Method Article

Matrizes de hidrogel permitem aumento de rendimento para efeitos de triagem de componentes matriciais e terapêuticos em modelos de tumor 3D

DOI:

10.3791/63791

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June 16th, 2022

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1University of California Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O presente protocolo descreve uma plataforma experimental para avaliar os efeitos de pistas mecânicas e bioquímicas sobre as respostas quimioterápicas de células glioblastoma derivadas pelo paciente em culturas mímicas de matriz 3D usando um dispositivo de iluminação UV feito sob medida facilitando o fotocrosslinking de alto rendimento de hidrogéis com características mecânicas incompáveis.

Abstract

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As interações entre matriz celular mediam processos fisiológicos complexos por meio de pistas bioquímicas, mecânicas e geométricas, influenciando mudanças patológicas e respostas terapêuticas. Espera-se que a contabilização dos efeitos matriciais no início do pipeline de desenvolvimento de medicamentos aumente a probabilidade de sucesso clínico de novas terapêuticas. Estratégias baseadas em biomateriais recapitulando microambientes específicos de tecido na cultura celular 3D existem, mas integrar-os com os métodos de cultura 2D usados principalmente para a triagem de medicamentos tem sido desafiador. Assim, o protocolo aqui apresentado detalha o desenvolvimento de métodos para a cultura 3D dentro de matrizes biomateriais miniaturizadas em um formato de placa multi-poço para facilitar a integração com os pipelines de triagem de medicamentos existentes e ensaios convencionais para viabilidade celular. Uma vez que a matriz apresenta características críticas para a preservação de fenótipos clinicamente relevantes em células cultivadas, espera-se que seja altamente específico para tecidos e doenças, a triagem combinatória dos parâmetros matriciais será necessária para identificar condições adequadas para aplicações específicas. Os métodos descritos aqui utilizam um formato de cultura miniaturizada para avaliar as respostas das células cancerosas à variação ortogonal da mecânica matricial e apresentação de ligantes. Especificamente, este estudo demonstra o uso desta plataforma para investigar os efeitos dos parâmetros matriciais sobre as respostas das células glioblastoma derivadas do paciente (GBM) à quimioterapia.

Introduction

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O custo esperado para o desenvolvimento de uma nova droga aumentou constantemente na última década, com mais de US $ 1 bilhão em estimativas atuais1. Parte dessa despesa é a alta taxa de falha de medicamentos entrando em ensaios clínicos. Aproximadamente 12% dos candidatos a medicamentos finalmente ganham aprovação da Food & Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos (EUA) em 2019. Muitas drogas falham na Fase I devido à toxicidade inesperada2, enquanto outras que passam por testes de segurança podem falhar devido à falta de eficácia3. Este atrito devido à não eficácia pode ser explicado em part....

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Protocol

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As linhas celulares GBM derivadas do paciente (GS122 e GS304) foram fornecidas pelo professor David Nathanson (nosso colaborador), que desenvolveu essas linhas sob um protocolo aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da UCLA (IRB nº 10-000655). As células foram fornecidas desidentidas para que as linhas celulares não pudessem ser ligadas aos pacientes individuais.

1. Preparação da solução de hidrogel

  1. Prepare a solução tamponada hepes dissolvendo o pó HEPES a 20 mM na solução de sal balanceada da Hank (HBSS). Ajuste o pH para 7 após a solvação completa.
  2. Na solução tamponada hepes, dissolva ha (700....

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Results

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As medições da AFM confirmaram o controle preciso da mecânica de hidrogel em função da irradiação UV (mW/cm2) durante o photo-crosslinking usando uma matriz LED personalizada, controlada por Arduino (Figura 2A). A formulação de hidrogel utilizada neste protocolo pode ser encontrada na Tabela 2. O espaçamento dos LEDs no modelo fornecido corresponde ao espaçamento para todos os outros poços de uma placa de 384 poços, permitindo a formação de géis dentro da placa (<.......

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Discussion

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O trabalho atual apresenta métodos para gerar culturas miniaturizadas em 3D dentro da HA, alterando simultaneamente a rigidez matricial e peptídeos disponíveis para engajamento integrin. Essa técnica permite o estudo sistemático de como os parâmetros matriciais afetam fenótipos celulares (por exemplo, a viabilidade das células cancerígenas expostas à quimioterapia) com aumento do rendimento. Abordagens anteriores, incluindo as aqui apresentadas, têm afinado a rigidez do hidrogel variando a porcentagem de polímero total n.......

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Disclosures

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Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

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Os autores gostariam de reconhecer especificamente Carolyn Kim, Amelia Lao, Ryan Stoutamore e Itay Solomon por suas contribuições para iterações anteriores do esquema de fotogelação. As linhas de celular GS122 e GS304 foram generosamente fornecidas por David Nathanson. Todas as figuras foram criadas com BioRender.com. As instalações centrais da UCLA, os Recursos Compartilhados de Triagem Molecular e o Laboratório de Caracterização de Nano e Pico foram fundamentais para o trabalho. Chen Chia-Chun foi apoiado pelo UCLA Eli e Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research Program. Grigor Varuzhanyan foi apoiado por um programa de treinamento de biolo....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Resistores de 1,1 kOhm, 6 WDigikey35601k1ft
Tubo de microcentrífuga de 1,7 mLGenesse Scientific21-108
Tubo cônico de 15 mLFisher Scientific14-959-70C
365 nm LEDDigikeyltpl-c034uvh365
placa de 384 poçosBio Greiner One781090
40 µ filtro de células mMTC bioC4040
4-Armed tiol terminado polietilenoglicol (20 kDa)Laysan Bio4arm-PEG-SH-20K-1g
6 NPN BJTsDigikey2n5550ta
80 Ohm resistores, 0.125 WDigikeyerjj-6enf80r6v
8-Armed norbornene terminado polietilenoglicol (20 kDa)Jenkem TechnologyA7025-1
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104500  dissociação celular  o AFM do reagente
sondasNovascan0,01 N/m constante nominal da mola, 2,5 µ m SiO2 partícula
Arduino IDEArduino1.8.19
Arduino NanoMakerfireMini Nano V3.0 ATmega328P Placa
bFGFPeprotech100-18B20 ng/mL
CCK8Abcamab228554
CentrífugaThermoscientificsorvall legend xtr
CP100STGilsonF148415Ponteiras de pipeta para deslocamento positivo Cubis
Semi-Micro BalanceSartoriusMSA225S100DI
DMEM - F12 (50-50)Life Technologies113300571x
DMSOFisher ScientificBP231-100
DPBS Ca (-) Mg (-)Genesse Scientific25-508
EGFPeprotechAF100-1550 ng/mL
Etanol, AnidroFisher ScientificA405PAdicione água DI para diluir a 70%
Frascos roscados de vidro âmbar classe B da Fisherbrand FisherScientific03-339-23C
Papel de pesagem FisherbrandScientific09-898-12B
Suplemento G21Gemini Bio400-16050x
Solução salina balanceada HanksThermo Fisher Scientific14175095
HCl, ACS, 12MSigma AldrichS25838AAdicione água DI para diluir a 1 M
Sal de sódio de heparina da mucosa intestinal suínaSigma AldrichH3149-100Ku25 µ g/mL
HEPESSigma AldrichH7006-100G
Pistola de ar quenteWagnerHT1000
Peptídeo de sialoproteína de ligação à integrina (IBSP)GenscriptOrdem personalizadaGCGYGGGGNGEPRGDTYRAY
Lítio fenil-2,4,6 trimetilbenzoilfosfinato (LAP), >95%Sigma Aldrich900889-1G
Placa de agitação magnéticaThermo MicrocentrífugaCientífica SP194715
Thermo ScientificSorvall legend micro 21R
Microman E pipetador de canal únicoGilsonFD10004Pipeta de deslocamento positivo
Pontas deVários fabricantesVários tamanhos
Micropipeta mLineSartorious
N-acetilcisteínaSigma AldrichA7250-10G
Nanowizard 4Bruker
AFMda adição à água do DI de 1 M
NormoicinInvivogenant-nr-1500x
Osteopontin PeptideGenscriptOrdem feita sob encomendaGCGYGTVDVPDGRGDSLAYG
Pipet AidDrummond4000102
Lâminas de Microscópio SimplesGlobe Scientific1301
Press-To-Seal isolador de silicone, 12-4.5mm de diâmetro x 2mm de profundidadeGrace Bio Labs664201-ACorte para que 8 moldes individuais sejam feitos de uma única folha
ProcessamentoProcessamento3.5.4
Repetidor M4Eppendorf4982000322
Repetidor Pontasde PipetaSartorious30089430tamanhos de 1 mL
RGD PeptídeoGenscriptGCGYGRGDSPG
Fita Scoth Pipetas
SorológicasGenesse Scientific12-102,12-104Pipetas de 5,10 mL
Pasta de SoldaDigikey315-NC191LT15T5-ND
Fio
Reto pinça de dissecaçãoVWR Scientific82027-408
Synergy H1 Plate ReaderFrasco tratado com
T-75Genesee Scientific25-209
TemozolomidaSigma AldrichT2577Normalmente usado de 10 µ M a 100 µ M
Tenascin-C PeptideGenscriptGCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR
GV
Ácido Hialurônico Tiolado (700 kDa), 6-8% modificadoLifecore BiomedicalHA700K5
VWR Spinbar, Flea MicroVWR58948-375
Microcontroladora micropipeta Microscópio NaOH Fisher Scientific, ss255-1, 1 de de Solda cultura de células Biotek

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (3), 191-200 (2012).
  2. Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug....

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Hydrogel Arrays3D Tumor ModelsMatrix ComponentsDrug ScreeningCell Matrix InteractionsGlioblastoma CellsMiniaturized 3D CultureMatrix MechanicsCell Viability AssayPhoto Cross Linking

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