Este protocolo versátil descreve o isolamento das células de crista neural pré-cardíaca (NCCs) através da excisão de dobras neurais cranianas de embriões de filhotes. Após o revestimento e a incubação, as DCNT migratórias emergem das explicações da dobra neural, permitindo a avaliação da morfologia celular e da migração em um ambiente 2D simplificado.
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Artigo de método
Preparação e Análise Morfológica das Culturas celulares da crista neural do pintinho
Neste artigo
Resumo
Resumo
Durante o desenvolvimento de vertebrados, as células da crista neural (NCCs) migram extensivamente e se diferenciam em vários tipos celulares que contribuem para estruturas como o esqueleto craniofacial e o sistema nervoso periférico. Embora seja fundamental compreender a migração do NCC no contexto de um embrião 3D, isolar células migratórias na cultura 2D facilita a visualização e a caracterização funcional, complementando estudos embrionários. O presente protocolo demonstra um método para isolar as dobras neurais cranianas de filhotes para gerar culturas primárias de NCC. NCCs migratórios emergem de explanações de dobra neural banhadas em um substrato revestido de fibronectina. Isso resulta em populações dispersas e aderentes da NCC que podem ser avaliadas por coloração e análises morfológicas quantitativas. Essa abordagem de cultura simplificada é altamente adaptável e pode ser combinada com outras técnicas. Por exemplo, a emigração ncc e comportamentos migratórios podem ser avaliados por imagens de lapso de tempo ou funcionalmente consultados por incluir inibidores ou manipulações experimentais da expressão genética (por exemplo, DNA, morfolino ou eletroporação CRISPR). Devido à sua versatilidade, este método fornece um poderoso sistema para investigar o desenvolvimento craniano do NCC.
Introdução
As células da crista neural (NCCs) são uma população celular transitória em embriões vertebrados. Os NCCs são especificados nas bordas da placa neural e passam por uma transição epitelial-mesenquimal (EMT) para migrar do tubo neural dorsal1. Após o EMT, os NCCs se dispersam extensivamente por todo o embrião, finalmente diferenciando e contribuindo para várias estruturas, incluindo o esqueleto craniofacial, o trato de saída do coração e a maioria do sistema nervoso periférico2. Mudanças na polaridade celular, no citoesqueleto e nas propriedades de adesão subjacentes a essa mudança de uma pré-conferência para uma população....
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Protocolo
Qualquer variedade de raças gallus gallus pode ser usado, incluindo White Leghorn, Golden Sex Link, ou Rhode Island Red. Os ovos de galinha utilizados no presente estudo foram de várias raças e obtidos de múltiplas fontes, incluindo fazendas e incubatórios locais.
1. Preparação de soluções e materiais
- Prepare a solução do Ringer misturando 123,3 mM NaCl, 1,53 mM CaCl2, 4,96 mM KCl, 0,809 mM Na2HPO4 e 0,147 mM KH2PO4 (ver Tabela de Materiais). Ajuste o pH para 7,4 e o filtro esteriliza em garrafas de 100 mL. Guarde em um local limpo e ....
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Resultados
Uma visão geral do presente protocolo é mostrada na Figura 1. Os ovos incubados foram abertos, e a gema, com o embrião na superfície, foi isolada por suavemente derramar na palma de uma mão enluvada (Figura 2A,B). Depois de limpar a albumina (Figura 2C), as molduras de papel do filtro foram aplicadas na membrana da gema ao redor do embrião para facilitar o corte e o levantamento do embrião da gema, que começa a derr.......
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Discussão
A técnica descrita aqui fornece um método adaptável de isolar as dobras neurais de filhotes e emplacando-as para criar culturas de NCCs cranianas migratórias. Essas culturas fornecem condições 2D simplificadas para fácil análise da migração e morfologia do NCC que podem complementar mais tecnicamente desafiadores nos métodos de imagem ovo 24,25,26. Embora este método in vitro seja relativamente simples, os resu.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse.
Agradecimentos
Agradecemos a Corinne A. Fairchild e Katie L. Vermillion, que participaram do desenvolvimento da nossa versão do protocolo de cultura de dobra neural craniana.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| AxioObserver equipado com um cabeçote de varredura confocal LSM710 controlado pelo software ZEN 3.0 SR | Zeiss | Usado alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Óleo DIC M27 objetiva | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Pratos de câmara (fundo de vidro, simples ou dividido) | MatTek; Cell Vis | P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) X000NOK1OJ (Cellvis) | Câmara única 35 mm ou 4 câmaras 35 mm |
| Vidro de cobertura | Carolina Biological Supply Company | 633029, 633031, 633033, 633035, 633037 | círculos, 0.13– 0,17 mm de espessura, disponível em 12-25 mm de diâmetro |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | Alternativa para incubadora de ovos de mídia L15 |
| Sportsman | 1502 | ||
| FBS | Life Technologies | 10437-028 | |
| Fibronectina | Fisher Scientific | CB-40008A | |
| Papel de filtro | Grau Whatman | 3MM cromatografia | |
| Fórceps (rombo) | Fisher Scientific; Thomas Científico | 08-890 (Fisher); 1141W97 (Thomas) | |
| Fórceps (fino) | Ferramentas de Belas Ciências | 11252-20 | Dumont #5 |
| Imagem J | https://fiji.sc/ | Software gratuito de análise de imagem | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| L15 mídia | Invitrogen | 11415064 | |
| L-glutamina | Invitrogen | 25030 | |
| Mídia de montagem (Vectashield ou ProLong Gold) | Vector Laboratories; Thermofisher Scientific | H-1700 (Vectashield); P36930 (ProLong Gold) | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Paraformaldeído | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicilina/estreptomicina | Life Technologies | 15140-148 | 10.000 unidades/mL de penicilina; 10.000 mg/mL de estreptomicina |
| Placas de Petri | VWR (ou similar) | 60 mm, 100 mm | |
| Faloidina | Sigma-Aldrich | P1951 | vários fluróforos disponíveis |
| Suporte de pino | Ferramentas de Ciência Fina | 26016-12 | Para agulha de tungstênio (alternativa para tesoura de mola) |
| Tesoura (dissecação) | Ferramentas de Ciência Fina | 14061-10 | |
| Tesoura de Mola | Ferramentas de Ciência | Fina15000-08 | Borda de corte de 2,5 mm (alternativa para agulha de tungstênio) |
| Sylgard | Krayden | Sylgard 184 | |
| Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Unidade de Filtro de Seringa Millex-GV, 0,22 µ m, PVDF, 33 mm, esterilizado por gama | |
| Placas de cultura de tecidos | Sarstedt | 83-3900 Placas de | cultura de 35 mm para culturas de dobras neurais a granel |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Fio de tungstênio | Variedade de fontes | 0,01" de diâmetro para agulha de tungstênio (alternativa para tesouras de mola) |
Referências
- Pla, P., Monsoro-Burq, A. H. The neural border: Induction, specification and maturation of the territory that generates neural crest cells. Developmental Biology. 444, 36-46 (2018).
- Tang, W., Bronner, M. E. Neural crest lineage analy....
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Reimpressões e permissões
