט הסגורים יכולים לחזור באופן מלא זמן קצר לאחר הפציעה, מה שלא ידגים במדויק נזק RVO ויש להשתמש בו כקריטריון להדרה. עם זאת, חשוב לציין כי חסימות מוצלחות ייפתרו באופן טבעי על ידי 48-72 שעות לאחר הפציעה, ונוכחות של חסימות כקריטריון הרחקה משמשת בצורה הטובה ביותר ב 24 שעות לאחר ההליך או לפני כן. Colón Ortiz et al.13 מפרטים שיטות עבודה מומלצות להגבלת השתנות וכיול פציעות במודל ממוטב להליך RVO. הזיהוי והשיפוט של קריטריוני ההדרה הוא גם צעד קריטי לניתוח תמונה. מכיוון שהדבר נתון במידה רבה לשיקול דעתו של המאבחן, חשוב שהמעריכים יהיו עיוורים לקבוצות הטיפול ויתרגלו עקביות בשיפוט חומרת הפתולוגיה. קיימות מגבלות מסוימות ביישום שיטות אלה, במיוחד בפרקטיקה של הדמיית אותו עכבר בנקודות זמן מרובות. יש גבול לתדירות שבה ניתן להרדים עכבר לצורך הדמיה, מה שמחייב בדיקה והתאמה של נקודות זמן כדי לקבוע את מהלך הזמן האופטימלי. המחקרים שלנו משתמשים בנקודות זמן של הדמיה ב-4 שעות, 24 שעות, 48 שעות ו-8 ימים, שבהן מצאנו שלבי לכידה של פגיעה ראשונית, תגובה דלקתית חריפה ופציעה ארוכת טווח12. בנוסף, זנים מסוימים של עכברים נוטים יותר להתפתחות קטרקט של הקרנית, הכוללים מודלים שונים של עכברים סוכרתיים, מה שעלול להוביל למספר רב של החרגות או קורסי זמן לא שלמים20,21. מחקרים המשתמשים בקווי עכבר כאלה עשויים להידרש להתאים את גודל קבוצת הניסוי או נקודות זמן הדמיה בהתאם לרגישות הקרנית.
הדמיית אנגיוגרפיה פלואורסצנטית שימשה במידה רבה מבחינה איכותית כדי לבחון ולדרג פתולוגיות רשתית כגון דליפה, כמו גם דפוסים של זרימת דם משתנה RVO6. לאחרונה, נעשו מאמצים לפתח ניתוח כמותי של FA במודלים של בעלי חיים, כגון חישוב אזור כלי הדם והטורטואוזיות16 וניתוח רגרסיה ליניארית של טמפורליות עוצמת תמונה17. בעבר נעשה שימוש בפילוח של כלי הדם העיקריים מרקע הפונדוס, אך בניתוח פיקסלים של דינמיקת מילוי ודעיכה, המעידה על השונות בעוצמת התמונה בעכברים שונים17. בנוסף, הפוטנציאל להטיה צוין בפרשנות של איגום פלואורסצין17. השיטה הכמותית הנדונה כאן מתמקדת בדליפה של פלואורסצין מכלי הדם העיקריים ברשתית, המעידה על פירוק ה-BRB, שהוכח כממלא תפקיד בפגיעה ב-RVO11,12,14. ניתוח חלופי של דליפה מכמת דליפת צבע על תושבות שטוחות רשתית22. עם זאת, ניתוחים פולשניים לאחר המוות פחות מתאימים למחקרים על ציר הזמן של פגיעה ב-RVO בעכבר יחיד, שבו הדליפה נחקרת במספר נקודות זמן. ניתוחים של אזור דליפת פלואורסצין בשלבים שונים של מחלת הרשתית שימשו בעבר במחקרים קליניים ומתואמים עם פתולוגיות מחלה אחרות שנצפו23. שיטה זו מאפשרת מינוף דומה של תמונות FA לחקר דליפת כלי דם in vivo, ומאפשרת לחקור את דינמיקת הדליפה בתוך ציר הזמן של פגיעת RVO. מכיוון שבחירת אזור הדליפה מסתמכת על בחירת מעריך של אזור, היא עשויה להציג כמות גדולה יותר של השתנות באמצעות סובייקטיביות. יתר על כן, מכיוון שהמחקרים של מודל הפציעה RVO שנדונו כאן חוקרים דליפה לאורך הרשתית, בחרנו במקום זאת להשתמש בטכניקת מיסוך לחישוב. שיטת דליפה זו משקפת פן שונה של נזקי RVO מאלו שנחשפו על ידי ניתוח מעקב אחר שכבות DRIL ו- OCT, והמתאם עם אמצעים אלה מאפשר יצירת פרופיל מחלה מדויק יותר.
אנו מציגים שתי שיטות להערכת תמונות OCT. דלקת חריפה והתנוונות לאחר מכן של שכבות הרשתית היא סימן היכר של פגיעת RVO 6,12. מתודולוגיית מעקב השכבות OCT המפורטת כאן מאפשרת מחקר מדויק של שכבות בודדות וחושפת השפעות עדינות יותר והבדלים בדינמיקה באזורים שונים של הרשתית. טכניקת ניתוח זו מתבססת על פרוטוקולים נפוצים אחרים לכימות עובי שכבת הרשתית בהדמיית OCT. שיטה זו מטפלת בשונות בין הפרוטוקולים באזור המשמש להערכת עובי השכבה, וכן במספר המדידות שבוצעו בתמונה11. מכיוון שדילול אינו אחיד בכל שכבת רשתית, שיטות המשתמשות בפחות מדידות נקודתיות לא צפויות לתת תמונה מלאה של השפעות הפציעה. מטא-אנליזה של אסטרטגיות מדידה מרובות לעובי שכבת הרשתית דיווחה כי ממוצעים של פרוטוקולים על פני אזורים גדולים יותר של תמונת OCT הראו מתאם גבוה יותר עם חומרת המחלה, כמו גם יכולת חזרה גבוהה יותר11. על ידי ממוצע על פני התמונה כולה, שיטה זו לוכדת ייצוג מדויק יותר של הידלדלות הרשתית הקיימת בפציעת RVO ארוכת טווח. המחקרים נבדלים זה מזה גם מבחינת המיקום שבו נלקחות תמונות OCT - מחקרים רבים מרכזים הדמיה על עצב הראייה. לעומת זאת, השיטה המוצגת מתרכזת ביחס לחסימות. התפתחות אחרונה בניתוח הדמיית OCT אנושית היא השימוש באלגוריתמים של למידת מכונה כדי לסווג ולכמת תכונות24. ניתוחים כאלה יכולים להיות כיוון עתידי מבטיח לניתוח הדמיית רשתית של בעלי חיים.
בנוסף, אנו מציגים תרגום של DRIL, מדד קליני של איסכמיה נימרית, למודל מכרסמים. בבני אדם, DRIL נמצא כמנבא של אובדן חדות ראייה והבדלים בעובי הרשתית והדגים רגישות וספציפיות אבחונית גבוהה18,19. כימות ה-DRIL בעכברים על ידי מדידת שיעור הרשתית שאינה מאורגנת הראה מתאם עם החלק של הוורידים החסומים, משרעת גל ERG b ב-7 ימים לאחר RVO, והידלדלות הרשתית ב-8 ימים לאחר RVO12. חלופה למדידת DRIL היא השימוש ב- HYPOX-4 למדידת היפוקסיה ברשתית ונזק איסכמי. HYPOX-4 מצטרף לאנימה הידרוכלוריד, סמן היפוקסיה, עם בדיקה פלואורסצנטית לאיתור היפוקסיה רשתית25. רוב הפרוטוקולים המשתמשים ב- HYPOX-4 הם פולשניים ודורשים ניתוח הרכבה שטוחה ברשתית, אשר עשוי להיות פחות מתאים לבניית לוחות זמנים של פציעה, אם כי פרוטוקול הדמיה in vivo באמצעות בדיקה HYPOX-4 נוסהלאחרונה 25. ניתוח DRIL שימושי גם כקריאה מהירה של נזק לרשתית, מכיוון שמדידות בודדות בכל תמונת OCT יעילות יותר בזמן מאשר ניתוחים כגון מעקב אחר שכבת הרשתית. עם זאת, יש לציין כי אמצעים אלה אינם ניתנים להחלפה וחושפים פתולוגיות רשתית שונות. במקום זאת, יש להשתמש בהם בתיאום, כאשר DRIL יכול לשמש כקריאה ראשונית לגודל האפקט או ליעילות ההתערבות, וניתן להשתמש לאחר מכן במעקב אחר שכבות לניתוח מעמיק של השפעות עדינות יותר בשכבות הרשתית.
שיטות אלה הן אורתוגונליות באופיין, מה שמאפשר יצירת פרופיל מחלה לכל נושא ניסוי. מכיוון שהפתולוגיות המדווחות על ידי כל אחת מהשיטות הללו נבדלות זו מזו, הן אינן מובטחות בקנה מידה פרופורציונלי, וקבלת תמונה הוליסטית יותר של הפתולוגיה תאפשר חקירה קפדנית יותר של תצורות הביטוי השונות של נזקי RVO. היכולת למקסם את כמות המידע שניתן להפיק מההדמיה של כל חיית ניסוי תפחית את מספר בעלי החיים הדרושים להסקת מסקנות משמעותיות, ותשפר את יעילות תהליך הניסוי. יישום שיטות אלה על פרוטוקולי RVO ששוכללו לאחרונה מאפשר שכפול גדול יותר ומחקר של תרגום פנוטיפים קליניים למודלים של בעלי חיים. מעבר לחקר מודלים של RVO, לשימוש בשיטות אלה יש יישומים למודלים אחרים של מחלות רשתית המשתמשים בהדמיית FA ו- OCT. דוגמאות למודלים כאלה של עכברים כוללות את אלה עבור בצקת מקולרית הקשורה לגיל (AMD)26, בצקת מקולרית סוכרתית (DME)23, ניאו-וסקולריזציה כורואידלית (CNV)27, אובורטיניטיס אוטואימונית ניסיונית (EAU)28, ורטינופתיה של פגות (ROP)15. ניתן להכליל שיטות אלה גם למחקרים המשתמשים בהדמיית FA ו- OCT בחקר מודלים של מחלות אלה במינים אחרים. הכימות האלה גם רגישים לשינויים עדינים יותר במנגנון המחלה, מה שהופך אותם לשימושיים בהערכת יעילות הטיפול, כמו למשל באיור 3D ובאיור 4C. השירות מתרחב גם לשימוש בהדמיה בבדיקות רעילות במחקרי סבילות של תרכובות סמים. הסטנדרטיזציה והשכפול של פרוטוקולי ניתוח אלה יכולים לשמש לשיפור התוקף התרגומי של מודלים של בעלי חיים ולהרחבת הבנתנו את הפתוגנזה והפתופיזיולוגיה של מחלת הרשתית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית עמיתי המחקר לתארים מתקדמים של הקרן הלאומית למדע (NSF-GRFP) מענק DGE - 1644869(ל- CKCO), מכון העיניים הלאומי (NEI) 5T32EY013933 (ל- AMP), המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ מוחי (RO1 NS081333, R03 NS099920 ל- CMT), ומשרד ההגנה צבא / חיל האוויר (DURIP ל- CMT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AK-Fluor 10% | Akorn | NDC: 17478-253-10 | light-sensitive |
| Carprofen | Rimadyl | NADA #141-199 | keep at 4 °C |
| GenTeal | Alcon | 00658 06401 | |
| Image J | NIH | ||
| InSight 2D | Phoenix Technology Group | OCT analysis software | |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Phenylephrine | Akorn | NDCL174478-201-15 | |
| Phoenix Micron IV | Phoenix Technology Group | Retinal imaging microscope | |
| Phoenix Micron Meridian Module | Phoenix Technology Group | Laser photocoagulator software | |
| Phoenix Micron Optical Coherence Tomography Module | Phoenix Technology Group | OCT imaging software | |
| Phoenix Micron StreamPix Module | Phoenix Technology Group | Fundus imaging and acquisition targeting | |
| Photoshop | Adobe | ||
| Refresh | Allergan | 94170 | |
| Tropicamide | Akorn | NDC: 174478-102-12 | |
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
- Tong, X., et al. The burden of cerebrovascular disease in the united states. Preventing Chronic Disease. 16, 180411 (2019).
- Nakahara, T., Mori, A., Kurauchi, Y., Sakamoto, K., Ishii, K. Neurovascular interactions in the retina: physiological and pathological roles. Journal of Pharmacological Sciences. 123 (2), 79-84 (2013).
- Jaulim, A., Ahmed, B., Khanam, T., Chatziralli, I. Branch retinal vein occlusion: epidemiology, pathogenesis, risk factors, clinical features, diagnosis, and complications. An update of the literature. Retina. 33 (5), 901-910 (2013).
- Ho, M., Liu, D. T. L., Lam, D. S. C., Jonas, J. B. Retinal vein occlusions, from basics to the latest treatment. Retina. 36 (3), 432-448 (2016).
- Zhang, H., et al. Development of a new mouse model of branch retinal vein occlusion and retinal neovascularization. Japanese Journal of Ophthalmology. 51 (4), 251-257 (2007).
- Ebneter, A., Agca, C., Dysli, C., Zinkernagel, M. S. Investigation of retinal morphology alterations using spectral domain optical coherence tomography in a mouse model of retinal branch and central retinal vein occlusion. PLoS One. 10 (3), 0119046 (2015).
- Fuma, S., et al. A pharmacological approach in newly established retinal vein occlusion model. Scientific Reports. 7, 43509 (2017).
- Cavallerano, A.
- Laatikainen, L. The fluorescein angiography revolution: a breakthrough with sustained impact. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 82 (4), 381-392 (2004).
- Huang, D., et al.
- Oberwahrenbrock, T., et al. Reliability of intra-retinal layer thickness estimates. PLoS One. 10 (9), 0137316 (2015).
- Avrutsky, M. I., et al. Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion. Nature Communications. 11 (1), 3173 (2020).
- Colón Ortiz, C., Potenski, A., Lawson, J., Smart, J., Troy, C. Optimization of the retinal vein occlusion mouse model to limit variability. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (174), e62980 (2021).
- Schmidt-Erfurth, U., et al. Guidelines for the management of retinal vein occlusion by the European society of retina specialists (EURETINA). Ophthalmologica. 242 (3), 123-162 (2019).
- Yoshimura, T., et al. Comprehensive analysis of inflammatory immune mediators in vitreoretinal diseases. PLoS One. 4 (12), 8158 (2009).
- Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science. 93 (10), 1268-1279 (2016).
- Hui, F., et al. Quantitative spatial and temporal analysis of fluorescein angiography dynamics in the eye. PLoS One. 9 (11), 111330 (2014).
- Berry, D., Thomas, A. S., Fekrat, S., Grewal, D. S. Association of disorganization of retinal inner layers with ischemic index and visual acuity in central retinal vein occlusion. Ophthalmology. Retina. 2 (11), 1125-1132 (2018).
- Nicholson, L., et al. Diagnostic accuracy of disorganization of the retinal inner layers in detecting macular capillary non-perfusion in diabetic retinopathy. Clinical & Experimental Ophthalmology. 43 (8), 735-741 (2015).
- Obrosova, I., Chung, S., Kador, P. Diabetic cataracts: mechanisms and management. Diabetes/Metabolism Research and Reviews. 26 (3), 172-180 (2010).
- Hegde, K., Henein, M., Varma, S. Establishment of the mouse as a model animal for the study of diabetic cataracts. Ophthalmic Research. 35 (1), 12-18 (2003).
- Takahashi, H., et al. Time course of collateral vessel formation after retinal vein occlusion visualized by OCTA and elucidation of factors in their formation. Heliyon. 7 (1), 05902 (2021).
- Haj Najeeb, B., et al. Fluorescein angiography in diabetic macular edema: A new approach to its etiology. Investigation Ophthalmology & Visual Science. 58 (10), 3986-3990 (2017).
- Alam, M., et al. Quantitative optical coherence tomography angiography features for objective classification and staging of diabetic retinopathy. Retina. 40 (2), 322-332 (2020).
- Uddin, M., Jayagopal, A., McCollum, G., Yang, R., Penn, J. In vivo imaging of retinal hypoxia using HYPOX-4-dependent fluorescence in a mouse model of laser-induced retinal vein occlusion (RVO). Investigation Ophthalmology & Visual Science. 58 (9), 3818-3824 (2017).
- Qiang, W., Wei, R., Chen, Y., Chen, D. Clinical pathological features and current animal models of type 3 macular neovascularization. Frontiers in Neuroscience. 15, 734860 (2021).
- Park, J., et al. Imaging laser-induced choroidal neovascularization in the rodent retina using optical coherence tomography angiography. Investigation Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 331 (2016).
- Chen, J., Qian, H., Horai, R., Chan, C., Caspi, R. Use of optical coherence tomography and electroretinography to evaluate retinal pathology in a mouse model of autoimmune uveitis. PLoS One. 8 (5), 63904 (2013).
