Artigo de método

Matrizes de hidrogel permitem aumento de rendimento para efeitos de triagem de componentes matriciais e terapêuticos em modelos de tumor 3D

DOI:

10.3791/63791

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16 de junho de 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University of California Los Angeles

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O presente protocolo descreve uma plataforma experimental para avaliar os efeitos de pistas mecânicas e bioquímicas sobre as respostas quimioterápicas de células glioblastoma derivadas pelo paciente em culturas mímicas de matriz 3D usando um dispositivo de iluminação UV feito sob medida facilitando o fotocrosslinking de alto rendimento de hidrogéis com características mecânicas incompáveis.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As interações entre matriz celular mediam processos fisiológicos complexos por meio de pistas bioquímicas, mecânicas e geométricas, influenciando mudanças patológicas e respostas terapêuticas. Espera-se que a contabilização dos efeitos matriciais no início do pipeline de desenvolvimento de medicamentos aumente a probabilidade de sucesso clínico de novas terapêuticas. Estratégias baseadas em biomateriais recapitulando microambientes específicos de tecido na cultura celular 3D existem, mas integrar-os com os métodos de cultura 2D usados principalmente para a triagem de medicamentos tem sido desafiador. Assim, o protocolo aqui apresentado detalha o desenvolvimento de métodos para a cultura 3D dentro de matrizes biomateriais miniaturizadas em um formato de placa multi-poço para facilitar a integração com os pipelines de triagem de medicamentos existentes e ensaios convencionais para viabilidade celular. Uma vez que a matriz apresenta características críticas para a preservação de fenótipos clinicamente relevantes em células cultivadas, espera-se que seja altamente específico para tecidos e doenças, a triagem combinatória dos parâmetros matriciais será necessária para identificar condições adequadas para aplicações específicas. Os métodos descritos aqui utilizam um formato de cultura miniaturizada para avaliar as respostas das células cancerosas à variação ortogonal da mecânica matricial e apresentação de ligantes. Especificamente, este estudo demonstra o uso desta plataforma para investigar os efeitos dos parâmetros matriciais sobre as respostas das células glioblastoma derivadas do paciente (GBM) à quimioterapia.

Introdução

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O custo esperado para o desenvolvimento de uma nova droga aumentou constantemente na última década, com mais de US $ 1 bilhão em estimativas atuais1. Parte dessa despesa é a alta taxa de falha de medicamentos entrando em ensaios clínicos. Aproximadamente 12% dos candidatos a medicamentos finalmente ganham aprovação da Food & Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos (EUA) em 2019. Muitas drogas falham na Fase I devido à toxicidade inesperada2, enquanto outras que passam por testes de segurança podem falhar devido à falta de eficácia3. Este atrito devido à não eficácia pode ser explicado em parte pelo fato de que os modelos de câncer usados durante o desenvolvimento de medicamentos são notoriamente não preditivos da eficácia clínica4.

Disparidades funcionais entre modelos in vitro e in vivo podem ser atribuídas à remoção de células cancerígenas de seu microambiente nativo, incluindo células não tumorais e o ECM 5,6 físico. Comumente, grupos de pesquisa usam matrizes culturais disponíveis comercialmente, como Matrigel (uma matriz de membrana de porão protéciosa derivada de sarcomas de camundongos) para fornecer células tumorais cultivadas com um microambiente de matriz 3D. Em comparação com a cultura 2D, a cultura 3D na matriz de membrana melhorou a relevância clínica dos resultados in vitro 7,8. No entanto, os biomaterias de cultura de tecidos descelularizados, incluindo a matriz de membrana, normalmente exibem variabilidade em lote que pode comprometer a reprodutibilidade9. Além disso, matrizes derivadas de tumores com diferentes origens teciduais dos estudados podem não fornecer as pistas fisiológicas apropriadas10. Finalmente, os cânceres com altos graus de heterogeneidade intratumoral têm características microambientais que variam em uma escala de tamanho de submicron e que a matriz de membrana não pode ser ajustada para recapitular11.

Glioblastoma (GBM), um tumor cerebral uniformemente letal com um tempo médio de sobrevida de aproximadamente 15 meses, é um câncer para o qual o desenvolvimento do tratamento tem sido particularmente difícil12,13. O padrão atual de cuidado para GBM consiste em ressecção do tumor primário, seguido de radioterapia e quimioterapia usando temozolomide (TMZ)14. No entanto, mais da metade dos tumores clínicos de GBM apresentam resistência ao tratamento através de vários mecanismos 15,16,17. Prever a eficácia de um regime de tratamento para um paciente individual é extremamente difícil. Modelos pré-clínicos padrão usados para prever desfechos individuais consistem em células tumorais derivadas do paciente xenoenxericamente em camundongos imunocomprometidos. Embora os xenoenxertos derivados do paciente possam recapitular muitos aspectos dos tumores clínicos de GBM e são valiosos para modelos pré-clínicos18, eles são inerentemente caros, de baixa produtividade, demorados e envolvem preocupações éticas19. Culturas de células derivadas do paciente, em superfícies plásticas 2D ou como esferoides, evitam principalmente esses problemas. Embora as células derivadas do paciente preservem aberrações genéticas, suas culturas em 2D ou como esferoides suspensos têm sido em grande parte representações ruins de xenoenxertos derivados do paciente em roedores e tumores originaisdo paciente 20. Anteriormente, nós, e outros, mostramos que as células GBM cultivadas em um ECM 3D que imita as propriedades mecânicas e bioquímicas do tecido cerebral podem preservar fenótipos de resistência a drogas 10,21,22,23.

Interações entre o ácido hialurônico (HA), um polissacarídeo abundante no cérebro ECM e superexpresso em tumores GBM, e seu receptor CD44 modulam a aquisição da resistência medicamentosa in vitro 21,24,25,26,27. Por exemplo, a inclusão de HA dentro de culturas 3D suaves aumentou a capacidade das células GBM derivadas do paciente de adquirir resistência terapêutica. Essa mecano-responsividade dependia da vinculação ha aos receptores CD44 em células GBM21. Além disso, a ligação integrin aos peptídeos portadores de RGD, incorporadas em matrizes de cultura 3D, amplificou a chemoresistance mediada pelo CD44 de forma dependente da rigidez21. Além do HA, a expressão de várias proteínas ECM, muitas contendo regiões de RGD, variam entre tumores cerebrais normais e GBM28. Por exemplo, um estudo relatou que 28 proteínas ECM distintas foram regulamentadas em tumores GBM29. Dentro deste complexo microambiente da matriz tumoral, as células cancerígenas integram sinais mecânicos e bioquímicos para produzir um fenótipo de resistência particular, que depende de diferenças relativamente pequenas (por exemplo, menos de uma ordem de magnitude) no modulo de Young ou densidade de peptídeos integrin-binding 28,29,30.

O presente protocolo caracteriza como as células tumorais interpretam combinações únicas de sinais matriciais e identificam microambientes matriciais complexos e específicos do paciente que promovem a resistência ao tratamento (Figura 1A). Um método fotoquímico para gerar matrizes miniaturizadas e precisamente sintonizadas para a cultura 3D proporciona um espaço variável grande e ortogonal. Uma matriz personalizada de LEDs, executado por um microcontrolador, foi incorporada a hidrogéis fotocrosslink dentro de um formato de placa de 384 poços para aumentar a automação e a reprodutibilidade. A intensidade de exposição foi variada em todo o bem para alterar as propriedades micromecânicas dos hidrogéis resultantes, conforme avaliado por meio de microscopia de força atômica (AFM). Embora este manuscrito não se concentre na construção da matriz de iluminação em si, um diagrama de circuito (Figura 1B) e lista de peças (Tabela de Materiais) são fornecidos como auxílios para a reprodução do dispositivo.

Este relatório demonstra a rápida geração de uma matriz de células GBM cultivadas em microambientes 3D únicos nos quais o módulo de Young (quatro níveis em uma única ordem de magnitude) e o teor de peptídeos integrin (derivados de quatro proteínas ECM diferentes) foram variados ortogonicamente. A abordagem foi então utilizada para investigar as contribuições relativas da mecânica hidrogel e do engajamento integrin específico do ECM na viabilidade e proliferação de células GBM derivadas do paciente à medida que adquirem resistência à quimioterapia temozolomide (TMZ).

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Protocolo

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As linhas celulares GBM derivadas do paciente (GS122 e GS304) foram fornecidas pelo professor David Nathanson (nosso colaborador), que desenvolveu essas linhas sob um protocolo aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da UCLA (IRB nº 10-000655). As células foram fornecidas desidentidas para que as linhas celulares não pudessem ser ligadas aos pacientes individuais.

1. Preparação da solução de hidrogel

  1. Prepare a solução tamponada hepes dissolvendo o pó HEPES a 20 mM na solução de sal balanceada da Hank (HBSS). Ajuste o pH para 7 após a solvação completa.
  2. Na solução tamponada hepes, dissolva ha (700 kDa peso molecular nominal, ver Tabela de Materiais), preparado após o relatório anterior31, de modo que 6%-8% dos resíduos de ácido carboxílico em cada ácido glucurônico sejam modificados com um tiol, a uma concentração de 10 mg/mL em solução tampão.
    NOTA: Recomenda-se um frasco âmbar para evitar a oxidação de tiol por luz ambiente.
    1. Mexa usando uma placa de agitação magnética (<1.000 rpm) à temperatura ambiente até dissolver totalmente, normalmente em torno de 45 min.
  3. Enquanto a HA estiver dissolvendo, prepare soluções separadas de (1) 100 mg/mL de 8 braço-PEG-Norbornene (20 kDa), (2) 100 mg/mL de 4 braço-PEG-Thiol (20 kDa), (3) 4 mM de peptídeo contendo cisteína ou cisteína (por exemplo, GCGYGRGDSPG) e (4) 4 mg/mL de LAP em tubos de microcentrifuus (ver Tabela de Materiais).
    1. Prepare cada uma dessas quatro soluções na solução tamponada hepes preparada na etapa 1.1. Vórtice as soluções para garantir a dissolução total de cada reagente antes de realizar a etapa 4.
      NOTA: Se testar vários peptídeos diferentes, cada um deve conter uma cisteína ou outra fonte de moiety thiol para esta química de conjugação.
    2. Prepare soluções (thiol disponível de 4 mM) de todos os peptídeos a serem amarrados dentro de um único hidrogel neste momento.
      NOTA: As sequências de peptídeos e as proteínas ECM das quais foram derivadas e utilizadas neste estudo estão listadas na Tabela 1. A cisteína-de-n-acetil (ver Tabela de Materiais), à qual as células não se ligam, pode ser substituída por um peptídeo bioativo, contendo tiol, para titular a concentração de um peptídeo adesivo ou agir como um controle negativo31.
  4. Misture as soluções individuais de HA, PEG-Norbornene, PEG-thiol e peptídeos contendo cisteína/thiol (ver Tabela de Materiais) para alcançar as concentrações finais para as matrizes de hidrogel finais listadas na Tabela 2. Mexa (<1.000 rpm) em uma placa de agitação magnética por pelo menos 30 minutos para misturar totalmente.
    NOTA: As soluções HA são altamente viscosas e melhor manuseadas usando uma pipeta de deslocamento positiva (ver Tabela de Materiais). Se uma pipeta de deslocamento positivo não estiver disponível, as soluções viscosas também podem ser dispensadas com uma micropipette padrão, tubos lentos usando pontas de orifícios largos.

2. Iluminação e fotocrosslinking de hidrogéis através de uma matriz LED

ATENÇÃO: Use óculos de proteção UV e cubra o campo de iluminação com material absorvente de UV.

NOTA: O conjunto led descrito neste protocolo consiste em seis conjuntos de oito LEDs colocados em série, conforme ilustrado pelo diagrama do circuito fornecido (Figura 1A). Cada conjunto de LEDs pode ser alimentado independentemente, o que permite até seis irradiações diferentes por execução. O Arquivo Suplementar 1 contém capturas de tela correspondentes às seguintes instruções para orientação posterior.

  1. Baixe o arquivo Illumination.zip do Dispositivo de Codificação Suplementar. Este diretório contém os seguintes arquivos: Arduino.zip (Arquivo de Codificação Suplementar 1), Drivers.zip (Arquivo de Codificação Suplementar 2), GUI.zip (Arquivo de Codificação Suplementar 3) e Holder.zip (Arquivo de Codificação Suplementar 4).
    NOTA: Imprima em 3D as porções superior e inferior para manter a placa de circuito no lugar (consulte Arquivos de Codificação Suplementar para obter detalhes).
  2. Baixe e instale o software de microcontrolador (ver Tabela de Materiais).
  3. Baixe e instale o software GUI (ver Tabela de Materiais). Consulte o Arquivo Suplementar 1 para obter instruções de operação de software.
  4. Abra o processamento e instale a biblioteca controlIP5 clicando em Sketch > Import Library > Add Library. Em seguida, procure o controleIP5 em bibliotecas e clique em Instalar. Faça isso pela primeira vez.
  5. Ligue o dispositivo de iluminação (ver Tabela de Materiais) usando a fonte de alimentação de 36 Volts e conecte-o a um PC usando um cabo micro-USB.
    NOTA: Alguns dispositivos não instalarão drivers automaticamente para várias placas nano Arduino. Um conjunto de drivers é fornecido no arquivo zip do dispositivo.
  6. Abra o arquivo Arduino.ino, localizado na pasta Adruino.zip, usando o IDE Arduino.
  7. Compile o arquivo Arduino.ino clicando no botão Marcar verificação . Carregue o código compilado clicando no botão Seta .
  8. Abra o arquivo GUI.pde, localizado na pasta gui.zip, utilizando Processamento.
  9. Clique em Executar no programa de processamento para iniciar a interface gráfica do usuário para controlar o dispositivo de iluminação.
  10. Na janela gráfica da interface do usuário, clique em Intensidade para que a coluna contendo solução precursora de hidrogel seja interligada e insira a intensidade desejada. Clique na caixa Hora e na hora desejada. Para a solução fornecida na Tabela 2, este será de 15 s.
    NOTA: Os usuários finais precisam calibrar os valores de intensidade digital à irradiação usando um radiômetro. Exemplos de intensidades típicas são fornecidos na Figura 2A.
  11. Alinhe as amostras com o dispositivo de iluminação (Figura 2B) com todos os outros LED em uma única coluna dos moldes de silicone (ver Tabela de Materiais) ou placa de 384 poços. Clique em Terminar para iniciar a iluminação. Repita este processo conforme necessário para a iluminação de vários slides ou outros poços de uma placa de 384 poços.
    NOTA: O suporte foi projetado de tal forma que a placa de 384 poços fique alinhada com um canto da câmara interna durante a iluminação.
    1. Seguindo a iluminação, quando colocado em um canto, mova a placa do poço para a próxima curva e repita. Para iluminar os poços na outra metade da placa, levante a placa para fora do suporte e gire 180°.
  12. Gerar hidrogéis com mecânicas variadas para caracterização mecânica seguindo as etapas abaixo.
    1. Limpe as lâminas de vidro e os moldes de silicone usando fita adesiva para remover detritos. Adere aos moldes de silicone ao deslizamento de vidro, pressione para baixo para garantir uma boa vedação e desloque quaisquer bolhas de ar.
    2. Pipeta 80 μL de solução precursora de hidrogel, preparada na etapa 1.4, em cada molde de silicone na lâmina de vidro.
    3. Coloque o deslizamento de vidro sobre o dispositivo de iluminação alinhado com todos os outros LED em uma única coluna. Exponha os precursores do hidrogel à luz UV por 15 s, conforme descrito na etapa 2, ao fotocrosslink.
    4. Uma vez que a iluminação tenha parado, recupere os slides e solte os géis dos moldes traçando a circunferência interna do molde com uma ponta fina (ponta de pipeta de 10 μL, agulha de 30 G, etc.). Remova os moldes de silicone com pinças/fórceps.
    5. Mova hidrogéis cruzados em poços individuais de uma placa de 12 poços, molhando uma espátula e empurrando-os suavemente para fora do escorregador de vidro. Encha cada poço com 2 mL de DPBS (ver Tabela de Materiais) antes de adicionar o hidrogel. Inchar os géis na solução DPBS por pelo menos 12 h (normalmente durante a noite) à temperatura ambiente (para a caracterização mecânica do dia seguinte).

3. Medições de Microscopia da Força Atômica (AFM)

  1. Ligue o microscópio de força atômica (AFM) de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais). Este protocolo fornece instruções breves para o uso do instrumento e do software relacionado.
  2. Instale a sonda AFM (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: Para o presente estudo, um nitreto triangular de silício cantilever com uma constante nominal de mola de 0,01 N/m foi modificado com uma partícula de dióxido de silício esférico de 2,5 μm.
  3. Após a instalação, alinhe o laser ao ápice da sonda triangular e, em seguida, ajuste a deflexão do espelho e do laser para maximizar a soma do sinal (tipicamente entre 1,5-2,2 Volts).
  4. Mergulhe a sonda em DPBS e aguarde até 15 minutos para obter o equilíbrio térmico. Clique no botão Calibração e selecione Calibração dependente de contato . Clique no botão Coletar ajuste térmico e, após a coleta de dados, selecione o pico em torno de 3 kHz para calibração.
    NOTA: Um pequeno ajuste do espelho e dos defletores a laser pode ser necessário após a imersão em um líquido devido a alterações de índice refrativo.
  5. Aproxime-se da superfície de uma placa de Petri (plástico) definindo os Parâmetros de Aproximação para Velocidade Constante, uma altura alvo de 7,5 μm e uma velocidade de aproximação de 15 μm/s. Habilite a medição da linha de base por execução para abordagem para que a abordagem seja executada continuamente e não pare cedo devido à deriva no defletor.
  6. Após a aproximação, defina parâmetros de aquisição para mapeamento de força para turnarounds de 4 nN, 2 μm de distância de recuo, velocidade de 1 μm/s e tempo de contato de 0 s. Pressione o botão Iniciar para começar a coletar uma curva de força na superfície de plástico (por exemplo, uma placa de poço).
  7. Volte para a janela de calibração e selecione a porção da curva de força correspondente ao contato e recuo do plástico. Aceite os valores calculados de sensibilidade e rigidez para que a sonda complete a calibração.
  8. Após a calibração, levante a sonda AFM e coloque a amostra de hidrogel para interrogatório. Aproxime-se do hidrogel seguindo as configurações fornecidas na etapa 5.
    NOTA: Durante o procedimento de aproximação em direção à superfície do hidrogel, a unidade pode acionar erroneamente o estado abordado. Para verificar a abordagem real, obtenha uma curva de força como na etapa 4.6. Repita o procedimento de aproximação se a curva resultante não mostrar contato e resultar em recuo.
  9. Quando a abordagem da superfície for bem sucedida, mude para o modo de mapeamento da força e defina parâmetros de aquisição para um mapa de tamanho 8 x 8 com 40 μm de comprimento por eixo. Obter mapas de força em várias regiões para avaliar a uniformidade das medidas de rigidez.
    1. Interprete as curvas de força usando o programa de software JPK SPM Data Processing através de um ajuste de modelo Hertz/Sneddon (Equações 1 e 2, ver Tabela 3 para a definição de todas as variáveis) com a geometria esférica selecionada 32,33,3 4.
      figure-protocol-1Equação132
      figure-protocol-2Equação 232

4. Configuração e tratamento medicamentoso de culturas 3D, embutidas em matriz

  1. Prepare células desejadas como uma única solução celular.
    NOTA: Diferentes tipos de células podem exigir diferentes métodos de passagem. Um protocolo típico para a passagem de uma cultura de suspensão de spheróides GBM a partir de um frasco T-75 é relatado na referência31.
  2. Colete esferoides GBM (aproximadamente 150 μm de diâmetro) de uma cultura de suspensão de frascos T-75 em um tubo cônico de 15 mL. Enxágüe o frasco de cultura com 5 mL de DPBS para remover quaisquer células residuais e mídia e adicionar este volume ao tubo cônico.
  3. Centrifugar o tubo cônico contendo células a 200 x g por 5 min a temperatura ambiente. Após a centrifugação, remova o supernasce com uma pipeta serológica de 5 mL, tomando cuidado para não perturbar a pelota celular, e resuspend em 5 mL de DPBS.
  4. Centrifugar a 200 x g por 5 min a temperatura ambiente para lavar células. Aspire o supernasciente com uma pipeta sorológica de 5 mL, tomando cuidado para não perturbar a pelota celular, e depois resuspend células em 2 mL de reagente de dissociação celular (ver Tabela de Materiais).
  5. Incubar em temperatura ambiente por 10-15 min. Adicione 3 mL de meio completo (ver Tabela de Materiais) e pipeta suavemente 3-5 vezes para quebrar os esferoides a uma única suspensãocelular 31.
  6. Centrifugar a suspensão unicelular a 400 x g (suspensões unicelulares podem ser giradas mais rapidamente para formação de pelotas) por 5 minutos a células de pelotas à temperatura ambiente. Aspire o supernatante com uma pipeta sorológica de 5 mL, tomando cuidado para não perturbar a pelota celular. Células resuspendas em 1 mL de meio completo.
    NOTA: Se as células permanecerem em aglomerados, em vez de como células únicas em suspensão, após a passagem, as células podem ser passadas através de um coador de células de 40 μm para obter uma única suspensão celular.
  7. Remova uma parte das células para contar usando um hemótmetro. Diluir esta porção duas vezes com o azul trypan, que permeia as células com viabilidade comprometida. Conte apenas as células vivas e incolores. Normalmente, um T-75 semeado a 800.000 células por frasco produz 2-3 milhões de células após uma semana na cultura.
  8. Determine o número de células necessárias para encapsulamento. Transfira um volume de mídia contendo o número total de células necessárias para um tubo de microcentrifus de 1,7 mL estéril. Gire a 400 x g por 5 min a temperatura ambiente.
    NOTA: Por exemplo, um mínimo de 2,5 milhões de células resuspentecidas em 1 mL de volume de gel é necessário para encapsular células a 2,5 milhões de células/mL. Um volume de gel de 1 mL permite que os usuários dispensem 100 gotas de gel, onde cada gota de gel é de 10 μL de volume. A preparação de um volume extra de ~20% de células suspensas na solução de hidrogel é recomendada para contabilizar a perda durante a transferência de pipeta. Assim, prepararia-se 3 milhões de células e 1,2 mL de solução precursora de hidrogel neste exemplo. Recomenda-se uma densidade mínima de 500 mil células/mL.
  9. Aspire o supernatante com uma micropipette, tomando cuidado para não perturbar a pelota celular. Resuspenque a pelota celular na solução precursora do hidrogel, conforme preparado na etapa 1.4, misturando-se bem por pipetar para cima e para baixo com uma micropipette de 1.000 μL 4-5 vezes.
  10. Carregue as células em um pipettor repetido (ver Tabela de Materiais) definido para dispensar 10 μL. Para evitar bolhas e dispensação irregular, prime o pipettor repetitivo, distribuindo um adicional de 1-2 vezes em um recipiente de resíduos.
  11. Em cada poço de uma placa de 384 poços, dispense 10 μL de células suspensas em solução de hidrogel do pipettor repetitivo. Utilizando a matriz LED, ilumine cada poço contendo células (passo 2) para 15 s com intensidades (exemplo resulta na Figura 2A utilizando intensidades de 1,14, 1,55, 2,15, 2,74 mW/cm2) para alcançar as propriedades mecânicas desejadas.
    NOTA: Sugere-se começar com cinco réplicas por condição experimental e escalar para cima ou para baixo, dependendo do rendimento e variância desejados do ensaio de ponto final.
  12. Adicione 40 μL de mídia completa a cada poço contendo as células. Adicione 50 μL de DPBS a poços secos não experimentais ao redor dos géis para minimizar as perdas devido à evaporação.
  13. Para células GBM, adicione 40 μL da droga contendo mídia (por exemplo, TMZ, consulte Tabela de Materiais) para alcançar a concentração final desejada (10 μM-100 μM em dimetilsulfoxida (DMSO) ou veículo (DMSO), consequentemente, a partir de 3 dias após o encapsulamento.

5. Ensaio de proliferação CCK8

  1. Adicione 10 μL de reagente CCK8 (ver Tabela de Materiais) a cada poço contendo as células.
    NOTA: Se realizar este ensaio pela primeira vez, inclua poços de controle negativos, como apenas mídia ou hidrogel sem células na mídia.
  2. Incubar por 1-4 h de acordo com as instruções do fabricante.
    NOTA: Este tempo pode variar em função do tipo e densidade celular e, portanto, os tempos de incubação precisam ser testados para cada aplicação para que os valores de absorção se recaem dentro de uma faixa linear, um requisito para a aplicação da Lei35 da Cerveja.
  3. Leia absorventes a 450 nm para todos os poços após a incubação.
  4. Calcule a absorvância média em 450 nm obtida na etapa 3 para a condição do veículo para cada grupo. Divida cada droga tratada bem pela média do controle do veículo por grupo.
  5. Calcule os intervalos de confiança gerando distribuições de botas (N = 10.000) através do método percentil36.
    NOTA: Geralmente, pode-se utilizar intervalos de confiança de 95% e interpretar condições cujos intervalos de confiança não ultrapassam 1 para serem significativos e justificar uma investigação mais aprofundada. Definir intervalos de confiança para 95% é congruente com a definição de um corte de significância de p = 0,05. Para os dados mostrados nos resultados, há utilidade na distinção de condições que promovem ou inibem a resistência a medicamentos mediados por matrizes, exigindo uma análise de dois lados.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As medições da AFM confirmaram o controle preciso da mecânica de hidrogel em função da irradiação UV (mW/cm2) durante o photo-crosslinking usando uma matriz LED personalizada, controlada por Arduino (Figura 2A). A formulação de hidrogel utilizada neste protocolo pode ser encontrada na Tabela 2. O espaçamento dos LEDs no modelo fornecido corresponde ao espaçamento para todos os outros poços de uma placa de 384 poços, permitindo a formação de géis dentro da placa (<...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O trabalho atual apresenta métodos para gerar culturas miniaturizadas em 3D dentro da HA, alterando simultaneamente a rigidez matricial e peptídeos disponíveis para engajamento integrin. Essa técnica permite o estudo sistemático de como os parâmetros matriciais afetam fenótipos celulares (por exemplo, a viabilidade das células cancerígenas expostas à quimioterapia) com aumento do rendimento. Abordagens anteriores, incluindo as aqui apresentadas, têm afinado a rigidez do hidrogel variando a porcentagem de polímero total n...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores gostariam de reconhecer especificamente Carolyn Kim, Amelia Lao, Ryan Stoutamore e Itay Solomon por suas contribuições para iterações anteriores do esquema de fotogelação. As linhas de celular GS122 e GS304 foram generosamente fornecidas por David Nathanson. Todas as figuras foram criadas com BioRender.com. As instalações centrais da UCLA, os Recursos Compartilhados de Triagem Molecular e o Laboratório de Caracterização de Nano e Pico foram fundamentais para o trabalho. Chen Chia-Chun foi apoiado pelo UCLA Eli e Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research Program. Grigor Varuzhanyan foi apoiado por um programa de treinamento de biologia celular tumoral NIH Grant (T32 CA 009056).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Resistores de 1,1 kOhm, 6 WDigikey35601k1ft
Tubo de microcentrífuga de 1,7 mLGenesse Scientific21-108
Tubo cônico de 15 mLFisher Scientific14-959-70C
365 nm LEDDigikeyltpl-c034uvh365
placa de 384 poçosBio Greiner One781090
40 µ filtro de células mMTC bioC4040
4-Armed tiol terminado polietilenoglicol (20 kDa)Laysan Bio4arm-PEG-SH-20K-1g
6 NPN BJTsDigikey2n5550ta
80 Ohm resistores, 0.125 WDigikeyerjj-6enf80r6v
8-Armed norbornene terminado polietilenoglicol (20 kDa)Jenkem TechnologyA7025-1
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104500  dissociação celular  o AFM do reagente
sondasNovascan0,01 N/m constante nominal da mola, 2,5 µ m SiO2 partícula
Arduino IDEArduino1.8.19
Arduino NanoMakerfireMini Nano V3.0 ATmega328P Placa
bFGFPeprotech100-18B20 ng/mL
CCK8Abcamab228554
CentrífugaThermoscientificsorvall legend xtr
CP100STGilsonF148415Ponteiras de pipeta para deslocamento positivo Cubis
Semi-Micro BalanceSartoriusMSA225S100DI
DMEM - F12 (50-50)Life Technologies113300571x
DMSOFisher ScientificBP231-100
DPBS Ca (-) Mg (-)Genesse Scientific25-508
EGFPeprotechAF100-1550 ng/mL
Etanol, AnidroFisher ScientificA405PAdicione água DI para diluir a 70%
Frascos roscados de vidro âmbar classe B da Fisherbrand FisherScientific03-339-23C
Papel de pesagem FisherbrandScientific09-898-12B
Suplemento G21Gemini Bio400-16050x
Solução salina balanceada HanksThermo Fisher Scientific14175095
HCl, ACS, 12MSigma AldrichS25838AAdicione água DI para diluir a 1 M
Sal de sódio de heparina da mucosa intestinal suínaSigma AldrichH3149-100Ku25 µ g/mL
HEPESSigma AldrichH7006-100G
Pistola de ar quenteWagnerHT1000
Peptídeo de sialoproteína de ligação à integrina (IBSP)GenscriptOrdem personalizadaGCGYGGGGNGEPRGDTYRAY
Lítio fenil-2,4,6 trimetilbenzoilfosfinato (LAP), >95%Sigma Aldrich900889-1G
Placa de agitação magnéticaThermo MicrocentrífugaCientífica SP194715
Thermo ScientificSorvall legend micro 21R
Microman E pipetador de canal únicoGilsonFD10004Pipeta de deslocamento positivo
Pontas deVários fabricantesVários tamanhos
Micropipeta mLineSartorious
N-acetilcisteínaSigma AldrichA7250-10G
Nanowizard 4Bruker
AFMda adição à água do DI de 1 M
NormoicinInvivogenant-nr-1500x
Osteopontin PeptideGenscriptOrdem feita sob encomendaGCGYGTVDVPDGRGDSLAYG
Pipet AidDrummond4000102
Lâminas de Microscópio SimplesGlobe Scientific1301
Press-To-Seal isolador de silicone, 12-4.5mm de diâmetro x 2mm de profundidadeGrace Bio Labs664201-ACorte para que 8 moldes individuais sejam feitos de uma única folha
ProcessamentoProcessamento3.5.4
Repetidor M4Eppendorf4982000322
Repetidor Pontasde PipetaSartorious30089430tamanhos de 1 mL
RGD PeptídeoGenscriptGCGYGRGDSPG
Fita Scoth Pipetas
SorológicasGenesse Scientific12-102,12-104Pipetas de 5,10 mL
Pasta de SoldaDigikey315-NC191LT15T5-ND
Fio
Reto pinça de dissecaçãoVWR Scientific82027-408
Synergy H1 Plate ReaderFrasco tratado com
T-75Genesee Scientific25-209
TemozolomidaSigma AldrichT2577Normalmente usado de 10 µ M a 100 µ M
Tenascin-C PeptideGenscriptGCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR
GV
Ácido Hialurônico Tiolado (700 kDa), 6-8% modificadoLifecore BiomedicalHA700K5
VWR Spinbar, Flea MicroVWR58948-375
Microcontroladora micropipeta Microscópio NaOH Fisher Scientific, ss255-1, 1 de de Solda cultura de células Biotek

Referências

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