Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Forberedelse og morfologisk analyse af chick kraniale neurale crestcellekulturer

Published: June 27, 2022 doi: 10.3791/63799
Automatic Translation
1, 2,3, 2,3, 2,3
1Department of Biology and Neuroscience Program, Hamline University, 2Department of Genetics, Cell Biology and Development, University of Minnesota, 3Developmental Biology Center, University of Minnesota

Summary

Denne alsidige protokol beskriver isoleringen af præmigratoriske neurale kamceller (NCC'er) gennem udskæring af kraniale neurale folder fra kyllingembryoner. Ved plettering og inkubation kommer migrerende NCC'er ud af neurale foldeksplanter, hvilket giver mulighed for vurdering af cellemorfologi og migration i et forenklet 2D-miljø.

Abstract

Under hvirveldyrudvikling migrerer neurale kamceller (NCC'er) i vid udstrækning og differentierer sig til forskellige celletyper, der bidrager til strukturer som det kraniofaciale skelet og det perifere nervesystem. Selvom det er afgørende at forstå NCC-migration i forbindelse med et 3D-embryo, letter isolering af migrerende celler i 2D-kultur visualisering og funktionel karakterisering, der supplerer embryonale undersøgelser. Den nuværende protokol demonstrerer en metode til isolering af chick kraniale neurale folder for at generere primære NCC-kulturer. Migrerende NCC'er kommer ud af neurale fold explants belagt på et fibronectinbelagt substrat. Dette resulterer i spredte, vedhængende NCC-populationer, der kan vurderes ved farvning og kvantitative morfologiske analyser. Denne forenklede kulturtilgang er meget tilpasningsdygtig og kan kombineres med andre teknikker. For eksempel kan NCC-emigration og migrerende adfærd evalueres ved time-lapse-billeddannelse eller funktionelt forespørges ved at inkludere hæmmere eller eksperimentelle manipulationer af genekspression (f.eks. DNA, morpholino eller CRISPR-elektroporation). På grund af sin alsidighed giver denne metode et kraftfuldt system til undersøgelse af kranial NCC-udvikling.

Introduction

Neurale kamceller (NCC'er) er en forbigående cellepopulation i hvirveldyrembryoner. NCC'er specificeres ved grænserne af den neurale plade og gennemgår en epitel-til-mesenkymal overgang (EMT) for at migrere fra dorsalneuralrøret1. Efter EMT spredes NCC'er i vid udstrækning gennem embryoet og differentierer og bidrager i sidste ende til forskellige strukturer, herunder kraniofacial skelet, hjertets udstrømningskanal og størstedelen af det perifere nervesystem2. Ændringer i cellepolaritet, cytoskelettet og vedhæftningsegenskaber ligger til grund for dette skift fra en præmigrativ til en migrerende cellepopulation3. At studere NCC EMT og migration giver indsigt i grundlæggende mekanismer for cellemotilitet og informerer indsatsen for at forebygge og behandle fødselsdefekter og kræftmetastase.

Mens in vivo-analyse er afgørende for at forstå NCC-udviklingsprocesser i en embryonal sammenhæng, tilbyder in vitro-metoder visuel og fysisk tilgængelighed, der letter yderligere eksperimentelle veje. I et forenklet 2D-miljø kan NCC-morfologi, cytoskeletale strukturer og migreret afstand evalueres. Desuden kan virkningerne af genetisk eller opløselig faktorforstyrrelse på migrerende adfærd hos bevægelige NCC'er analyseres 4,5,6,7,8,9,10. Derudover kan isolerede præmigratoriske eller migrerende NCC'er indsamles, samles og bruges til metoder med høj kapacitet til at studere udviklingsreguleringen af NCC'er gennem proteomisk, transkriptomisk og epigenomisk profilering 7,11. Mens der findes metoder til fremstilling af kraniale NCC'er fra forskellige udviklingsmodelorganismer12,13,14, demonstrerer denne artikel mekanikken i tilgangen for dem, der først lærer at dyrke kranial NCC fra kyllingembryoner.

Den nuværende protokol beskriver en alsidig teknik til fremstilling af chick kraniale NCC-kulturer (figur 1). Fordi NCC'er migrerer let fra explantede neurale folder på et kultursubstrat, adskilles chick NCC'er naturligt fra embryonalt væv, og primære kulturer genereres let. Da NCC'er i mellemhjernen migrerer en masse fra kraniale neurale folder (i modsætning til den langvarige cell-for-celle-delaminering i bagagerummet15), består disse kulturer hovedsageligt af migrerende kraniale neurale kamceller, med indledende neurale foldudskæringer, der giver en indsamlingsmetode til præmigratoriske NCC'er. En grundlæggende metode til dissekering og dyrkning af chick kraniale neurale folder er detaljeret, og der tilbydes forslag til forskellige applikationer og variationer af denne metode.

Figure 1
Figur 1: Skematisk oversigt over chick cranial neural fold kultur protokol. (A,B) Kraniale neurale folder (skitseret med blåt) udskæres fra et kyllingembryo med fem somitter (vist i dorsal visning i A). Grå bånd, hjertehalvmåne. (C) Når de er belagt med fibronectin, kommer migrerende neurale kamceller ud af de neurale folder og spredes på substratet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Enhver sort af Gallus gallus racer kan anvendes, herunder White Leghorn, Golden Sex Link eller Rhode Island Red. De kyllingæg, der blev anvendt i denne undersøgelse, var af forskellige racer og hentet fra flere kilder, herunder lokale gårde og rugerier.

1. Fremstilling af opløsninger og materialer

  1. Ringers opløsning fremstilles ved at blande 123,3 mM NaCl, 1,53 mM CaCl 2, 4,96 mM KCl, 0,809 mM Na 2 HPO 4 og 0,147 mMKH2 PO4 (se materialetabel). Juster pH til 7,4 og filtrer steriliser i 100 ml flasker. Opbevares på et rent, tørt sted. Vask ikke flasker med sæbe (behandl som vævskulturglas).
  2. Der fremstilles 1 mg/ml stamopløsning fibronectin (FN) (se materialetabel) ved at opløse FN i steril Ringer-opløsning og opbevares i 100 μL aliquoter ved -80 °C (stabil i mindst 4 år).
  3. Forbered komplette kulturmedier ved at supplere L15-medier med 0,8% L-glutamin, 0,08% penicillin / streptomycin, 10% FBS og 10% chick embryoekstrakt12. Opret 3 ml aliquots og opbevar ved -20 °C eller -80 °C.
    BEMÆRK: Hvis kulturer inkuberes i en CO2 -inkubator, skal DMEM / F12 erstattes af L15, som er bufferet til luft.
  4. Der fremstilles 4% paraformaldehydopløsning i 1x PBS. Juster pH til 7,4. Opret 10 ml aliquots og gem dem ved -20 °C.
    FORSIGTIG: Paraformaldehyd skal håndteres i en røghætte.
  5. Forbered filterpapirstøtterammer (ca. 1 cm x 1,5 cm rektangler af papir med to eller tre stansede huller, der overlapper hinanden på den lange akse).
    1. Stans huller langs kanten af et stort stykke filterpapir ved hjælp af en standard tre-hullers stans, skær / trim den stansede kant i en strimmel, og skær derefter strimlen mellem hullerne i rektangler ~ 1,5 cm i længden. Autoklave filtrerer papirer før brug (valgfrit).
  6. Saml dissektionsværktøjer, herunder fine tang , stump tang, dissektionssaks, fjedersaks og skærpede wolframnåle16.

2. Inkubation af embryoner

  1. Få befrugtede æg fra en af de ovennævnte kilder.
  2. Placer de befrugtede æg i opretstående stilling (æggets lange akse lodret med den spidse ende nedad / stump side opad) inde i en befugtet inkubator ved 38 ° C (100 ° F).
  3. Inkuberes, indtil fire til syv somitter er dannet (trin 8+-9)17, hvilket tager ca. 35 timer.
    BEMÆRK: Inkubationstiden kan variere betydeligt afhængigt af stammen, hønsens alder, sæson osv. og skal bestemmes eksperimentelt. Programmerbare udløbstimere er nyttige til at starte inkubation om natten for at opnå den ønskede timing.
  4. Efter fjernelse fra inkubatoren sprøjtes æggene grundigt med 70% ethanol og lad dem tørre for at desinficere skallerne.
    BEMÆRK: Embryoner kan indsamles med det samme, men at lade æg afkøle til stuetemperatur reducerer æggeblommernes skrøbelighed og embryotab under indsamling.

3. Tilberedning af kulturretter

  1. Vælg neurale foldekulturretter (se Materialetabel), der passer til downstream-applikationen.
    1. For kulturer, der vil blive fastgjort og farvet, skal du bruge glasdæksler placeret i multi-well vævskulturretter.
      BEMÆRK: Dækslip, der matcher brøndstørrelsen, bevæger sig mindre med væskeblanding, hvilket gør explants mindre tilbøjelige til at skifte og mere tilbøjelige til at klæbe til dækslippen snarere end skålbunden.
    2. Vælg glasbundne enkeltkammer- eller opdelte kammerskåle (se Materialetabel) til levende billeddannelse med et omvendt mikroskop.
    3. Til levende billeddannelse på et opretstående eller stereomikroskop skal du bruge 6-, 12- eller 24-brønds optisk passende vævskulturplader.
    4. Vælg plastvævskulturretter til masseindsamling af migrerende neurale kamceller til analyser med høj kapacitet.
  2. Der tilsættes 10 E/ml penicillin og 10 μg/ml streptomycin til en 100 ml flaske steril Ringer-opløsning (f.eks. 100 μL 10.000 U/ml penicillin og 10.000 μg/ml streptomycin for at fremstille Ringers P/S). Brug Ringer's P/S inden for 1 uge.
  3. Tø en aliquot på 1 mg/ml FN på is. Fortyndes med Ringers P/S til en koncentration på 10-100 μg/ml FN.
  4. Pipet nok FN-opløsning til at dække bunden af brønden eller skålen. For eksempel 100 μL pr. brønd i en 24-brønds plade, 500 μL til en 35 mm skål.
  5. Sæt låget på igen, og opsæt tallerkener eller tallerkener med FN-opløsning i en befugtet inkubator (eller en overdækket bakke med destilleret vandvædet papirhåndklæde) ved 38 °C (100 °F) i mindst 1 time, mens neurale folder dissekeres.

4. Isolering af kyllingembryoner

  1. Pas på at opretholde æggets orientering (embryoet flyder til toppen af æggeblommen under inkubation). Brug saks eller stump tang til at stikke et lille hul i skallen, ca. 1/4-1/3 af vejen ned langs ægget.
    1. Indsæt forsigtigt spidsen af saks eller stump tang i det lille hul, sørg for ikke at forstyrre æggeblommen, og skær gennem æggeskallen omkring ægget, fjern toppen af æggeskallen (figur 2A).
  2. Placer embryoet til isolering.
    BEMÆRK: Hvis embryoet ikke er ideelt placeret i skalkoppen, skal du bruge stumpe tang til forsigtigt at dreje æggeblommen, så embryoet er på toppen. Alternativt hældes æggeblommen i en behandsket, cupped hånd, pas på ikke at bryde æggeblommen og lad albuminen løbe væk (figur 2B). Derefter kan embryoet placeres ved at flytte æggeblommen fra hånd til hånd.
  3. Forbered embryoet ved forsigtigt at bruge den flade kant af lukkede stumpe tang til at tørre overskydende albumin væk, der forbliver på æggeblommens overflade, der dækker embryoet (figur 2C). Overskydende albumin kan også fjernes ved hjælp af let tryk med en delikat opgavevisker.
    BEMÆRK: Når albumin er ryddet væk, skal æggeblommens overflade fremstå struktureret i stedet for glat. Manglende sletning af tilstrækkeligt albumin vil hæmme vedhæftningen af filterpapirstøtten i afsnit 4, trin 4.
  4. Brug tang til at placere en filterpapirstøtteramme over embryoet med embryoet i rammens vindue. Tryk forsigtigt ned på filterpapiret for at klæbe det på æggeblommen.
  5. Skær rundt om ydersiden af filterpapirrammen med dissektionssaks (figur 2D). Brug tang eller saksespidser til at gribe fat i kanten af rammen og løft forsigtigt embryoet væk fra æggeblommen (figur 2E). At løfte væk i en vinkel vil hjælpe med at fjerne embryoet rent fra æggeblommen.
  6. Embryonet anbringes med papirrammens side nedad (embryoets ventrale side opad) i en 60 mm eller 100 mm petriskål fyldt med Ringers P/S (figur 2F). Opbevar skålen med embryoner på is, hvis den samles til en RNA- eller proteinfølsom downstream-applikation.
    BEMÆRK: Manglende placering af embryoner ventral side opad risikerer at løsne dem fra deres papirrammer. Flere embryoner kan indsamles og opbevares i Ringers P/S i op til 1 time, før de flyttes til de neurale folddissektionstrin.

5. Dissekering af neurale folder

  1. Overfør et embryon til en ren skål, der indeholder Ringers P/S-opløsning, og skyl embryoet ved at holde filterpapirrammen med tang og forsigtigt svinge frem og tilbage for at fjerne enhver æggeblomme, der skjuler udsynet til embryoet. Byt Ringer's P/S eller overfør til en frisk ret, hvis det bliver overskyet.
  2. Placer embryoets dorsale / rammeside opad under et dissekerende mikroskop. Lad embryoet stå på papirrammen for at holde det strakt stramt og holdt på plads, fjern vitellinmembranen ved hjælp af tang for at udsætte de neurale folder.
    BEMÆRK: Hvis embryoet falder af papirrammen, kan det lægges fladt i skålen eller fastgøres til en sylgardbelagt skål18 til dissektion.
  3. Brug fjedersaks eller en skærpet wolframnål til forsigtigt at skære mellemhjernens neurale folder. Medtag vævskæk til de ekspanderende optiske vesikler og rostral til baghjernen, hvor rhombomere-indsnævringer lige er begyndt at dukke op (hjertehalvmånen er også en nyttig indikator, figur 3B, C). Pas på at fjerne det dorsale aspekt af neuralfolden med minimal forurenende neuralrør og ikke-neural ektoderm (figur 3C).
  4. Overfør neurale folder til en ren skål, der indeholder Ringers P/S ved hjælp af en P20-pipettor eller en steril Pasteur-pipette i glas skyllet med yolky Ringers P/S (dette blokerer plasten eller glasset for at forhindre vævet i at klæbe). Opbevar indsamlede folder på is, mens du dissekerer yderligere folder.

6. Plating neurale folder

  1. Optø en aliquot af komplette kulturmedier (afsnit 1, trin 3). Tilsæt 100 U/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin og filtersteriliser. Hold forberedte medier ved 37-38 °C, mens du udfører andre trin.
  2. Fjern kulturretter fra inkubatoren (afsnit 3, trin 5). Brug en pipettor eller Pasteur-pipette til at fjerne FN-opløsningen fra dæksler, tallerkener eller brønde. Efter skylning af det FN-belagte substrat med Ringers P/S tilsættes en passende mængde komplette kulturmedier til opvasken eller brøndene (500 μL for brønde i en 24-brøndsplade, 2 ml for en 35 mm skål eller en seks-brønds plade).
    BEMÆRK: Mindre mængder kan bevare dyre reagenser (f.eks. Så lavt som 200 μL for en 24-brønds plade), men sikre, at skålen er tilstrækkeligt befugtet til at undgå fordampning.
  3. Brug en p20- eller p200-pipettor til først at skylle pipettespidsen med yolky Ringers P/S for at blokere plasten og forhindre vævet i at klæbe. Overfør derefter de isolerede neurale folder på de FN-belagte dæksler, og sørg for at overføre så lidt Ringers P / S som muligt. Placer folden/folderne mod midten af den FN-belagte dæksel.
    BEMÆRK: En eller et par neurale folder kan belægges på en 12 mm dækslip i en 19 mm brønd, op til 50 på en 35 mm plade.
  4. Efter at have ladet explanterne nøjes i 10-15 minutter, anbring dem i et befugtet kammer ved 38 ° C (100 ° F) ved langsomt og omhyggeligt at bære kulturskålene med belagte neurale folder. Dette vil minimere forskydningen af neurale folder i brøndene og sikre, at de forbliver spredt og klæber til eventuelle dæksler.
    BEMÆRK: Når du bruger L15 (ikke DMEM), kan explantkulturretter også inkuberes i en æginkubator ved hjælp af en overdækket bakke med fugtede papirhåndklæder.
  5. Inkubere neurale foldekulturer i den befugtede inkubator i løbet af aktiv migration (ca. 16-20 timer i alt, figur 4).

7. Fastsættelse og farvning af dyrkede migrerende NCC'er til morfologisk analyse

  1. Fjern kulturmediet med en Pasteur-pipette og skyl brøndene med filtersteriliseret 1x PBS.
  2. Tilsæt 4% paraformaldehyd i 15 minutter ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at bestemme fikseringstiden eksperimentelt. Det er også muligt at tilføje paraformaldehyd direkte til medier i 10 min (50:50), fjerne og erstatte med ufortyndet 4% paraformaldehyd i 10 minutter for at bevare mere sarte cellulære strukturer.
  3. Fjern paraformaldehyd og skyl tre gange med 1x PBS.
  4. Pletfaste NCC'er med et passende farvestof til morfologisk vurdering. Som et eksempel er farvning med Oregon Green konjugeret phalloidin beskrevet her.
    BEMÆRK: Visualisering af actincytoskelettet med phalloidin19 afslører den strukturelle kompleksitet af migrerende NCC med relativt ensartet farvningsintensitet; Men, Phalloidin kan ikke fremhæve alle celleområder. Farvestoffer, der mærker plasmamembranen (f.eks. Hvedekim agglutinin eller DiI) eller cytoplasma, kan også anvendes, men komplicerer billeddannelsen af fine fremspring i forhold til den stærkt farvede cellekrop. Derudover kan immunfluorescens udføres samtidigt for at mærke neurale kamceller med HNK-1 eller for at bestemme den subcellulære lokalisering af et protein af interesse 7,20.
    1. Den endelige PBS-skylning fjernes, og der tilsættes PBS + 0,5 % Triton X-100 (PBST) + 5 % serum (FBS eller fra et andet dyr, der er egnet til costaining med et antistof) for at dække dækslikkerne og inkuberes i 10 minutter på en platformryster ved stuetemperatur.
    2. Pipet 200 nM Oregon Green konjugeret phalloidin (fortyndet i PBST + 5% serum) på en glat overflade (såsom fleksibel paraffinforseglingsfilm) for hver dækslip. For en 12 mm dækslip, pipetter en 30 μL volumen.
    3. Brug et par tang til at fjerne dækslippen fra PBST + 5% serum, hvilket sikrer at opretholde orienteringen af cellerne, der vender opad. Rør kort ved kanten af dækslippen til en delikat opgavevisker for at transportere overskydende væske af.
    4. Placer forsigtigt hver coverslip-celleside nedad på dråben af fortyndet phalloidin. Inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur. Opbevar dækslerne i mørke under farvning (dæk med et aluminiumsfoliebelagt fad eller læg det i en skuffe).
    5. Under inkubationen tilsættes PBST til kulturskålens brønde (750 μL PBST for hver brønd i en 24-brøndsplade).
    6. Efter inkubationsperioden løftes dækslerne af farvningsopløsningen og lægges tilbage i kulturskålen, og dækslet vendes, så cellesiden er oppe. Sørg for, at dækslippet er dækket af PBST, og placer på en platformryster i 10 minutter, og hold dæksedlerne dækket og i mørke. Fjern PBST og gentag dette trin to gange, i alt tre 10 minutters vask.
    7. Anbring en dråbe (pr. dækslip) monteringsmedie (se Materialetabel) på et mikroskopglas. 25 μL volumen fungerer godt til en 12 mm dækslip.
    8. Efter den sidste vask med PBST skal du røre ved kanten af dækslippet til en delikat opgavevisker for at fjerne overskydende væske og holde styr på cellesiden af dækslip.
    9. Monter dækslipcellens side nedad ved langsomt at sænke dækslippet i en vinkel på monteringsmediet for at undgå at skabe bobler. Lad mediet indstille før billeddannelse.

8. Morfologisk vurdering af dyrkede migrerende NCC'er

  1. Billede farvede celler og eksport som .tiff filer.
    BEMÆRK: Et 40x mål fungerer godt til billeddannelseskulturer, men mål fra 10x (for at fange et helt felt af migrerende NCC'er) til 100x (enkelt NCC'er) kan bruges til at indsamle billeder til morfologisk vurdering. Billeder i denne undersøgelse blev taget ved hjælp af en omvendt multimodal billeddannelsesplatform (se Materialetabel).
  2. Upload billederne til en billedanalysesoftware (ImageJ21, se Materialetabel). Klik på Billede > duplikat for at oprette en anden kopi af hvert billede, der skal bruges til analyse, og dermed efterlade originalen uredigeret, da det meste billedbehandling ikke kan vendes om.
  3. Klik på Billede > Juster > lysstyrke / kontrast , og brug glidebjælker til at justere lysstyrken eller kontrasten på billederne.
  4. Konverter billederne til gråtoner ved at følge nedenstående trin.
    1. Hvis billeder eksporteres i RGB, uploades de i RGB som en flettet kanal. For at adskille billederne skal du klikke på Billede > farve > opdelte kanaler for at erhverve gråtonebilleder med en kanal.
    2. Hvis billeder allerede er adskilt, skal du gå til Billede > Type > 8-bit for at konvertere filen til gråtoner.
  5. Klik på Billede > Juster > tærskel for at konvertere til et binært billede, hvor pixels identificeres som celler (forgrund; sort) eller baggrund (hvid). Brug glidebjælken og / eller klik på Auto for at vælge tærskelindstillingen, der klart definerer celler fra baggrunden.
    1. Hvis cellerne overlapper hinanden, eller farvningen ikke er kontinuerlig, kan det være nødvendigt at behandle yderligere ved hjælp af funktionerne Vandskel eller Fyldhuller22. Dette vil adskille celler fra hinanden eller udfylde huller i celler, der skal analyseres. Klik på Process > Binary > Make Binary for først at konvertere billedet til et 8-bit binært format. Klik derefter på Behandl > binære > vandskel eller fyldhuller.
      BEMÆRK: Softwaren passer bedst til, hvor signaler skal adskilles eller udfyldes, hvilket kan justeres yderligere ved hjælp af plug-ins, hvis det er nødvendigt.
  6. Vælg de målinger, der skal fanges. Klik på Analysér > indstil målinger , og marker afkrydsningsfelterne Formbeskrivelser til analyse af cirkularitet (circ.), billedformat (AR), rundhed (rund) og soliditet.
    BEMÆRK: Andre målinger kan også medtages, som område og perimeter, afhængigt af den type analyse, der er behov for.
  7. Klik på Analysér > Analysér partikler, og indstil parametrene fra menuen " Analysér partikler".
    1. Under "Størrelse" skal du groft estimere, hvor store cellerne eller partiklerne af interesse er i pixels, da baggrundssignal eller mindre celleaffald også vil blive inkluderet, hvis størrelsesparameteren forbliver indstillet til 0-uendelig (for eksempel indstillet som 500-uendelig i figur 5).
      BEMÆRK: Justering af størrelsen til et strammere område kan udelukke mindre eller større partikler end dem, der er nødvendige til analyse.
    2. Under "Cirkularitet" skal du lade være ved 0-1,0 for at måle alle celleformer i billedet.
    3. Under "Vis" skal du vælge Bare konturer i rullemenuen for at inspicere de cellekonturer, der er valgt med funktionen "Analyser partikler". Scan konturerne for at sikre, at der skelnes mellem overlappende celler, men celler ikke opdeles unødigt. Marker også menufelterne for "Vis resultater", "Opsummer" og "Føj til manager".
  8. Når alle parametre er indstillet, skal du klikke på Ok.
    BEMÆRK: Fire separate vinduer vises, der viser (1) de blotte konturer af de celler, der er identificeret på billedet, (2) cellerne tælles på billedet, (3) resultaterne af hver celles målinger og (4) et resumé af det samlede antal celler, der tælles, og deres gennemsnitlige målinger.
    1. Hvis snavs blev talt, blev overlappende celler talt som en, enkeltceller blev talt som multipla, eller mange celler blev udeladt fra optællingen, gå tilbage til det oprindelige, uredigerede billede, lav en anden duplikat og juster "Tærskel" eller andre parametre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En oversigt over denne protokol er vist i figur 1. De inkuberede æg blev åbnet, og æggeblommen med embryoet på overfladen blev isoleret ved forsigtigt at hælde i håndfladen på en behandsket hånd (figur 2A, B). Efter at albuminet er blevet fjernet (figur 2C), blev der påført filterpapirrammer på æggeblommemembranen, der omgiver embryoet, for at lette skæring og løft af embryoet fra æggeblommen, som begynder at spildes væk, når æggeblommemembranerne er skåret (figur 2D, E).

Figure 2
Figur 2: Isolering af fire til syv somite chick embryoner. Befrugtede æg blev inkuberet i 35 timer. Et æg blev åbnet med stump tang (A), og æggeblommen blev hældt i en behandsket hånd (B). Overskydende albumin blev fjernet (C), så en filterpapirstøtte (D, indsat) ville klæbe til æggeblommen. Embryoet blev skåret fra æggeblommen (D), løftet af (E) og anbragt i Ringers P/S (F). Klik her for at se en større version af denne figur.

Efter skylning af embryoet og flytning for at rense Ringers P/S var neurale folder synlige i de isolerede embryoner (figur 3A). Disse folder indeholder præmigrerende kraniale neurale kamceller. Når de er udskåret fra et embryo (figur 3B, C) og indsamlet (figur 3D), kan isolerede neurale folder belægges for at skabe migrerende NCC-kulturer.

Figure 3
Figur 3: Dissektion af chick dorsale neurale folder. I Ringers P/S blev fjedersaksen brugt til at fjerne neurale folder. (A) Embryo dorsal visning, forreste mod toppen af figuren. Neurale folder fremstår mere uigennemsigtige end det omgivende væv. Mellemhjernens neurale folder ligger bageste til de optiske lobes (lyserød) og anterior til hjertehalvmånen (gul). (B) Dorsal visning af embryoet efter neurale folder blev fjernet, der viser excision grænser. (C) Sidebillede af embryoet med neurale folder fjernet. Dissektionsteknikken fjerner det dorsale neurale rør og undgår ventrale og ikke-neurale rørstrukturer. (D) Isolerede neurale folder i Ringers P/S. Skalabar = 300 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Da neurale folder blev belagt på FN, begyndte NCC'er at dukke op fra vedhæftede neurale foldeksplanter inden for 3-4 timer efter inkubation (figur 4A), og migration blev afsluttet efter ca. 20 timer (figur 4B). HNK-1-farvning, der mærker migrerende NCC'er20, var tydelig i de fleste celler i kulturen (figur 4D). Et negativt resultat opstod, når neurale folder ikke klæbede til dækslippet, eller ingen NCC emigrerede fra explant (data ikke vist). NCC'er blev analyseret ved at fastsætte kulturerne, farvning for filamentøs actin og udføre forskellige målinger i ImageJ for at evaluere NCC-morfologi og migration (figur 5). Det gennemsnitlige areal af de 69 analyserede celler var 802,11 ± 69,65 μm 2, med et interval fra 60,27-2664,53 μm2, fordelt som vist i søjlediagrammet og violinplottet (figur 5C). Cirkularitet (formel: cirkularitet = 4π (areal / omkreds²)), et mål, der afspejler en celles fremspring, varierede fra 0,101-0,875 med et gennemsnit på 0,38 ± 0,15. Lavere værdier angiver en langstrakt form, mens en værdi på 1 angiver en perfekt cirkel. Som det fremgår af violinplottet, udviser de fleste celler en langstrakt form (figur 5D). Et andet mål for celleform er billedformatet (AR), som er hovedaksen i cellen divideret med den mindre akse. En AR-værdi på 1 angiver en symmetrisk form23. Migrerende NCC'er på dette område havde en gennemsnitlig AR på 2,13 ± 0,11 med værdier fra 1,14-5,59 (figur 5E). Ved hjælp af disse kvantitative målinger af NCC-morfologi kan der foretages strenge sammenligninger mellem eksperimentelle forhold og forskellige offentliggjorte undersøgelser.

Figure 4
Figur 4: Migrerende NCC'er kommer fra kultiverede neurale folder. Brightfield-billeder af belagte neurale folder efter 3 timers inkubation (A) og 20 timers inkubation (B). Skala bar = 200 μm. (C,D) Den neurale fold er stort set spredt efter 20 timers inkubation, men er til stede på højre side af disse billeder. Skala bar = 500 μm. Migrerende NCC'er er synlige med DAPI (C) og HNK-1 farvning (D). HNK-1 immunostaining bekræfter, at dyrkede celler er migrerende NCC'er.

Figure 5
Figur 5: Morfologisk vurdering af dyrkede migrerende NCC'er. (A) Phalloidinfarvning af filamentøs actin i NCC'er migreret fra en neural fold efter 20 timer i kultur. Skala bar = 50 μm. (B) Tærskelbillede med celler, der ser sorte ud og baggrunden hvid. Gule konturer omgiver objekter, der tælles som celler, og celler nummereres. (C-E) Grafindstillinger for at vise morfologiske vurderingsdata. Søjlediagrammer og violinplotter blev oprettet ud fra målinger af de 69 celler, der er vist i panel B for at skildre området (μm2, C), cirkularitet (D) og billedformat (E) for de målte celler. Søjlediagrammer viser gennemsnitsværdier med fejllinjer, der repræsenterer standardfejlen for middelværdien til venstre for hvert panel. Violinplots blev skabt med app.rawgraphs.io. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Teknikken beskrevet her giver en tilpasningsdygtig metode til at isolere chick neurale folder og plating dem for at skabe kulturer af migrerende kraniale NCC'er. Disse kulturer giver forenklede 2D-betingelser for nem analyse af chick NCC-migration og morfologi, der kan supplere mere teknisk udfordrende i ovo-billeddannelsesmetoder 24,25,26. Selv om denne in vitro-metode er forholdsvis enkel, afhænger de konsistente resultater af æg og reagenser af høj kvalitet. På grund af kulturernes iboende variabilitet kræver reproducerbarhed desuden eksperimentel gentagelse og kvantificering.

Vedhæftningen af neurale folder til FN er afgørende for NCC-migration i kultur. Lejlighedsvis vil explants ikke klæbe ordentligt, og den neurale fold vil enten flyde væk eller producere ingen / få migrerende NCC'er. Dette kan ske, når en kranial neural fold ikke lander skåret side nedad; Prøv at orientere explanterne i kulturbeholderen inden inkubation og lad dem nøjes i 10-15 minutter, før du flytter dem. På grund af væskeblanding under overførsel til inkubatoren vil nogle neurale folder uundgåeligt klæbe suboptimalt fra tid til anden. Når vedhæftning og migration er problematisk for et helt eksperiment, kan dette afspejle gammelt FN (brug en frisk aliquot fra -80 °C for hvert forsøg), dyrkningsmedium med udløbne komponenter (opbevar medier fremstillet i forsøgsstørrelser aliquoter ved -20 °C og tilsæt frisk antibiotika på anvendelsestidspunktet) eller anvendelse af dækslip, der ikke er egnede til cellekultur (f.eks. celler vil ikke overholde dæksedler til histologi). En forurenet inkubator kan også få hele NCC-kultureksperimenter til at mislykkes.

Ud over at producere spredte NCC'er i kultur og give mulighed for analyse af migrerende NCC-morfologi, er denne protokol også et udgangspunkt for mange andre eksperimenter. Eksplanter belagt på dækslips kan også behandles til immunfluorescens (efter afsnit 7, trin 3) for at bestemme den subcellulære lokalisering af et protein af interesse7. Mens analyse af morfologi og migrationsafstand er mulig i faste kulturer, som beskrevet her, giver time-lapse-billeddannelse af NCC'er under kulturinkubation (afsnit 6, trin 5) mulighed for yderligere dataindsamling om retningsvirkning og persistens af migration og dynamik i cellemotilitet (målinger af membranfremspring, vedhæftning osv.) 14,24,27. Forbigående genetisk manipulation af embryoner kan opnås ved elektroporation18,28 af reagenser (morpholinos29, DNA-ekspressionskonstruktioner eller CRISPR-vektorer30) på Hamburger og Hamilton trin 4 + 17. Disse elektroporerede embryoner kan derefter bruges i protokollen til at skabe migrerende NCC-kulturer med tab af funktion eller overekspression af gener af interesse. Funktionel analyse kan også opnås ved at tilføje kemiske hæmmere til mediet for NCC-kulturer 7,27 (afsnit 6, trin 2). Profilering på befolkningsniveau af NCC'er gennem analyser på -omics-niveau kræver indsamling af NCC'er som råmateriale 7,11,31. Mens markører er blevet brugt til at isolere NCC'er gennem fluorescensaktiveret cellesortering31, kræver dette specialiseret flowcytometriudstyr og enzymatisk dissociation af celler. Ved at følge de metoder, der er beskrevet her, til omhyggeligt at udskære dorsale neurale folder (minimering af indsamling af ventrale neurale rør og ikke-neurale ektodermceller) giver en billig metode til indsamling af præmigratoriske NCC'er11 (afsnit 5, trin 4). Indsamling af NCC'er efter spredning i kultur (afsnit 6, trin 5) leverer en relativt ren population af naturligt adskilte, migrerende NCC'er til yderligere analyse (HNK-1-farvning, en markør for migrerende NCC'er, i størstedelen af dyrkede celler i figur 4D; som i7). Endelig kan disse variationer bruges i kombination. For eksempel kan immunfluorescens eller time-lapse-billeddannelse bruges til at evaluere virkningerne af genekspressionsmanipulationer eller tilsætning af hæmmere27. Samlet set giver denne tilpasningsdygtige, billige protokol midlerne til at vurdere morfologien af vildtype kraniale migrerende NCC'er i kultur med flere potentielle ændringer for at nå forskellige eksperimentelle mål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi takker Corinne A. Fairchild og Katie L. Vermillion, som deltog i udviklingen af vores version af chick cranial neural fold culture protocol.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AxioObserver equipped with an LSM710 confocal scan head controlled by ZEN 3.0 SR software  Zeiss Used alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 objective
CaCl2 Sigma-Aldrich C3306
Chamber dishes (glass bottom, single or divided) MatTek; Cell Vis P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis)
X000NOK1OJ (Cellvis)		 Single chamber 35 mm or 4 chamber 35 mm
Cover glass Carolina Biological Supply Company 633029, 633031, 633033, 633035, 633037 circles, 0.13–0.17 mm thickness, available in 12-25 mm diameter 
DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 11320033 Alternative for L15 media
Egg incubator Sportsman 1502
FBS  Life Technologies 10437-028
Fibronectin Fisher Scientific CB-40008A
Filter paper Whatman grade 3MM chromatography
Forceps (blunt) Fisher Scientific; Thomas Scientific 08-890 (Fisher);1141W97 (Thomas)
Forceps (fine) Fine Science Tools 11252-20 Dumont #5
Image J https://fiji.sc/ Free image analysis software
KCl Sigma-Aldrich P3911
KH2PO4 Sigma-Aldrich P0662
L15 media Invitrogen 11415064
L-glutamine Invitrogen 25030
Mounting Media (Vectashield or ProLong Gold) Vector Laboratories; Thermofisher Scientific H-1700 (Vectashield); P36930 (ProLong Gold)
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S9638
NaCl Sigma-Aldrich S9888
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Penicillin/streptomycin Life Technologies 15140-148 10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 mg/mL Streptomycin
Petri Dishes VWR (or similar) 60 mm, 100 mm
Phalloidin Sigma-Aldrich P1951 multiple flurophores available
Pin holder Fine Science Tools 26016-12 For tungsten needle (alternative for spring scissors)
Scissors (dissection) Fine Science Tools 14061-10
Spring Scissors Fine Science Tools 15000-08 2.5 mm cutting edge (alternative for tungsten needle)
Sylgard Krayden Sylgard 184
Syringe Filters Sigma-Aldrich SLGVM33RS Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized
Tissue culture dishes Sarstedt 83-3900 35 mm culture dishes for bulk neural fold cultures
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Tungsten wire Variety of sources 0.01" diameter for tungsten needle (alternative for spring scissors)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pla, P., Monsoro-Burq, A. H. The neural border: Induction, specification and maturation of the territory that generates neural crest cells. Developmental Biology. 444, 36-46 (2018).
  2. Tang, W., Bronner, M. E. Neural crest lineage analysis: From past to future trajectory. Development. 147 (20), (2021).
  3. Piacentino, M. L., Li, Y., Bronner, M. E. Epithelial-to-mesenchymal transition and different migration strategies as viewed from the neural crest. Current Opinion in Cell Biology. 66, 43-50 (2020).
  4. McLennan, R., et al. Neural crest cells bulldoze through the microenvironment using Aquaporin 1 to stabilize filopodia. Development. 147 (1), 185231 (2020).
  5. Carmona-Fontaine, C., et al. Complement fragment C3a controls mutual cell attraction during collective cell migration. Developmental Cell. 21 (6), 1026-1037 (2011).
  6. Giovannone, D., et al. Slits affect the timely migration of neural crest cells via robo receptor. Developmental Dynamics. 241 (8), 1274-1288 (2012).
  7. Vermillion, K. L., Lidberg, K. A., Gammill, L. S. Cytoplasmic protein methylation is essential for neural crest migration. Journal of Cell Biology. 204 (1), 95-109 (2014).
  8. Yang, X., Li, J., Zeng, W., Li, C., Mao, B. Elongator Protein 3 (Elp3) stabilizes Snail1 and regulates neural crest migration in Xenopus. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  9. Gonzalez Malagon, S. G., et al. Glycogen synthase kinase 3 controls migration of the neural crest lineage in mouse and Xenopus. Nature Communications. 9 (1), 1-15 (2018).
  10. Bhattacharya, D., Azambuja, A. P., Simoes-Costa, M. Metabolic reprogramming promotes neural crest migration via yap/tead signaling. Developmental Cell. 53 (2), 199-211 (2020).
  11. Jacques-Fricke, B. T., et al. Profiling NSD3-dependent neural crest gene expression reveals known and novel candidate regulatory factors. Developmental Biology. 475, 118-130 (2021).
  12. Bronner-Fraser, M., García-Castro, M. Chapter 4 manipulations of neural crest cells or their migratory pathways. Methods in Cell Biology. 87, 75-96 (2008).
  13. Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Dissection of xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation. Journal of Visualized Experiments. (85), e51118 (2014).
  14. Malagon, S. G. G., et al. Dissection, culture and analysis of primary cranial neural crest cells from mouse for the study of neural crest cell delamination and migration. Journal of Visualized Experiments. (152), e60051 (2019).
  15. Theveneau, E., Mayor, R. Neural crest delamination and migration: From epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration. Developmental Biology. 366 (1), 34-54 (2012).
  16. Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus. Journal of Neuroscience Methods. 50 (1), 123-127 (1993).
  17. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  18. Gammill, L. S., Jacques-Fricke, B., Roffers-Agarwal, J. Embryological and genetic manipulation of chick development. Methods in Molecular Biology. 1920, 75-97 (2019).
  19. Vandekerckhove, J., Deboben, A., Nassal, M., Wieland, T. The phalloidin binding site of F-actin. The EMBO Journal. 4 (11), 2815-2818 (1985).
  20. Bronner-Fraser, M. Analysis of the early stages of trunk neural crest migration in avian embryos using monoclonal antibody HNK-1. Developmental Biology. 115 (1), 44-55 (1986).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Soille, P., Vincent, L. Determining watersheds in digital pictures via flooding simulations. Visual Communications and Image Processing '90: Fifth in a Series. (1360), 240-250 (1990).
  23. Haupt, A., Minc, N. How cells sense their own shape - mechanisms to probe cell geometry and their implications in cellular organization and function. Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).
  24. Ezin, M., Fraser, S. Chapter 11 time-lapse imaging of the early avian embryo. Methods in Cell Biology. 87, 211-236 (2008).
  25. Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. In ovo live imaging of avian embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 5 (6), (2010).
  26. McKinney, M. C., Kulesa, P. M. Live imaging of the neural crest cell epithelial-to-mesenchymal transition in the chick embryo. Methods in Molecular Biology. 2179, 107-114 (2021).
  27. Gustafson, C. M., Roffers-Agarwal, J., Gammill, L. S. Chick cranial neural crest cells release extracellular vesicles that are critical for their migration. Journal of Cell Science. , (2022).
  28. Williams, R., Sauka-Spengler, T. Ex ovo electroporation of early chicken embryos. STAR Protocols. 2 (2), 100424 (2021).
  29. Moulton, J. D. Using morpholinos to control gene expression. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 68 (1), 4-30 (2017).
  30. Gandhi, S., et al. A single-plasmid approach for genome editing coupled with long-term lineage analysis in chick embryos. Development. 148 (7), (2021).
  31. Williams, R. M., et al. Reconstruction of the Global Neural Crest Gene Regulatory Network In Vivo. Developmental Cell. 51 (2), 255-267 (2019).

Tags

Udviklingsbiologi udgave 184
Forberedelse og morfologisk analyse af chick kraniale neurale crestcellekulturer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jacques-Fricke, B. T.,… More

Jacques-Fricke, B. T., Roffers-Agarwal, J., Gustafson, C. M., Gammill, L. S. Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures. J. Vis. Exp. (184), e63799, doi:10.3791/63799 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter