Summary
このプロトコルは、初代マウス肝細胞を肝臓から単離し、CRISPR-Cas9をリボヌクレオタンパク質およびmRNAとしてエレクトロポレーションして、肝臓の遺伝性代謝疾患に関連する治療標的遺伝子を破壊する技術について記載している。記載された方法は、エレクトロポレーション後に高い生存率および高レベルの遺伝子改変をもたらす。
Abstract
このプロトコルは、初代マウス肝細胞を単離し、続いてCRISPR-Cas9をリボヌクレオタンパク質(RNP)およびmRNAとしてエレクトロポレーション媒介送達するための迅速かつ効果的な方法を記載している。初代マウス肝細胞を3段階逆行性灌流法を用いて単離し、肝臓あたり最大50×106 細胞の高収率および>85%の細胞生存率をもたらした。このプロトコルは、肝細胞のプレーティング、染色、および培養に関する詳細な手順を提供します。この結果は、エレクトロポレーションが緑色蛍光タンパク質(GFP)陽性細胞の割合およびマウス肝細胞における>35%の適度な細胞生存率によって測定されるように、89%の高いトランスフェクション効率を提供することを示している。
このアプローチの有用性を実証するために、ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ遺伝子を標的とするCRISPR-Cas9を、肝臓の遺伝性代謝疾患(IMD)に関連する治療遺伝子を破壊するための原理実証遺伝子編集として初代マウス肝細胞にエレクトロポレーションした。mRNAによる47%の編集効率と比較して、RNPでは78%の高いオンターゲット編集が観察された。肝細胞の機能性を、RNPおよびmRNAとしてCRISPR-Cas9を送達することが初代マウス肝細胞において同等の細胞生存率をもたらすことを示したアルブミンアッセイを用いてイン ビトロ で評価した。このプロトコルの有望な用途は、肝臓に影響を及ぼすヒト遺伝性疾患のマウスモデルの生成である。
Introduction
肝臓のIMDは、毒性代謝産物の蓄積につながる代謝に関与する重要な肝酵素の欠乏を特徴とする遺伝性疾患である。治療がなければ、肝臓のIMDは臓器不全または早期死亡をもたらす1,2。肝臓のIMDを有する患者のための唯一の治癒的選択肢は、ドナー臓器の可用性が低いため、および手順3,4に続く免疫抑制療法による合併症のために制限されている同所性肝移植である。臓器調達移植ネットワークが収集した最近のデータによると、肝移植待機リストに載っている成人患者の40%〜46%のみが臓器を受けており、これらの患者の12.3%が待機リストで死亡しています5。さらに、すべてのまれな肝疾患のわずか5%がFDA承認の治療を受けています6。肝臓のIMDに対する新規治療が決定的に必要であることは明らかです。しかし、新しい治療選択肢を開発するには、適切な疾患モデルが必要です。
インビトロおよびインビボシステムを使用してヒト疾患をモデル化することは、効果的な治療法を開発し、肝臓のIMDの病理を研究するための障害であり続けている。まれな肝疾患を有する患者からの肝細胞は、7を得ることが困難である。動物モデルは、疾患病理学の理解を深め、治療戦略をテストするために不可欠です。しかし、1つの障害は、致命的な変異を持つ胚からモデルを生成することです。例えば、Jag1遺伝子の5'末端付近に5kb配列のホモ接合型欠失を含む胚を有するアラギル症候群(ALGS)のマウスモデルを作成しようとする試みは、胚の早期死をもたらした8。さらに、胚性幹細胞における遺伝子編集によるマウスモデルの生成は、時間とリソースを大量に消費する可能性がある9。最後に、突然変異は標的組織の外側に現れ、交絡変数をもたらし、疾患の研究を妨げる可能性がある9。体細胞遺伝子編集は、肝臓組織における編集を容易にし、胚性幹細胞を用いたモデル生成に関連する課題を迂回するであろう。
エレクトロポレーションは、高電圧電流を印加して細胞膜を透過させることにより、CRISPR-Cas9を核に直接送達することを可能にし、ヒト胚性幹細胞、多能性幹細胞、ニューロンなどのトランスフェクション技術に非妥協的なものを含む多くの細胞型と適合性である10,11,12.しかし、低い生存率はエレクトロポレーションの潜在的な欠点である。手順を最適化すると、毒性を制限しながら高レベルの送達をもたらすことができます13。最近の研究は、非常に効率的なアプローチとして、CRISPR-Cas9成分を初代マウスおよびヒト肝細胞にエレクトロポレーションすることの実現可能性を実証している14。肝細胞におけるエクスビボエレクトロポレーションは、肝臓のヒトIMDsのための新しいマウスモデルを生成するために適用される可能性を有する。
このプロトコルは、肝臓からマウス肝細胞を単離し、続いてCRISPR-Cas9を、Cas9タンパク質と合成シングルガイドRNA(sgRNA)、またはCas9 mRNAとsgRNAを組み合わせて高レベルのオンターゲット遺伝子編集を得るためのRNP複合体としてエレクトロポレーションするための詳細なステップバイステップ手順を提供します。さらに、このプロトコルは、新たに単離されたマウス肝細胞へのCRISPR-Cas9のエレクトロポレーション後の遺伝子編集効率、生存率、および機能性を定量する方法を提供する。
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Protocol
動物実験はすべて、クレムソン大学で承認された動物ケアおよび使用委員会のガイドラインおよび承認されたプロトコルに準拠して実施された。外科的処置は、麻酔をかけた野生型C57BL/6Jマウスにおいて、生後8〜10週齢の間に実施された。
1. 動物手術
- 溶液および器具の調製
注:灌流溶液および麻酔カクテルレシピは、 材料表に示されています。- 灌流溶液1(HEPES、EGTA、およびEBSS)、灌流溶液2(HEPES、EGTA、EBSS、CaCl 2、およびMgSO4)、および灌流溶液3(溶液2およびリベラーゼ)を調製する。解決策がよく混在していることを確認してください。
- 手順を開始する前に、ウォーターバスを42°Cに設定し、灌流ソリューション1、2、および3を最低30分間予温し、ウォーターバスに保管してください。
注:灌流溶液1および2はカルシウムをキレートし、肝臓の血液を洗い流します。灌流液3は、細胞外マトリックスを解離させる消化酵素リベラーゼを含有する。 - 150mLのDMEM + 10%ウシ胎児血清(FBS)を円錐管に入れ、氷の上に置きます。
注:この培地は、肝臓カプセルから細胞を放出し、それぞれステップ2.1および2.2で単離された肝細胞を洗浄するために使用されます。 - 遠心分離機を4°Cに設定する。
- 70%エタノールで満たされたフラスコにチューブの両端を置き、エタノールを3回循環させて、ポンプチューブを滅菌する。
- チューブを蒸留水で洗って空にします。
- チューブを予温した30mLの灌流溶液1で満たし、続いて8mLの灌流溶液2で満たします。チューブにまだより多くの流体を入れるスペースがある場合は、チューブの残りの部分に灌流溶液3を満たします。チューブに気泡を導入しないように、別の灌流溶液に切り替えるときにポンプを停止します。
- 余分なチューブを42°Cのウォーターバスに入れて、灌流溶液を暖かく保ちます。
- ポンプチューブの端部を灌流液3の入った円錐管に入れ、水浴中に保管したままにする。
注:このステップは、灌流中にポンプが灌流溶液3を連続的に充填できるようにするために必要です。
- 動物の準備
- 麻酔薬カクテルを10-11.7μL/g体重の用量で腹腔内に注射することによってマウスを麻酔する。麻酔カクテルの最終濃度は、7.5 mg/mL ケタミン、0.25 mg/mL アセプロマジン、1.5 mg/mL キシラジンです。
- マウスの呼吸を監視し、マウスが痛みに反応していないことを確認します。マウスが毎分〜55〜65回の呼吸数を持ち、つま先をつまんでも反応せず、弛緩した尾を持つまで待ちます。さらに、閉じた目の内側の皮膚に軽く触れて、眼瞼(まばたき)反射を確認してください。マウスがまばたきをしたり、目の筋肉がけいれんしたりする場合は、麻酔カクテル全体の用量を5〜10μL増やしてください。
- マウスを仰臥位に置き、ピンまたはテープを使用して四肢を表面に固定します(補足図S1)。
- 腹部に70%エタノールを噴霧し、綿球で拭き取って乾かします。
- 肝臓灌流
- はさみを使って腹部の皮膚にU字型の横切開を行い、側面を通して穴を広げます。
- 引き続き皮膚を胸郭に開放する。
- はさみを使用して、腹膜を切り取って腹腔を胸郭まで露出させ、臓器を傷つけないように注意してください。鉗子の裏側またははさみの鈍い表面を使用して腸を右側に動かします。下大静脈と門脈を特定する(補足図S1)。
- ポンプを起動して、予温された灌流溶液をカテーテルを通して洗い流す。
- ポンプを停止し、すべての空気がシステムを通して洗い流されたら、カテーテルを取り外します。カテーテルに接続された針の先端を静脈に対して10°-20°の角度で下大静脈に挿入します。カテーテルから針を取り外し、静脈に平行な動きでカテーテルを静脈に静かに押し込みます。
注:ユーザーは、静脈内の適切なカニューレを確認するために、カテーテル内の血液のフラッシュバックを観察する必要があります。 - カテーテルを静脈内にさらに移動させることなく、チューブをカテーテルに接続します。
- 2 mL/分の流量でポンプを起動します。灌流が成功したという兆候として、すぐに青白くなる肝臓を探してください。
- はさみで門脈を切ってください。
- 徐々に流量を5mL/minに増やします。
- おおよその切断部位の門脈に定期的に圧力をかけ、鉗子または綿棒を使用して排水を遮断し、良好な灌流を促進する。
- 灌流溶液3が流れたら、肝臓の弾力性を注意深く監視する。肝臓が柔らかくなっているかどうかを判断するには、綿棒または鉗子で肝臓を静かに押し、肝臓にくぼみが形成されているかどうかを確認します。細胞生存率の損失を避けるために、過剰に灌流しないように注意してください。
- 肝臓が柔らかくなったら(30〜50mLの灌流溶液3が流れた後に起こる)、ポンプを停止し、カテーテルを取り外し、肝臓を慎重に解剖する。氷冷DMEM + 10%FBS培地を含む100mmペトリ皿に肝臓を置きます。胆嚢を切除し、その内容物をこぼさないように注意してください。ペトリ皿を渦巻いて、血栓の可能性を優しく取り除きます。
- 肝臓を氷冷DMEM+10%FBS培地を含む新しいシャーレに移す。
2. 肝細胞単離
- 肝臓カプセルから細胞を放出する。
- ペトリ皿を氷の上に置き、2対の滅菌鉗子を使用して、すべての葉の肝臓カプセルを静かに引き裂きます。セルリフターまたは鉗子を使用して培地中の肝臓を静かに旋回させ、肝細胞を放出する。肝臓が非常に小さくなり、懸濁液が茶色と不透明になるまでこの動きを続けます。
- プレートから肝臓組織の残骸を取り出し、低速に設定した25 mL血清学的ピペットを使用して、細胞懸濁液を100 μmの細胞ストレーナーを取り付けた50 mL円錐管(氷上で予冷)に慎重に移します。
- 新鮮な氷冷DMEM + 10%FBS培地をシャーレに加え、洗い流して残りの細胞を表面から集め、50mL円錐管に移します。すべてのセルが収集されるまで、この手順を繰り返します。
- 非実質細胞から肝細胞を洗浄し、精製する。
- 50 mL 円錐管に集めた細胞を 4 °C で 50 × g で、低減速時またはブレーキなしで 5 分間遠心分離します。
- 破片および非実質細胞を含む上清を捨て、チューブを穏やかに旋回させてペレットを残りの上清に再懸濁する。ペレットが再懸濁された後、30mLの新鮮な氷冷DMEM+10%FBS培地を加える。
- 遠心分離(ステップ2.2.1)と洗浄(ステップ2.2.3)を3回繰り返します。
- 最終細胞ペレットを10mLの氷冷DMEM+10%FBS培地に再懸濁する。
注: ペレットの再懸濁に使用される培地の量は、ペレットのサイズによって異なります。ペレットが15mmよりかなり小さい場合は、1〜5mLの氷冷DMEM + 10%FBS培地を使用してください。
- 細胞生存率定量
- マイクロフュージチューブに、350 μLの肝細胞めっき培地(PM)に50 μLの0.4%トリパンブルー溶液を加えます。次に、100 μLの細胞懸濁液を加えて最終的な1:5希釈を行い、ピペットを複数回上下させて混合します。
- 細胞密度および生存率を計数するには血球計数器を用いた。カウント中は、肝細胞懸濁液を氷の上に置き、次に氷バケツを30rpmに設定したオービタルシェーカーの上に置き、肝細胞が沈降しないようにします。
- 細胞生存率が<70%の場合は、以下のPercoll処理および遠心分離手順に従います。
- パーコールを10倍のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で9:1の比率で希釈します。
- 肝細胞懸濁液を希釈したPercollと1:1の比率で混合する。
- 4°Cで200× g で10分間遠心分離する。
- 死細胞を含む上清を捨てる。ペレットを氷冷DMEM+10%FBS培地に再懸濁する。
- セルをもう一度数えます。
- 肝細胞のプレート形成性の試験
- 1.5 mLの予温PMを用いて、コラーゲンIコート6ウェルプレート上の細胞の一部を1mLあたり0.5×106 細胞の密度でプレートする。
- 残りの細胞を氷上に保ち、エレクトロポレーションを行う準備ができるまで、オービタルシェーカー上にいます。
- 細胞のプレートを37°Cのウォータージャケット付きCO2 インキュベーターに置き、プレートを水平および垂直に水平および垂直に北から南および東西の動きで静かに動かして、均質なめっきを確保します。この動きを1.5時間ごとにさらに2回繰り返します。
- めっき後3時間で細胞が付着したことを確認します。
注:細胞の少なくとも60%は、良質の肝細胞の指標としてプレートに接着する必要があります。 - 培地をプレーティング後24時間で予め加温した肝細胞維持培地(MM)に変更し、培養中の細胞を維持した。
- グリコーゲン染色
- 細胞が6ウェルコラーゲンIコートプレートに付着した後、培養細胞から使用済み培地を除去する。
- 細胞を氷冷エタノールで10〜15分間固定する。
- 滅菌水でよく洗ってください。
- 1%過ヨウ素酸水溶液中で5分間インキュベートした後、滅菌水で洗浄する。
- 100%シッフ試薬中で30分間インキュベートする。
注:シッフ試薬は、細胞に添加する前に希釈してはなりません。 - 10分間かけて水で3回洗う。
- マウント媒体に取り付けます。
- 明視野設定上の顕微鏡を用いた画像。
3. CRISPR-Cas9遺伝子編集のためのsgRNAの設計
注:このセクションでは、マウスヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ(Hpd)遺伝子を標的とするsgRNAの設計を、肝臓のIMDに関連する治療標的遺伝子を破壊するための原理実証遺伝子編集として説明します。
- 参照ソフトウェア15を用いてHpdを標的とするガイド配列を設計する。
- Ensembl ゲノムブラウザで hpd の配列を確認します。
- gRNAの設計には、20ヌクレオチドの単一ガイド長およびNGG(Nは任意のヌクレオチドであり得る)プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列のパラメータを使用する。
- Hpd のエクソン 3 からターゲット領域を選択します。
- オンターゲットスコアとオフターゲットスコアを持つターゲット領域からガイド配列のリストを生成します。
注: オンターゲットスコアは、特定のデザインの予測されたオンターゲット編集効率を示します。スコアが高いほど編集効率が高いほど相関します。オフターゲットスコアはガイドシーケンスの特異性と相関しており、スコアが高いほどオフターゲット編集の確率が低いことを示します。理想的には、両方のスコアが高く、目標値オンスコア>60、オフ目標スコア>50です。 - オンターゲットスコアとオフターゲットスコアが最も高いガイドシーケンスを選択します。ガイド配列を含むsgRNAを化学的に合成した。
4. エレクトロポレーションと細胞培養
- CRISPR-Cas9基質、培地、細胞及びエレクトロポレーション装置の調製
- 付属のサプリメント全体をPMに加え、37°Cの水浴中で10分間温めます。
- 電源ボタンを押してエレクトロポレーション装置の電源を入れ、プログラムT-028が画面に表示されるまでxボタンを押してから下矢印ボタンを押してエレクトロポレーションプログラムを設定します。
- 6ウェルコラーゲンIコートプレートに1.5 mLのPMを添加して、エレクトロポレーション肝細胞のデスティネーションウェルを準備します。プレートを37°Cのインキュベーター内で使用準備ができるまでインキュベートします。
- 付属のサプリメント全体をエレクトロポレーション緩衝液に加え、室温で10分間インキュベートする。
注:バイアルにエレクトロポレーションバッファーの有効期限(サプリメント添加日から3ヶ月後)にラベルを付けます。 - パッケージからエレクトロポレーション容器を取り出し、サンプルごとにラベルを付けます。
- PCRスプリットストリップチューブ内で、30μgのsgRNAと300pmolのCas9タンパク質を組み合わせてCas9 RNP複合体を調製し、複合体を室温で10分間インキュベートします。30 μg の sgRNA と 4 μL の Cas9 mRNA(1 μg/μL)を組み合わせて Cas9 mRNA を調製します。mRNA-sgRNAミックスをエレクトロポレーションまで氷上に保管する。1.0 μgのeGFP mRNAを含むチューブを別途用意し、蛍光顕微鏡を用いてエレクトロポレーションの成功を検証した。
- 遠心分離機1.2×106 細胞あたり100× g で4°Cで2分間のエレクトロポレーション反応。
- 細胞ペレットから上清を取り出し、管壁の側面に沿って反応ごとに100μLのエレクトロポレーション溶液を加える。チューブを手で優しく揺らすことによって、肝細胞をエレクトロポレーション溶液に再懸濁する。
- 肝細胞へのCRISPR-Cas9 RNPおよびmRNAのエレクトロポレーション
- 肝細胞がエレクトロポレーション溶液中に均一に分散しているように見えるら、100μLの肝細胞懸濁液をCas9複合体を含むストリップチューブに移す。
注:肝細胞を移すときは、細胞の生存率を維持するために、広口径のピペットチップを使用してください。 - ストリップの内容物をエレクトロポレーション容器によく移す。
- ヌクレオベット容器をエレクトロポレーション装置上のスロットに入れる。 x ボタンを押して肝細胞を電着させます。エレクトロポレーション後、 OKと書かれた画面がデバイスにポップアップするのを待ちます。 x ボタンをもう一度押して容器を取り外します。
- エレクトロポレーションした容器を氷上で15分間インキュベートする。
- 500μLの予温PMをエレクトロポレーション容器に加える。
- エレクトロポレーション反応の300 μLを予温プレート上の各目的地ウェルに移す。
注:エレクトロポレーション反応ごとに2つのデスティネーションウェルがあるはずです。1つのウェルは、遺伝子編集効率を定量化するために使用されます。もう1つのウェルはMTTおよびアルブミンアッセイに使用されます。 - 肝細胞がウェルの中央に蓄積するのを防ぐために、プレートを水平および垂直に北から南へ、東から西の動きで穏やかに動かして細胞を分散させます。プレートが移動している間、プレートがインキュベーターシェルフとの接触を維持していることを確認します。エレクトロポレーションした肝細胞をめっきした後、15分、30分、45分、60分、および90分でこの運動を繰り返す。
- プレートを37°Cで一晩インキュベートする。
- 細胞をプレーティングしてから24時間後に遺伝子編集解析用に指定されたウェルから培地を取り出し、0.25 mg/mLの基底膜マトリックスオーバーレイと交換します。
メモ:冷凍庫に保管する場合は、膜マトリックスを4°Cに移し、解凍します。基底膜マトリックスは10°C以上で固体であるため、基底膜マトリックスが使用できる状態になるまで氷上または4°Cにとどまることが重要です。
- 肝細胞がエレクトロポレーション溶液中に均一に分散しているように見えるら、100μLの肝細胞懸濁液をCas9複合体を含むストリップチューブに移す。
5. MM と混合する膜マトリックスの体積を計算し、最終濃度 0.25 mg/mL を得る
注: 6 ウェルプレートの場合、ウェルあたり 2 mL のオーバーレイが必要です。
6.計算された膜マトリックスの体積を氷冷MMに加え、10回上下にピペッティングして混合する
- 重ね合わせた混合物をゆっくりと細胞の上にピペットで移し、プレートを37°Cのインキュベーターに戻した。
- 24時間ごとに培地を新しいメンテナンス培地と交換します。
- めっき後24時間で、MTTおよびアルブミンアッセイ用に指定されたウェルから馴化培地を移す。アルブミンアッセイを行う準備ができるまで、馴化培地をマイクロフュージチューブに保管する。MTT アッセイのステップ 7.1 に進みます。
メモ: 馴化培地は、短時間保存 (1 日未満) のために 4 °C で保管してください。より長い貯蔵のために、媒体を-80°Cで保存する。
7. エレクトロポレーションマウス肝細胞における送達効率、生存率、オンターゲット編集の解析
- MTTアッセイを用いた生存率測定
- MTTの5mgバイアル1本にPBS1mLを加えて12mM MTTストック溶液を調製する。
- 150 μL の MTT ストック溶液をウェルに加え、24 時間インキュベートします。
- インキュベーション後、1.5 mLのドデシル硫酸ナトリウム塩酸塩(SDS-HCl)溶液を各ウェルに加え、次いでピペットで混合する。
- プレートを37°Cで4時間インキュベートし、培地の色が透明から紫色に変化して生細胞を示すのを探します。
- ピペットを用いて各サンプルを再度混合し、マイクロプレートリーダーを用いて570nmにおける吸光度を読み取る。
- Cas9処理サンプルの正規化生存率をEq(1)を使用して計算します。
(1)
- 肝細胞の機能性を評価するためのアルブミンアッセイ
- 50 μLの馴化培地をアルブミンキットによって提供されるプレート内のウェルに移す。ウェルを覆い、室温で2時間インキュベートする。
- ウェルを 5x を 200 μL の洗浄バッファーで洗浄します。
- プレートを反転させてティッシュペーパーの各ウェルを空にし、数回タップします。
- 洗浄後、アルブミンアッセイキットに付属のビオチン化抗体50 μLを各ウェルに加え、室温で1時間インキュベートする。
- 手順 5.2.2-5.2.3 を繰り返してウェルを洗浄します。
- アルブミンアッセイキットに提供されるストレプトアビジンペルオキシダーゼ50 μLを各ウェルに加え、室温で30分間インキュベートする。
- 手順 5.2.2 を繰り返します。
- アルブミンアッセイキットに提供された色原体基質を1ウェルあたり50μL加え、室温で30分間インキュベートする。プレートを軽く叩いて、均一に混合されるようにします。ピペットチップで気泡を取り除きます。
- 最後に、各ウェルに50 μLの停止溶液を加え、機能的な細胞を示すために黄色から青への色の変化を探します。
- 直ちに進み、マイクロプレートリーダーを用いて450nmにおける吸光度を読み取る。
- eGFP mRNAでエレクトロポレーションしたウェルにおける送達効率を推定する。
- エレクトロポレーション後24時間の肝細胞の位相差および緑色蛍光画像をキャプチャする。井戸内の異なる場所で3つの画像を撮影します。
- セルの画像を ImageJ にアップロードします。[ 画像 ] タブで、[ 16 ビット|種類 ] を選択して、画像をグレースケールに変換します。
- 画像内のセル構造を強調表示するには、[画像] タブで [ |の調整] を選択します。しきい値。スライダーを調整してセルを強調表示します。
- [ プロセス ] タブで、[ 背景の減算] を選択して背景 ノイズを削除します。
- [ 解析 ] タブをクリックしてセルをカウントし、[ パーティクルの解析] を選択します。「 OK」 をクリックして、カウントされたパーティクルのリストを生成します。
- 緑色蛍光画像でカウントされた粒子の数を、対応する位相差画像でカウントされた粒子の数で割ることによって、GFP陽性細胞の割合を計算します。
- ターゲット上のCas9アクティビティの分析
- エレクトロポレーションされた細胞からゲノムDNAを抽出します。
- エレクトロポレーションの3日後にプレートから培地を取り出し、0.25%トリプシン500μLを加える。37°Cで5分間インキュベートする。ピペットは、インキュベーション後に数回、肝細胞がプレートから脱離したことを確認する。
- トリプシン処理した細胞懸濁液を微量遠心チューブに移し、卓上遠心分離機中で800× g で室温で10分間スピンさせた。回転後、チューブにペレットがないか調べます。
- トリプシンを含む上清をピペッティングにより除去する。ペレットを乱さないようにしてください。ペレットを80 μLのDNA抽出溶液に再懸濁する。ペレットが見えにくい場合は、チューブの内容物を50 μLのDNA抽出溶液に再懸濁します。
- ペレットが蘇生されることを確認するために30秒間渦を巻きます。懸濁液をPCRスプリットストリップチューブに移し、サーマルサイクラーに入れます。95°Cで15分間、68°Cで8分間実行します。
- PCRは、オンターゲット遺伝子座を増幅します。
- DNAポリメラーゼを用いて Hpd オンターゲット領域を増幅するために以下に記載する手順に従う。
- 0.5 μL の 10 mM dNTP、0.5 μL の 10 μM フォワードプライマー、0.5 μL の 10 μM リバースプライマー、0.125 μL の Taq ポリメラーゼ、5 μL の肝細胞から抽出したゲノム DNA、および 18.375 μL のヌクレアーゼ自由水を含む反応を調製します。プライマー配列については 、補足表S1 を参照されたい。
- PCR ミックスを短時間ボルテックスし、素早く遠心分離して、溶液がチューブの底部にあることを確認します。
- PCR ミックスをサーマルサイクラーに入れ、変性のために 94 °C で 30 秒、94 °C で 30 秒、アニーリングで 57 °C で 45 秒、68 °C で 1 分間、および 68 °C で 5 分間の最終延長の条件で増幅します。
注:PCR反応のアニーリング温度は、プライマーの組成によって異なります。PCRを実行する前に融解温度計算機を使用することを検討してください。 - 正しい製品サイズを確認するには、PCR 産物 3 μL を水 2 μL および 6x 色素 1 μL と混合します。1.5%アガロースゲルで実行し、正しい製品サイズを確認します。
- 磁気ビーズを用いてDNAを精製する。
メモ: スピンカラムは、PCR クリーンアップにも使用できます。以下は、磁気ビーズを用いたPCR産物の精製手順です。- 磁気ビーズを4°Cから取り出し、室温に達するようにします。
- 短時間ボルテックスし、PCRミックスを素早く遠心分離する。
- PCRミックスの体積の1.8×に等しいビーズの体積を加える。PCRビーズミックスを10xピペットでピペットし、溶液が均等に混合されることを確認します。
- 室温で10分間インキュベートする。
- PCRビーズミックスをPCRプレートに移し、磁気プレートの上に置きます。
- 磁石の上のプレートを5分間インキュベートする。5分後、溶液が透明であり、ビーズが磁石に結合していることを確認してから次のステップに進みます。
- 上清を捨てる。
- ウェルに200μLの70%エタノールを加え、30秒間インキュベートする。
注:70%エタノールは、DNA損失を防ぐためにクリーンアップを実行する直前に調製する必要があります。 - 上清を捨て、ステップ7.4.4.8を繰り返します。
- 上清を除去し、室温で3分間乾燥させて微量のエタノールを除去する。
- 磁石からプレートを取り出し、サンプルに22μLの水を加えます。ピペットを上下に10回動かして、水とビーズを混ぜます。
- サンプルを室温で3分間インキュベートする。
- プレートを磁石に戻して、3分間または溶液が透明になるまでインキュベートします。
- 20 μL のサンプルを PCR チューブに移します。ビーズが持ち越されないように注意してください。
- サンガーシーケンシングによりDNAアンプリコンを配列精製した。
- 処理サンプルおよび対照(未処理)サンプルの.ab1配列ファイルを分解によるインデルの追跡(TIDE)16 にアップロードして、標的部位のインデルを定量化します。
- エレクトロポレーションされた細胞からゲノムDNAを抽出します。
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Representative Results
肝臓からの平板状初代肝細胞の単離
肝臓灌流および肝細胞単離の全体的なプロセスを 図1に示します。本実験では、野生型、8~10週齢のC57BL6/6Jマウスを用いた。この手順は、マウスあたり20〜50個×106 個の細胞を産出し、生存率は85%〜95%であると予想されます。生存率が<70%の場合、死細胞を除去するためにパーコール処理に従うべきである。新たに単離した肝細胞は、コラーゲンIコートまたは窒素含有組織培養プレートに播種する必要があります。めっきから3〜12時間以内に、肝細胞はプレートに接着すると予想され、細胞形態は24時間以内に典型的な多角形または六角形の外観を想定する(図2)。肝細胞は、グリコーゲンの形でグルコースを貯蔵する肝臓で唯一の細胞である。単離された細胞の純度を検証するために、グリコーゲン染色は、メッキ後24時間で過ヨウ素酸-シッフ試薬を用いて行われる。染色された肝細胞の細胞質はマゼンタ色に見える(図3)。
単離されたマウス肝細胞へのCRISPR-Cas9 RNPおよびmRNAのエレクトロポレーション
新たに単離したマウス肝細胞を、eGFP mRNA、Cas9 mRNAとHpd標的化sgRNA、またはCas9タンパク質をHpd-sgRNA(RNP)と複合体形成してエレクトロポレーションした。Hpd-sgRNAは、5'末端および3'末端14上の最初および最後の3つの連続ヌクレオチドへの2'-O-メチルホスホロチオエート結合で化学的に修飾された。ストレプトコッカス・ピオゲネス Cas9を実験に用いた。蛍光顕微鏡を用いてエレクトロポレーション24時間後に肝細胞を画像化し、GFP陽性細胞の割合を画像でカウントした(図4A)。平均して、肝細胞の89.8%[範囲87.1%〜92.4%]がGFP陽性であった。エレクトロポレーションの3日後に、Hpd遺伝子座におけるCas9誘導性の挿入および欠失(indels)をTIDE16を用いて分析した。結果は、CRISPR-Cas9 mRNAでエレクトロポレーションした肝細胞では47.4%のオンターゲットインデル、Cas9 RNPでは78.4%のインデルを示しています(図4B)。MTTおよびアルブミンアッセイは、CRISPR−Cas9をエレクトロポレーションした後の肝細胞生存率および機能性を評価するために実施した。MTTの結果は、それぞれCRISPR-Cas9 mRNAおよびRNPで処理した肝細胞において35.4%および45.9%の生存率を示す(図4C)。MTTの結果と一致して、正規化されたアルブミンレベルは、Cas9 mRNAで処理した肝細胞で31.8%、Cas9 RNPで34.5%であった(図4D)。
図1:肝細胞灌流および単離プロトコルの概略図。 下大静脈のカニューレ治療後、門脈を切断し、灌流溶液1、2、および3を肝臓を通してポンプで送り出す。肝臓カプセルが破裂し、セルリフターを用いて細胞が放出される。放出された細胞は、歪められ、遠心分離される。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:新たに単離された初代肝細胞。 C57BL/6Jマウスから単離した肝細胞を、肝細胞プレーティング培地でコラーゲンIコート6ウェルプレートに播種した。めっき後24時間で撮影した画像。スケール バー = 400 μm 。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:グリコーゲン染色 新たに単離した初代マウス肝細胞をグリコーゲンについて染色し、純度を確認した。染色は、めっき後24時間でシッフ試薬を用いて行った。 染色された肝細胞の細胞質はマゼンタ色に見える。スケール バー = 100 μm 。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:新たに単離された初代マウス肝細胞への Hpd標的CRISPR-Cas9のエレクトロポレーション。 (a)エレクトロポレーション後24時間における新たに単離されたマウス肝細胞の位相差および緑色蛍光顕微鏡観察画像。上段の画像はeGFP mRNAを導入した肝細胞であり、下段の画像はトランスフェクトされていない対照肝細胞である。スケールバー = 400 μm. (B) sgRNAまたはRNPと組み合わせたCas9 mRNAでエレクトロポレーションしたマウス肝細胞のオンターゲットインデル。(c)エレクトロポレーション後24時間でMTTアッセイにおいてトランスフェクトされていない対照肝細胞に対して正規化された生存率。(d)エレクトロポレーション後24時間(n = 3)に測定された非トランスフェクト対照肝細胞に正規化された馴化培地中のアルブミンレベルを、2つの技術的反復で測定した。統計解析は、不対 t検定により行った。この図は 14 から変更されました。略語:Hpd=4-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ;CRISPR = 規則的に間隔をあけて短い回文反復をクラスター化;Cas9 = CRISPR関連タンパク質9;sgRNA = シングルガイドRNA;RNP = リボヌクレオタンパク質;INDEL = 挿入-削除;MTT=3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:肝臓灌流および肝細胞単離プロトコルのトラブルシューティング。 次の表に、プロトコル中に発生する一般的な問題と、考えられる解決策を示します。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S1:手術中のマウス腹腔。 カテーテルは、腎枝(見えない)の前に下大静脈(青い点)に挿入される。略語: L = 肝臓;K = 腎臓;I = 小腸。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表S1:Cas9ガイドおよびPCRプライマー配列。 Hpdを標的とするsgRNAのガイド配列としてはPAMと、Hpdの増幅のためのPCRプライマー配列が挙げられる。略語:Hpd=4-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ;CRISPR = 規則的に間隔をあけて短い回文反復をクラスター化;Cas9 = CRISPR関連タンパク質9;sgRNA = シングルガイドRNA;PAM = プロトスペーサー隣接モチーフ。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
肝細胞単離のためのプロトコルに概説されているステップは挑戦的であり、熟練のための練習を必要とする。肝臓からの肝細胞単離を成功させるためのいくつかの重要なステップがあります。まず、下大静脈の適切なカニューレレーションは、完全な肝臓灌流に不可欠です。灌流後の肝臓におけるブランチングの不在は、カテーテルの変位を示す(表1)。下大静脈(逆行性灌流)は、門脈(順行性灌流)よりも簡単でアクセスしやすいため、手順でカニューレ採取されました17,18。いくつかのプロトコルは、カテーテル19を固定するために縫合糸を使用する。しかし、縫合糸はプロセスを複雑にする。カテーテルを縫合すると、カテーテルの配置ミスや位置の調整が不可能になるなど、望ましくない結果が生じる可能性があります。また、針を抜くことなく肝臓でカニューレを行うことができるため、肝臓灌流をさらに簡略化することができる。ポンプをカテーテルに接続することは、静脈内の針で不要である。さらに、誤ってカテーテルを抜いて血栓を形成する可能性が低減されます。静脈に対して平坦な角度でカテーテルの先端のみを挿入すると、カニューレーションが増強された。下大静脈にはいくつかの枝があるので、間違った部位にカテーテルを挿入すると、肝臓ではなく体の別の部分に灌流が起こります(表1)。したがって、枝を避ける部位にカテーテルを配置することが不可欠です。血管構造は、異なるマウス間でわずかに変化する。したがって、カテーテルを注入するための最良の部位を決定するために、カニューレの前に静脈を調べることが重要です。針を取り外した後のカテーテル内の血液のバックフラッシュは、適切なカニューレの優れた指標です。適切なカニューレは、門脈に一時的に圧力が加えられたときの肝臓の腫れを探すことによっても確認することができる(ステップ1.3.13)。
肝細胞を単離する場合、第2の重要なステップは、完全な肝臓消化がいつ起こったかを認識することである。酵素の品質と濃度は、適切な消化に不可欠です。20、21に見られるプロトコールとは対照的に、このプロトコールは、通常のコラゲナーゼ22よりも酵素活性の良好な一貫性およびバッチ間変動の低減を提供するため、2つのコラゲナーゼアイソフォームからなるリベラーゼの使用を示唆している。消化酵素の品質と活性の変動は、単離に矛盾を引き起こす可能性があります。消化中に肝臓を監視し、肝臓が軟化した直後に消化を止めることが不可欠です。消化された肝臓は柔軟であり、鉗子または綿棒を使用して肝臓を押し下げて、組織が跳ね返ることなくくぼみが形成されることを確認することによって検証された弾力性の損失を示す。このプロトコルでは、肝臓あたりに推奨されるリベラーゼ溶液の最大量は50mLです。量が多いほど消化過多になります。カニューレーションが完全に行われる場合、30mLのリベラーゼ溶液は適切な消化を達成するのに十分である。手順の最後の重要なステップは、分離と洗浄のステップです。肝臓を解剖し、FBSで氷冷DMEMを含む滅菌ペトリ皿に移した後、肝臓をバラバラに切断することを避けることが重要です。この段階で、セルリフターを使用して細胞を穏やかに放出し、細胞生存率を最大化します。ディッシュを傾けて肝臓をDMEMに沈めると、カプセルから懸濁液への細胞の放出が容易になり、ゆっくりと氷上で行う必要があります。放出ステップ中にグリッソンのカプセルを混乱させるのは簡単で、培地は曇って茶色になるはずです。カプセルを破壊する際の困難さは、消化不良の指標である(表1)。
このプロトコルは、新たに単離されたマウス肝細胞において高レベルのCRISPR-Cas9編集を生成するのに適している。Cas9 RNPおよびmRNAによって生成されたインデルを研究において比較した。より高いレベルの遺伝子編集が、mRNAよりもCas9 RNPでエレクトロポレーションされた肝細胞において観察され、これは他の研究からの知見と一致する14、23、24。mRNAに対するCas9 RNPの利点は、Cas9タンパク質がmRNA23,24よりも短い期間細胞内に存在するため、オフターゲット編集が低いことです。sgRNAの効率は設計部位と標的部位によって異なるため、複数のsgRNAを設計し、目的の遺伝子における編集効率について試験する必要があります。高い遺伝子効率を有するsgRNAの中から選択する際には、より高い特異性スコアリング設計を選択する。遺伝子編集が一貫して低い場合は、eGFP mRNAなどのレポーターを共同配信して送達を確認することを検討してください。エレクトロポレーション後の低レベルのeGFP陽性細胞は、期限切れのエレクトロポレーションバッファー、エレクトロポレーションデバイスの問題、または反応中の気泡を示している可能性があります。eGFP陽性細胞の数が多いが編集効率が低い場合は、細胞株のsgRNAデザインをテストして編集活性を確認し、細胞にエレクトロポレーションされたCas9およびsgRNAの量を調整します。最後に、編集アクティビティの評価に使用される方法を検討します。T7エンドヌクレアーゼIなどのゲルベースのアッセイは、切断部位における1bpミスマッチに対する感度が低いため、遺伝子編集を過小報告することができます。ディープシーケンシングは、Cas9遺伝子編集を定量化するための最も正確な方法であり、特にオフターゲット部位での低編集事象の場合です。
プロトコルの別の挑戦的な側面は、エレクトロポレーション後に新たに単離された肝細胞を培養することである。ユーザーは、エレクトロポレーション後に生存可能な平板状の肝細胞を得るために、プロトコルの各ステップ中に細胞を穏やかに扱う必要があります。渦によって肝細胞を分散させないでください;代わりに、細胞が蘇生するまで細胞を含むバイアルを穏やかに揺らします。肝細胞を移すときは、生存率を維持するために広口径のピペットチップを使用してください。エレクトロポレーション後、キュベットを氷上で15分間インキュベートすると、細胞膜を再シールして生存率を高めることができます。メッキ後、プレートをインキュベーターに入れ、プレートを水平および垂直に南北および東西の動きで静かに動かして、肝細胞が均等に分散し、細胞生存率を維持します。肝細胞がプレートに付着しない場合は、エレクトロポレーション反応で細胞数を1.3×106 に増やすことを検討してください。
このプロトコルの有望な用途の1つは、肝臓のヒトIMDのマウスモデルの生成である。フマラアセト酢酸加水分解酵素(Fah)をコードする遺伝子に対して陽性であるマウス肝細胞は、Fah欠損(Fah-/-)マウス25における移植後に肝臓に効率的に生着し、再移入することが示されている。肝臓のIMDのマウスモデルを開発するための新しいアプローチは、CRISPR-Cas9を野生型マウス肝細胞にエレクトロポレーションして疾患に関連する編集を導入し、続いて遺伝子編集肝細胞をFah-/-マウスに移植することです。Cas9編集肝細胞は、肝臓を再移入するための天然のFah欠損細胞と比較して、移植後に自然な選択的利点を有するであろう。
結論として、このプロトコルは、マウス肝臓から初代肝細胞を単離し、続いてCRISPR-Cas9 mRNAおよびRNPを用いた遺伝子編集を行う能力をユーザーに提供します。このプロトコルは、インビトロおよびインビボで肝臓に影響を及ぼす様々なタイプの遺伝性疾患を研究し、治療アプローチをテストするために、異なる系統のマウスで使用するために改変することができる。
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Disclosures
著者らは、開示すべき競合する利害関係はない。
Acknowledgments
RNCは、米国国立衛生研究所の国立一般医学研究所(NIGMS)、米国肝疾患研究協会財団、および米国遺伝子細胞療法学会の支援を受けて、サウスカロライナ州バイオエンジニアリングセンターから助成金番号P30 GM131959、2021000920、 と2022000099それぞれ。内容は著者の責任であり、必ずしも米国遺伝子細胞療法学会または米国肝疾患学会財団の公式見解を表すものではありません。図1の回路 図 は、BioRender.com で作成しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 0.2 mL PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, natural | USA Scientific | 1402-4700 | |
| 6-well Collagen Plates | Advanced Biomatrix | 5073 | |
| accuSpin Micro 17R | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| All-in-one Fluorescent Microscope | Keyence | BZ-X810 | |
| Analog Vortex Mixer | VWR | 97043-562 | |
| ART Wide BORE filtered tips 1,000 µL | ThermoFisher Scientific | 2079GPK | |
| Automated Cell Counter | Bio-Rad Laboratories | TC20 | |
| Blue Wax Dissection Tray | Braintree Scientific Inc. | DTW1 | 9" x 6.5" x 1/2"+F21 |
| Cell scraper/lifter | Argos Technologies | UX-04396-53 | Non-pyrogenic, sterile |
| Conical tubes (15 mL) | Fisher Scientific | 339650 | |
| Conical tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Cotton applicators | Fisher Scientific | 22-363-170 | |
| Curved scissors | Cooper Surgical | 62131 | |
| Disposable Petri Dishes | Falcon | 351029 | 100mm,sterile |
| Disposable Petri Dishes | VWR | 25373-100 | 35mm, sterile |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek Instruments | 250082 | |
| Falcon Cell strainer (70 µm) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Forceps | Cooper Surgical | 61864 | Euro-Med Adson Tissue Forceps |
| IV catheters | BD | 382612 | 24 G x 0.75 in |
| IV infusion set | Baxter | 2C6401 | |
| MyFuge 12 Mini Centrifuge | Benchmark Scientific | 1220P38 | |
| Needles | Fisher Scientific | 05-561-20 | 25 G |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | Program T-028 was used for electroporation in mouse hepatocytes |
| Peristaltic Pump | Masterflex | HV-77120-42 | 10 to 60 rpm; 90 to 260 VAC |
| Precision pump tubing | Masterflex | HV-96410-14 | 25 ft, silicone |
| Primaria Culture Plates | Corning Life Sciences | 353846 | Nitrogen-containing tissue culture plates |
| Serological Pipets (25 mL) | Fisher Scientific | 12-567-604 | |
| Syringes | BD | 329464 | 1 mL, sterile |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories | 1861096 | |
| Water bath | ALT | 27577 | Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 Series, 2.5 L |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 | IDT | 1081058 | |
| Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL | Fisher Scientific | NC9959336 | |
| CleanCap Cas9 mRNA | Trilink Biotechnologies | L-7606-100 | |
| CleanCap EGFP mRNA | Trilink Biotechnologies | L-7201-100 | |
| Corning Matrigel Matrix | Corning Life Sciences | 356234 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885076 | Low glucose, pyruvate |
| Ethanol 70% | VWR | 71001-652 | |
| Fetal bovine serum | Thermoscientific | 26140-079 | |
| Hepatocyte Maintenance Medium (MM) | Lonza | MM250 | |
| Hepatocyte Plating Medium (PM) | Lonza | MP100 | |
| Mouse Albumin ELISA Kit | Fisher Scientific | NC0010653 | |
| Mouse/Rat Hepatocyte Nucleofector Kit | Lonza | VPL-1004 | |
| OneTaq HotStart DNA Polymerase | New England Biolabs | M0481L | |
| PBS 10x pH 7.4 | Thermoscientific | 70011-044 | No calcium or magnesium chloride |
| Percoll (PVP solution) | Santa Cruz Biotechnology | sc-500790A | |
| Periodic acid | Sigma-Aldrich | P7875-25G | |
| Permount Mounting Medium | VWR | 100496-550 | |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen Corporation | QE05090 | |
| Schiff’s fuchsin-sulfite reagent | Sigma-Aldrich | S5133 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | Phenol red |
| Vybrant MTT Cell Viability Assay | ThermoFisher Scientific | V13154 | |
| Perfusion Solution 1 (pH 7.4, filter sterilized) | Stable at 4 °C for 2 months | ||
| EBSS | Fisher Scientific | 14155063 | Complete to 200 mL |
| EGTA (0.5 M) | Bioworld | 40520008-1 | 200 µL |
| HEPES (pH 7.3, 1 M) | ThermoFisher Scientific | AAJ16924AE | 2 mL |
| Perfusion Solution 2 (pH 7.4, filter sterilized) | Stable at 4 °C for 2 months | ||
| CaCl2·2H20 (1.8 mM) | Sigma | C7902-500G | 360 µL of 1 M stock |
| EBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red) | Fisher Scientific | 14-155-063 | Complete to 200 mL |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher Scientific | AAJ16924AE | 2 mL |
| MgSO4·7H20 (0.8 mM) | Sigma | 30391-25G | 160 µL of 1 M stock |
| Perfusion Solution 3 | Prepared fresh prior to use | ||
| Solution 2 | 50 mL | ||
| Liberase | Roche | 5401127001 | 0.094 Wunsch units/mL |
| Mouse Anesthetic Cocktail | |||
| Acepromzine | 0.25 mg/mL final concentration | ||
| Ketamine | 7.5 mg/mL final concentration | ||
| Xylazine | 1.5 mg/mL final concentration | ||
| Software | URL | ||
| Benchling | https://www.benchling.com/ | ||
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| TIDE: Tracking of Indels by Decomposition | https://tide.nki.nl/ |
References
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