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Artigo de método

Injeções intravítreas no olho ovino

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⸱

DOI:

10.3791/63823

⸱

5 de julho de 2022

 , 
1Faculty of Agriculture and Life Sciences, Lincoln University

Neste artigo

Resumo

Injeções intravítreas foram realizadas no olho de ovelha com o objetivo de fornecer terapia gênica mediada por vírus para a retina.

Resumo

Existem vários métodos para a entrega de agentes terapêuticos à retina, incluindo administração intravítrea (IVT), sub-retiniana, supracoroidal, periocular ou tópica. A administração da droga IVT envolve uma injeção no humor vítreo do olho, uma substância gelatinosa que preenche a câmara posterior do olho e mantém a forma do globo ocular. Embora a via IVT seja menos especificamente direcionada do que o parto sub-retiniano, é muito menos invasiva e é amplamente utilizada em ambientes clínicos para uma série de doenças oculares.

Demonstramos anteriormente a eficácia da entrega intravítrea de um produto de terapia gênica mediado por vírus adenoassociado (AAV) (AAV9. CLN5) em ovinos com uma forma natural de CLN5 de lipofuscinose ceróide neuronal (NCL). As ovelhas afetadas receberam terapia genética IVT em um olho, com o outro olho não tratado servindo como um controle interno. A estrutura e a função da retina foram mantidas no olho tratado até 15 meses após o tratamento, enquanto o olho não tratado apresentou função progressivamente declinante e atrofia grave durante o exame post-mortem. Com base nos estudos com ovelhas, o produto de terapia genética CLN5 foi liberado como um candidato a novo medicamento experimental (IND) pela Food and Drug Administration dos Estados Unidos em setembro de 2021. Este trabalho detalha o protocolo cirúrgico para a entrega de TVI de um vetor viral terapêutico ao olho ovino.

Introdução

Vários métodos podem ser usados para fornecer agentes terapêuticos à retina, incluindo administração intravítrea (IVT), sub-retiniana, supracoroidal, periocular ou tópica. Cada via de administração envolve a superação de barreiras como a barreira sangue-retina ou as membranas limitantes internas e externas e tem taxas variadas de eficácia dependendo do fármaco a ser administrado e do alvo específico da retina 1,2.

A administração da droga IVT envolve uma injeção no humor vítreo do olho, uma substância gelatinosa que ocupa a câmara posterior do olho. A principal função do humor vítreo é manter a forma do globo ocular e manter os tecidos oculares, como a lente e a retina, no lugar. O humor vítreo é composto em grande parte de água, com pequenas quantidades de colágeno, ácido hialurônico e outras proteínas não colágenas3. A injeção de TVI é um procedimento simples e comum usado rotineiramente para tratar uma ampla gama de condições oculares, incluindo degeneração macular relacionada à idade, edema macular diabético, retinopatia diabética, oclusão da veia retiniana e várias distrofias hereditárias da retina 4,5.

Lipofuscinoses ceroides neuronais (NCL; Doença de Batten) é um grupo de doenças fatais de armazenamento lisossômico que causam degeneração grave do cérebro e da retina. Atualmente, existem 13 variantes conhecidas de NCL resultantes de mutações em diferentes genes (CLN1-8, CLN10-14) que afetam predominantemente crianças, mas têm idades variadas de início e gravidade da doença6. As NCLs compartilham sintomas progressivos comuns, incluindo declínio cognitivo e motor, convulsões e perda de visão. Não há cura para a NCL; no entanto, a terapia de reposição enzimática dirigida pelo cérebro está atualmente em ensaios clínicos para a doença CLN27,8, e a terapia gênica mediada por AAV tem se mostrado grande promessa em estudos pré-clínicos, com um ensaio clínico para a terapia gênica CLN5 esperado para começar em 2022 9,10.

Muitas outras espécies desenvolvem formas naturais de NCL, incluindo gatos, cães, ovelhas e vacas. Dois modelos ovinos de NCL estão atualmente em estudo ativo na Nova Zelândia: um modelo de doença CLN5 em ovinos de Borderdale e um modelo de doença CLN6 em ovinos de South Hampshire. Os ovinos afetados apresentam muitas das características clínicas e patológicas da doença humana, incluindo atrofia retiniana e perda de visão10,11. Embora a terapia gênica CLN5 dirigida pelo cérebro em ovinos com doença CLN5 possa prevenir ou deter a atrofia cerebral e o declínio clínico, as ovelhas tratadas ainda perdem a visão9. Isso evidenciou a necessidade de tratar a retina para preservar a visão e manter uma melhor qualidade de vida, levando ao estabelecimento de um protocolo de terapia gênica ocular em ovinos.

O olho de ovelha representa um bom modelo do olho humano devido à sua semelhança nas dimensões do globo ocular, volume vítreo e estrutura da retina10,12,13. Este trabalho detalha o protocolo cirúrgico para a administração de TVI de um pequeno volume (≤100 μL) de vetor viral terapêutico ao olho ovino.

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Protocolo

Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo comitê de Ética Animal da Universidade Lincoln e estão de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA para o cuidado e uso de animais em pesquisa e com a Lei de Bem-Estar Animal da Nova Zelândia (1999). As ovelhas Borderdale foram diagnosticadas ao nascer14 e mantidas em fazendas de pesquisa da Universidade Lincoln. Três ovelhas homozigotas (CLN5-/-) de 3 meses de idade receberam uma única injeção de TVI no olho esquerdo, com o olho direito não tratado atuando como um controle interno. Os dados de eletrorretinografia e patologia foram comparados com os dados históricos de controle saudável e afetado. O vetor viral utilizado neste estudo foi um sorotipo 9 de vírus adenoassociado autocomplementar, contendo o promotor de ação beta de frango (CBh) e o ovino CLN5 otimizado para códons (scAAV9/CBh-oCLN5opt). O vetor viral foi fornecido pelo University of North Carolina Vector Core, NC, EUA.

1. Pré-cirurgia

  1. Autoclave o kit cirúrgico (Figura 1).
  2. Jejue as ovelhas por 24 h antes da cirurgia.
  3. Registre pesos vivos antes da cirurgia.

figure-protocol-1
Figura 1: Kit de cirurgia intravítrea. Os instrumentos necessários para a cirurgia de TVI incluem (1) um espéculo para manter as pálpebras abertas e (2) um par de pinças de nariz curvo para agarrar a conjuntiva bulbar e girar o olho. (3) Um hemostato de nariz reto também é incluído como um instrumento alternativo para segurar a conjuntiva bulbar e manter o olho no lugar se ele tiver revertido para a órbita do olho. Este kit é autoclavado antes da cirurgia. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Procedimento cirúrgico

  1. Restrinja o animal e, usando cortadores eletrônicos, raspe a lã de um lado do pescoço sobre a veia jugular.
  2. Ocluir a veia jugular aplicando pressão na base do sulco jugular e visualizar a veia levantada.
  3. Recolher a quantidade adequada de diazepam (0,3 mg/kg) e cetamina (7,5 mg/kg) numa seringa estéril e colocar uma agulha estéril de 20 G. Insira a agulha na veia jugular e retire suavemente o êmbolo para garantir que o sangue entre no cubo e a agulha esteja dentro da veia. Uma vez confirmado, induzir através de administração intravenosa (jugular).
  4. Imediatamente após a indução, coloque o animal em decúbito dorsal, estenda o pescoço e segure a língua para cima e para frente, usando um laringoscópio para visualizar a laringe. Realizar a intubação endotraqueal inserindo suavemente um tubo endotraqueal (tamanho 6,0-9,0, dependendo do tamanho da ovelha) entre as cordas vocais quando o animal expirar. Inflar o manguito endotraqueal imediatamente e prender o tubo com uma gravata ao redor da mandíbula inferior. Confirme o fluxo de ar através do tubo.
  5. Transfira o ovino para a mesa cirúrgica e coloque-o em decúbito lateral.
  6. Conecte imediatamente o tubo endotraqueal às mangueiras da máquina anestésica para a entrega de isoflurano em oxigênio a 100%. Inicialmente comece com 3%-4% de isoflurano e, em seguida, reduza para 2%-3% para manutenção. Observe a ventilação espontânea dos ovinos.
  7. Monitore a frequência cardíaca (pulso), a frequência respiratória, a saturação de oxigênio, os níveis de CO2 no final da maré e a temperatura corporal retal durante todo o procedimento. Veja a Tabela 1 para valores fisiológicos para esses parâmetros em ovinos anestesiados (variável, mas uso como orientação).
  8. Coloque uma cortina grande, estéril e quadrada em um carrinho cirúrgico, seguido pelos instrumentos estéreis.
  9. Posicione uma cortina cirúrgica estéril e fenestrada sobre o olho a ser injetado.
  10. Desinfete assepticamente o olho usando uma seringa estéril de 20 mL para irrigar o olho com solução de iodopovidona a 1-5%.
  11. Aplicar 1-2 gotas de Alcaine 0,5% W/V solução oftálmica, como um anestésico local, para o olho.
  12. Encaixe um espéculo ocular Nopa Barraquer-Colibri (10 mm) nas pálpebras para manter o olho aberto.
  13. Segure a conjuntiva bulbar na face dorsolateral do olho com fórceps e gire o globo ocular ventromedialmente.
ConscienteAnestesiadoPonto crítico de intervenção recomendado
Frequência cardíaca (batimentos/min)50-80 (repouso) a 280 (ativo)50-80<50, >100
Frequência respiratória (respirações/min)15-40 (descanso) a 350 (superaquecido)10-30<8, >40
Saturação de oxigênio (mm Hg)95-10098-100<90
CO2 da maré final (mm Hg)35-4535-45>55
Temperatura corporal (°C)38.5-39.538.5-39.536 < de >40

Tabela 1: Valores fisiológicos dos parâmetros a serem monitorados em ovinos anestesiados.

3. Preparação viral

  1. Armazenar alíquotas vetoriais AAV a -80 °C até o uso.
  2. No dia da cirurgia, descongele o número necessário de frascos para entrega de IVT no gelo.
  3. Imediatamente antes da administração, o vórtice da alíquota do vetor viral e centrifugar a 400 × g por 10 s para coletar o conteúdo.
  4. Diluir cada alíquota do vetor viral em solução salina tamponada com fosfato (PBS) filtrada estéril 1x para a dose desejada em um volume final de 100 μL. Prepare diluições vetoriais em um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL de baixa ligação a proteínas usando pontas de pipeta de filtro estéreis. Eliminar todos os consumíveis que tenham estado em contacto com o vector viral em solução desinfetante (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: Na publicação original15 a dose do agente terapêutico (AAV9. CLN5) foi de 1,9 x 1010 genomas virais. A dosagem recomendada irá variar dependendo do agente terapêutico que está sendo administrado; portanto, uma dosagem não foi incluída no protocolo padrão aqui apresentado.
  5. Retirar todos os 100 μL da preparação do vetor AAV para uma seringa estéril de 1 ml com um 28 G x 1/2 permanentemente ligado em agulha para injeção imediata. Certifique-se de que o período de tempo entre a preparação e a injeção é inferior a 2 minutos.

4. Administração viral

  1. Inserir a agulha aproximadamente 7 mm posterior à esclera na face lateral do olho e inclinada posteriormente para evitar o cristalino (Figura 2 e Figura 3). Administrar a injeção única de 100 μL em bolus o mais próximo possível da retina sem perturbar a superfície da retina.
  2. Enxaguar o olho com aproximadamente 10-15 mL de solução de iodopovidona a 1-5%, seguido de 10 mL de solução salina antes da remoção do espéculo e da cortina.
  3. Vire as ovelhas e repita com o outro olho, se necessário.

figure-protocol-2
Figura 2: Rotação ventromedial do globo ocular . (A) Segure a conjuntiva bulbar com pinça não dentada e (B) gire ventromedialmente (ou seja, para baixo e em direção ao focinho) para expor a superfície dorsolateral do olho para injeção. Abreviaturas: V = ventral, D = dorsal, M = medial, L = lateral. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-protocol-3
Figura 3: Localização e profundidade da injeção. A agulha é injetada no aspecto dorsolateral do globo ocular e todo o comprimento do eixo da agulha (0,5 pol/12,7 mm) é inserido no olho. Observe o ângulo da agulha em direção à parte posterior do olho para evitar a lente e injete o mais próximo possível da retina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Manejo pós-operatório

  1. Após a conclusão do procedimento, pare a anestesia por inalação de gás isoflurano, lave a linha com oxigênio a 100%, desconecte a mangueira do tubo endotraqueal e transfira as ovelhas para a sala de recuperação.
  2. Coloque as ovelhas em decúbito esternal, com as pernas dobradas por baixo, e monitore até a recuperação completa. Certifique-se de que a boca do animal esteja livre de quaisquer obstruções.
  3. Quando o reflexo de deglutição for observado, esvazie parcialmente o manguito do tubo endotraqueal e remova suavemente o tubo da boca.
  4. Administrar um anti-inflamatório não esteroidal intramuscular no músculo bíceps femoral do membro posterior, antibióticos subcutâneos no lado do pescoço ou atrás do ombro e colírios de cloranfenicol a 0,5% na superfície do globo ocular.
  5. Forneça água e comida (pellets de luzerna e palha) uma vez que as ovelhas possam ficar desassistidas.
  6. Administrar 0,5% cloranfenicol colírio 2-3 por dia durante 7 dias após a cirurgia.
  7. Mantenha as ovelhas dentro de casa durante a noite antes de retornar ao piquete ao ar livre aproximadamente 24 horas após a cirurgia.
  8. Registre as temperaturas retais diariamente por 3 semanas. Monitore quaisquer alterações no pulso ou na frequência respiratória, consumo de alimentos, neurocomportamento, temperatura corporal, peso, postura, saúde ocular e sinais clínicos de problemas de saúde. Procure tratamento veterinário adequado se houver indícios de eventos adversos.

6. Avaliação da eficácia in vivo

  1. Se o objetivo da injeção de TVI for preservar a visão, monitore a eficácia in vivo por métodos como o teste de labirinto ou eletrorretinografia (ERG) para avaliar a função celular da retina ou a tomografia de coerência óptica (OCT) para avaliar a estrutura da retina.
    NOTA: Essas medidas de eficácia têm sido bem descritas após a terapia gênica comTVI 11,15,16.

7. Análise de tecido post-mortem

  1. Realizar a eutanásia de ovinos por um método aprovado em um desfecho apropriado após a cirurgia de injeção intravítrea.
    NOTA: Métodos de eutanásia sugeridos, como medicamentos veterinários intravenosos para eutanásia ou um parafuso cativo penetrante na coluna cervical seguido de exsanguinação rápida, são detalhados em outros lugares15,16.
  2. Colha globos oculares de ovelha usando tesouras curvas cirúrgicas afiadas/contundentes. Corte o canto lateral e medial para aumentar a abertura da cavidade ocular e, em seguida, corte sistematicamente as dobras conjuntivais, o tecido conjuntivo, os músculos e o nervo óptico para liberar o globo ocular da órbita.
  3. Imersão-fixação de globos oculares enucleados intactos em formalina a 10% por 2 h, seguida de pós-fixação em solução de Bouin por 4 h, fazendo um pequeno corte (0,5 cm) na esclera para permitir perfusão suficiente. Alternativamente, a imersão fixa os globos oculares na solução de Davidson por 48 h.
  4. Processe seções do tecido ocular através da incorporação e seccionamento de cera de parafina de rotina a 3-5 μm.
    NOTA: Procedimentos de coloração por coloração de hematoxilina e eosina (H&E) e análise imuno-histoquímica já foram descritos anteriormente15,16.
  5. Avalie a eficácia no tecido post-mortem por medidas como espessura total da retina, espessura da camada da retina, contagens de fileiras celulares da camada nuclear externa e coloração imuno-histoquímica para tipos de células da retina, glia da retina ou proteínas de interesse.
    NOTA: Para protocolos para essas análises, ver publicações anteriores15,16.

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Resultados

A eficácia da administração de IVT de um vetor de terapia gênica CLN5 na atenuação da disfunção e degeneração da retina em ovinos com CLN5 NCL já foi demonstrada anteriormente por este grupo de pesquisa15. Os ovinos afetados receberam uma única injeção de 100 μL de TVI de CLN5 embalado em um vetor AAV sorotipo 9 (AAV9) (AAV9). CLN5) em um olho, com o olho contralateral servindo como um controle interno não tratado. A visão foi avaliada mensalmente desde a idade na injeção (3 meses) até a doença em...

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Discussão

As injeções intravítreas são um dos procedimentos cirúrgicos mais comuns na oftalmologia humana e provaram ser eficazes na administração de terapias genéticas mediadas por AAV para a retina de ovinos. Já havíamos demonstrado anteriormente a eficácia do AAV9. A terapia gênica com CLN5 foi administrada intravitrealmente na atenuação da disfunção e degeneração da retina em ovinos com CLN5 NCL15. Espera-se que a tradução desta via de administração para pacientes humanos com NCL também se mostre benéfi...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Steve Heap (BVSc, CertVOphthal) por sua assistência no estabelecimento desse protocolo e na realização das injeções descritas por Murray et al.15. Os autores também reconhecem o financiamento da CureKids New Zealand, da Canterbury Medical Research Foundation, da Neurogene Inc e da Batten Disease Support and Research Association.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Seringa de segurança de baixo espaço morto de 1 mL com agulha permanentemente anexada de 0,5 polegadaFisher Scientific, Auckland, Nova Zelândia05-561-28Seringa de segurança Covidien Monoject Tuberculin ou tubo de
microcentrífuga similar de 1,5 mL Tubos de autoclaveSigma AldrichHS4323para esterilizar antes do uso Máquina de
anestesia com banco de gás e monitor Hyvet Anestesia, Christchurch, Nova Zelândia
Colírio antibióticoTeva Pharma Ltd, Auckland, Nova ZelândiaNome comercial: Chlorafast (0,5% cloranfenicol)
BrightMount plus meio de montagem anti-desbotamentoAbcam, Cambridge, Reino Unidoab103748
DAPI (4′ ,6-diamidino-2-fenilindol dicloridrato)Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos10236276001
SedativoDiazepamIlium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, Nova Zelândia5 mg / mL
Tubos endotraqueaisFlexicare Medical Ltd, Mountain Ash, Reino UnidoPadrão, algemados. Tamanhos 7, 7.5, ou 8 dependendo do tamanho da ovelha
Espéculo ocularCapes Medical Ltd, Tauranga, Nova ZelândiaKP151/14Nopa Barraquer-Colibri (10 mm)
Campo cirúrgico fenestradoAmtech Medical Ltd, Whanganui, Nova ZelândiaDI583Ou similar 
Dicas de FiltroInterlab, Auckland, Nova Zelândia10, 200 e 1.000 µ L 
Solução de formaldeído (37%)Fisher Scientific, Auckland, Nova ZelândiaAJA809-2.5PLFaça até 10% em água destilada com 0.9% de NaCl
Anti-coelho de cabra Alexa Fluor 594Invitrogen Carlsbad, CA, EUA&nbsp; A-11012Uso na diluição de 1:500
Anestésico IsofluranoAttane, Bayer Animal Health, Auckland, Nova Zelândia
Anestésico/analgésico Cetamina HClPhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, Nova ZelândiaLaringoscópio 100 mg/mL
(veterinário)KaWe Medical, DinamarcaLâmina Miller C, tamanho 2
Agulhas Capes Medical Ltd, Tauranga, Nova Zelândia302025BD Agulhas hipodérmicas, ou similar
Anti-inflamatório não esteróideBoehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, Nova Zelândia49402/008Nome comercial: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam)
Pinça não dentadaCapes Medical Ltd, Tauranga, Nova ZelândiaAB864/16Ou similar 
Hemostático não dentadoCapes Medical Ltd, Tauranga, Nova ZelândiaAA150/12Ou similar 
Soro de cabra normalThermo Fisher Scientific, Christchurch, Nova Zelândia16210072
Oxigênio (médico)BOC Gas, Christchurch, Nova ZelândiaCilindro D2, código de gás 180
Fosfato tampolado salino Thermo Fisher Scientific, Christchurch, Nova Zelândia10010023estéril e filtrada
iodopovidonaCapes Medical Ltd, Tauranga, Nova Zelândia005835Nome comercial: Betadine (10% de iodopovidona)
Proteína ácida fibrilar glial anti-vaca de coelho (GFAP)Dako, Glostrup, DinamarcaZ0334Use na diluição de 1: 2.500
Sorotipo 9 de vírus adeno-associado auto-complementar, contendo o promotor de ação beta de frango (CBh) e CLN5 ovino otimizado para códonUniversity of North Carolina Vector Core, NC, EUA.scAAV9/CBh-oCLN5opt
Solução IV de Cloreto de Sódio 0,9%Capes Medical Ltd, Tauranga, Nova ZelândiaAHB1322Nome comercial: Solução salina
Antibióticos subcutâneosIntervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, Nova ZelândiaNome comercial: Duplocilina LA (150.000 UI/mL de penicilina procaína e 115.000 UI/mL de penicilina benzatina)
Tesoura cirúrgica afiada e curvada sem corte Capes Medical Ltd, Tauranga, Nova ZelândiaSSSHBLC130
Seringa Terumo Luer LockAmtech Medical Ltd, Whanganui, Nova ZelândiaSH159/SH160Seringas estéreis; 10 mL para a preparação de medicamentos de indução, 20 mL para a preparação de solução salina
Virkon Disinfectant PowderEBOS Group Ltd, Christchurch, Nova Zelândia28461115
Solução de

Referências

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