Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Entrega mediada por eletroporação de cas9 ribonucleoproteínas e mRNA em hepatócitos de rato primário recém-isolados

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63828
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Department of Bioengineering, Clemson University, 2Godley Snell Research Center, Clemson University
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo descreve técnicas para isolar hepatócitos primários do fígado e eletroporar CRISPR-Cas9 como ribonucleoproteínas e mRNA para interromper um gene alvo terapêutico associado a uma doença metabólica herdada do fígado. Os métodos descritos resultam em alta viabilidade e altos níveis de modificação genética após a eletroporação.

Abstract

Este protocolo descreve um método rápido e eficaz para isolar hepatócitos primários do rato seguido pela entrega mediada por eletroporação de CRISPR-Cas9 como ribonucleoproteínas (RNPs) e mRNA. Os hepatócitos primários do camundongo foram isolados usando um método de perfusão retrógrada de três etapas, resultando em altos rendimentos de até 50 × 106 células por fígado e viabilidade celular de >85%. Este protocolo fornece instruções detalhadas para chapeamento, coloração e hepatócitos. Os resultados indicam que a eletroporação proporciona uma alta eficiência de transfecção de 89%, medida pela porcentagem de células positivas de proteína fluorescente verde (GFP) e viabilidade celular modesta de >35% em hepatócitos de camundongos.

Para demonstrar a utilidade dessa abordagem, o CRISPR-Cas9 direcionado ao gene de dioxygenase hidroxifenyfenyruvate foi eletroporado em hepatócitos primários como prova de princípio de edição de genes para interromper um gene terapêutico relacionado a uma doença metabólica herdada (IMD) do fígado. Observou-se maior escíctil de 78% para RNPs em comparação com 47% de eficiência de edição com mRNA. A funcionalidade dos hepatócitos foi avaliada in vitro usando um ensaio de albumina que indicava que a entrega de CRISPR-Cas9 como RNPs e mRNA resulta em viabilidade celular comparável em hepatócitos de camundongos primários. Uma aplicação promissora para este protocolo é a geração de modelos de camundongos para doenças genéticas humanas que afetam o fígado.

Introduction

IMDs do fígado são distúrbios genéticos caracterizados pela deficiência de uma enzima hepática crucial envolvida no metabolismo que leva ao acúmulo de metabólitos tóxicos. Sem tratamento, as IMDs do fígado resultam em falência de órgãos ou morte prematura 1,2. A única opção curativa para pacientes com IMDs do fígado é o transplante hepático ortotópico, que é limitado devido à baixa disponibilidade de órgãos doadores e complicações da terapia imunossupressor após o procedimento 3,4. De acordo com dados recentes coletados pela Rede de Captação e Transplante de Órgãos, apenas 40%-46% dos pacientes adultos na lista de espera por transplante de fígado recebem um órgão, enquanto 12,3% desses pacientes morrem enquanto estão na listade espera 5. Além disso, apenas 5% de todas as doenças raras do fígado têm um tratamento aprovado pela FDA6. É claro que há uma necessidade crítica de novos tratamentos para IMDs do fígado. No entanto, modelos adequados de doenças são necessários para desenvolver novas opções terapêuticas.

Modelar doenças humanas usando sistemas in vitro e in vivo continua sendo um obstáculo para o desenvolvimento de terapias eficazes e o estudo da patologia dos DDM do fígado. Hepatócitos de pacientes com doenças hepáticas raras são desafiadores para obter7. Modelos animais são cruciais para o desenvolvimento da compreensão da patologia da doença e para testar estratégias terapêuticas. No entanto, um obstáculo é a geração de modelos a partir de embriões portadores de mutações letais. Por exemplo, tentativas de criar modelos de camundongos da Síndrome de Alagille (ALGS) com embriões contendo exclusões homozigosas de uma sequência de 5 kb perto do final de 5′do gene Jag1 resultaram na morte precoce dos embriões8. Além disso, gerar modelos de mouse por edição de genes em células-tronco embrionárias pode ser otempo e o recurso intensivo 9. Por fim, mutações aparecerão fora do tecido alvo, levando a variáveis de confusão que podem impedir o estudo da doença9. A edição de genes somáticos permitiria uma edição mais fácil no tecido hepático e contornaria os desafios associados à geração de modelos usando células-tronco embrionárias.

A eletroporação permite a entrega do CRISPR-Cas9 diretamente no núcleo, aplicando correntes de alta tensão para permeabiliizar a membrana celular e é compatível com muitos tipos de células, incluindo aquelas que são intransigentes às técnicas de transfecção, como células-tronco embrionárias humanas, células-tronco pluripotentes e neurônios 10,11,12 . No entanto, a baixa viabilidade é uma potencial desvantagem da eletroporação; otimizar o procedimento pode produzir altos níveis de entrega ao mesmo tempo em que limita a toxicidade13. Um estudo recente demonstra a viabilidade de eletroporar componentes CRISPR-Cas9 em hepatócitos primários e humanos como uma abordagem altamente eficiente14. A eletroporação ex vivo em hepatócitos tem potencial para ser aplicada para gerar novos modelos de camundongos para IMDs humanos do fígado.

Este protocolo fornece um procedimento passo-a-passo detalhado para isolar hepatócitos de camundongos do fígado e, posteriormente, eletroporar CRISPR-Cas9 como complexos RNP, consistindo de proteína Cas9 e RNA de guia único sintético (sgRNA), ou Cas9 mRNA combinado com sgRNA para obter altos níveis de edição de genes no alvo. Além disso, o protocolo fornece métodos para quantificar a eficiência, a viabilidade e a funcionalidade de edição de genes após a eletroporação do CRISPR-Cas9 em hepatócitos de camundongos recém-isolados.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Os experimentos em animais foram todos realizados em conformidade com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais e protocolos aprovados na Universidade Clemson. Os procedimentos cirúrgicos foram realizados em camundongos C57BL/6J anestoetizados entre 8 e 10 semanas de idade.

1. Cirurgia animal

  1. Elaboração de soluções e instrumentos
    NOTA: Soluções de perfusão e receitas de coquetéis de anestesia são mostradas na Tabela de Materiais.
    1. Preparar solução de perfusão 1 (HEPES, EGTA e EBSS), Solução de Perfusão 2 (HEPES, EGTA, EBSS, CaCl2 e MgSO4) e Solução perfusion 3 (Solução 2 e Liberase). Certifique-se de que as soluções estão bem misturadas.
    2. Coloque o banho de água em 42 °C e as Soluções de Perfusão pré-intempicas 1, 2 e 3 por um mínimo de 30 minutos antes de iniciar o procedimento e mantenha-as no banho de água.
      NOTA: As soluções de perfusão 1 e 2 vão quimerar o cálcio e lavar o sangue no fígado. A Solução de Perfusão 3 contém a enzima digestiva liberase para dissociar a matriz extracelular.
    3. Coloque 150 mL de DMEM + 10% de soro bovino fetal (FBS) em tubos cônicos e mantenha-os no gelo.
      NOTA: Este meio será usado para liberar as células da cápsula hepática e lavar os hepatócitos isolados nas etapas 2.1 e 2.2, respectivamente.
    4. Coloque a centrífuga para 4 °C.
    5. Esterilize a tubulação da bomba colocando as duas extremidades da tubulação em um frasco cheio de 70% de etanol e pedalando o etanol três vezes.
    6. Lave a tubulação com água destilada e esvazie-a.
    7. Encha o tubo com 30 mL de Perfusion Solution 1, seguido por 8 mL de Solução Perfusion 2. Se a tubulação ainda tiver espaço para mais fluidos, encha o resto da tubulação com solução de perfusão 3. Pare a bomba ao mudar para uma solução de perfusão diferente para evitar a introdução de bolhas de ar na tubulação.
    8. Coloque o excesso de tubos no banho de água de 42 °C para manter as soluções de perfusão aquecidas.
    9. Coloque a extremidade da tubulação da bomba no tubo cônico contendo Solução de Perfusão 3, enquanto mantido no banho de água.
      NOTA: Esta etapa é necessária para permitir que a bomba se encha continuamente com a Solução de Perfusão 3 durante a perfusão.
  2. Preparação animal
    1. Anestesia o rato injetando o coquetel anestésico intraperitoneal a uma dose de 10-11,7 μL/g de peso corporal. O coquetel anestésico tem concentração final de 7,5 mg/mL de cetamina, acepromazina de 0,25 mg/mL e 1,5 mg/mL de xilazína.
    2. Monitore a respiração do mouse e verifique se o mouse não está reagindo à dor. Espere até que o mouse tenha uma taxa de respiração de ~55-65 respirações por minuto, não responde a ter seus dedos beliscados, e tem uma cauda flácido. Além disso, verifique o reflexo palpebral (piscando) tocando levemente a pele no lado medial do olho fechado. Se o rato piscar ou os músculos dos olhos se contrairem, aumente a dose de todo o coquetel anestésico em 5-10 μL.
    3. Coloque o mouse de costas em uma posição supina e fixe os membros na superfície usando pinos ou fita (Figura Suplementar S1).
    4. Pulverize o abdômen com 70% de etanol e seque-o usando uma bola de algodão.
  3. Perfusão hepática
    1. Faça uma incisão lateral em forma de U na pele do abdômen usando uma tesoura e expanda o orifício através dos lados.
    2. Continue abrindo a pele para a caixa torácica.
    3. Usando uma tesoura, corte o peritônio para expor a cavidade abdominal até a caixa torácica, tomando cuidado para não cortar nenhum órgão. Mova os intestinos para o lado direito usando a parte de trás das fórceps ou a superfície cega da tesoura. Identifique a veia inferior da veia vena e a veia portal (Figura Suplementar S1).
    4. Inicie a bomba para lavar a solução de perfusão pré-armada através do cateter.
    5. Pare a bomba e remova o cateter uma vez que todo o ar tenha sido bombeado através do sistema. Insira a ponta da agulha conectada ao cateter na veia cava inferior em um ângulo de 10°-20° na veia. Retire a agulha do cateter e empurre suavemente o cateter para dentro da veia em um movimento paralelo à veia.
      NOTA: O usuário deve observar flashback de sangue no cateter para verificar a cannulação adequada na veia.
    6. Conecte a tubulação ao cateter sem mover o cateter mais para dentro da veia.
    7. Inicie a bomba com uma vazão de 2 mL/min. Procure o fígado imediatamente ficando pálido como um sinal de que a perfusão é bem sucedida.
    8. Corte a veia do portal usando uma tesoura.
    9. Aumente gradualmente a vazão para 5 mL/min.
    10. Aplique pressão periodicamente na veia portal no local de corte aproximado por 3 s usando fórceps ou um cotonete para bloquear a drenagem e facilitar uma boa perfusão.
    11. Uma vez que a Solução de Perfusão 3 esteja fluindo, monitore cuidadosamente a elasticidade do fígado. Para determinar se o fígado está amolecido, pressione suavemente o fígado com um cotonete ou fórceps e verifique se as indagações se formam no fígado. Tenha cuidado para não exagerar para evitar a perda de viabilidade celular.
    12. Uma vez que o fígado é suavizado (ocorrendo após 30-50 mL de Perfusion Solution 3 fluiu), pare a bomba, remova o cateter e disseque cuidadosamente o fígado. Coloque o fígado em uma placa de Petri de 100 mm contendo DMEM gelado + 10% de FBS médio. Extite a vesícula biliar, tomando cuidado para não derramar seu conteúdo. Gire a placa de Petri para remover suavemente possíveis coágulos sanguíneos.
    13. Transfira o fígado para uma nova placa de Petri contendo DMEM gelado + 10% de FBS médio.

2. Isolamento hepatocito

  1. Liberar células da cápsula hepática.
    1. Coloque a placa de Petri no gelo e usando dois pares de fórceps estéreis, rasgue suavemente a cápsula do fígado em todos os lóbulos. Gire suavemente o fígado ao redor no meio usando um levantador de células ou um fórceps para liberar os hepatócitos. Continue este movimento até que o fígado se torne muito pequeno e a suspensão fique marrom e opaca.
    2. Remova os restos do tecido hepático da placa e usando uma pipeta sorológica de 25 mL definida para baixa velocidade, transfira cuidadosamente a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mL (pré-estilhaçado no gelo) equipado com um coador de células de 100 μm.
    3. Adicione DMEM fresco e gelado + 10% de FBS médio à placa de Petri para lavar e coletar as células restantes da superfície e transferir para o tubo cônico de 50 mL. Repita esta etapa até que todas as células sejam coletadas.
  2. Lave e purifique hepatócitos de células não parlamentares.
    1. Centrifugar as células coletadas no tubo cônico de 50 mL a 50 × g a 4 °C por 5 min em baixa desaceleração ou sem freios.
    2. Descarte o supernatante contendo detritos e células não-equiquiais e resuspenque a pelota no supernatante restante girando suavemente o tubo. Depois que a pelota for resuspended, adicione 30 mL de DMEM fresco e gelado + 10% de meio FBS.
    3. Repita a centrifugação (etapa 2.2.1) e a lavagem (passo 2.2.3) três vezes.
    4. Resuspende a última pelota celular em 10 mL de DMEM gelado + 10% de FBS médio.
      NOTA: O volume de médio utilizado para resuspensar a pelota depende do tamanho da pelota. Se a pelota for consideravelmente menor que 15 mm, use 1-5 mL de DMEM gelado + 10% de meio FBS.
  3. Quantificação de viabilidade celular
    1. Em um tubo de microfuge, adicione 50 μL de solução Trypan Blue de 0,4% a 350 μL de Hepatocyte Plating Medium (PM). Em seguida, adicione 100 μL de suspensão celular para fazer uma diluição final de 1:5 e pipeta para cima e para baixo várias vezes para misturar.
    2. Conte a densidade celular e a viabilidade usando um hemótmetro. Enquanto estiver contando, coloque a suspensão do hepatócito no gelo e, em seguida, coloque o balde de gelo em um agitador orbital definido a 30 rpm para evitar que os hepatócitos se instalem.
    3. Siga o tratamento percoll e as etapas de centrifugação abaixo se a viabilidade celular for <70%.
      1. Percoll diluído com salina tamponada de fosfato de 10x (PBS) em uma proporção de 9:1.
      2. Misture a suspensão do hepatocitado com o Percoll diluído em uma proporção de 1:1.
      3. Centrifugar a 200 × g a 4 °C por 10 min.
      4. Descarte o supernatante contendo células mortas. Resuspense a pelota em DMEM gelado + 10% de FBS médio.
      5. Conte as células de novo.
  4. Testando hepatócitos para plaquebilidade
    1. Emplaque algumas das células em placas de 6 poços revestidos de colágeno a uma densidade de 0,5 × 106 células por mL usando 1,5 mL de PM pré-armado.
    2. Mantenha as células restantes no gelo enquanto estiver em um shaker orbital até estar pronto para realizar a eletroporação.
    3. Coloque a placa de células em uma incubadora de CO2 com revestimento de água a 37 C. Mova a placa horizontal e verticalmente suavemente em um movimento norte-sul e leste-oeste para garantir o revestimento homogêneo. Repita o movimento mais duas vezes a cada 1,5 h.
    4. Verifique o acessório da célula em 3h após o revestimento.
      NOTA: Pelo menos 60% das células devem aderir à placa como um indicador de hepatócitos de boa qualidade.
    5. Mude o meio para o meio de manutenção de hepatócitos pré-armados (MM) em 24 horas após o revestimento para manter as células na cultura.
  5. Coloração de glicogênio
    1. Depois que as células se anexaram às placas revestidas de colágeno de 6 poços, remova o meio gasto das células cultivadas.
    2. Conserte as células por 10-15 min em etanol gelado.
    3. Lave bem com água estéril.
    4. Incubar em ácido periódico aquoso de 1% por 5 min e depois lavar com água estéril.
    5. Incubar em Reagente 100% Schiff por 30 min.
      NOTA: O reagente Schiff não deve ser diluído antes de adicionar às células.
    6. Lave com água três vezes mais de 10 minutos.
    7. Monte em meio de montagem.
    8. Imagem usando um microscópio na configuração brightfield.

3. Design sgRNAs para edição de genes CRISPR-Cas9

NOTA: Esta seção descreve o desenho de um sgRNA direcionado ao gene de dioxygenase do camundongo hidroxifenylvote (Hpd) como prova de princípio de edição de genes para interromper um gene alvo terapêutico relacionado a um IMD do fígado.

  1. Projete a sequência de guias visando o Hpd usando o software referenciado15.
  2. Verifique a sequência de Hpd com o Navegador genoma Ensembl.
  3. Use os seguintes parâmetros para projetar o gRNA: comprimento de guia único de 20 nucleotídeos e uma sequência NGG (N pode ser qualquer nucleotídeo) protoespaço-adjacente (PAM).
  4. Selecione uma região alvo do exon 3 no Hpd.
  5. Gere uma lista de sequências de guias da região alvo com pontuações on e off-target.
    NOTA: O Placar on-target indica a eficiência de edição no alvo prevista para o design dado: uma pontuação mais alta está correlacionada com maior eficiência de edição. O Escore fora do alvo se correlaciona com a especificidade da sequência guia: uma pontuação maior indica menor probabilidade de edição fora do alvo. O ideal é que ambas as pontuações sejam altas: a pontuação no alvo >60 e a pontuação fora do alvo >50.
  6. Selecione a sequência de guias com as pontuações mais altas no alvo e fora do alvo. Tenha o sgRNA contendo a sequência guia quimicamente sintetizada.

4. Eletroporação e cultura celular

  1. Preparação de substratos CRISPR-Cas9, mídia, células e o instrumento de eletroporação
    1. Adicione todo o suplemento de acompanhamento ao PM e aqueça no banho de água de 37 °C por 10 minutos.
    2. Ligue o dispositivo de eletroporação pressionando o botão de alimentação e defina o programa de eletroporação pressionando o botão x e, em seguida, o botão de seta para baixo até que o programa T-028 apareça na tela.
    3. Prepare os poços de destino para os hepatócitos eletroporados adicionando 1,5 mL de PM a placas revestidas de colágeno de seis poços. Incubar as placas em uma incubadora de 37 °C até estar pronta para uso.
    4. Adicione todo o suplemento de acompanhamento à solução de tampão de eletroporação e incubar à temperatura ambiente por 10 minutos.
      NOTA: Rotule a data de validade do tampão de eletroporação no frasco (3 meses após a data de adição do suplemento).
    5. Remova os vasos de eletroporação da embalagem e rotule-os para cada amostra.
    6. Em tubos de tira dividida PCR, prepare os complexos Cas9 RNP combinando 30 μg de sgRNA com 300 pmol de proteína Cas9 e incubar os complexos em temperatura ambiente por 10 minutos. Prepare o Cas9 mRNA combinando 30 μg de sgRNA com 4 μL de Cas9 mRNA (1 μg/μL). Armazene a mistura mRNA-sgRNA no gelo até a eletroporação. Prepare separadamente um tubo contendo 1,0 μg de eGFP mRNA para verificar a eletroporação bem sucedida usando microscopia de fluorescência.
    7. Centrifugar 1,2 × 106 células por reação de eletroporação a 100 × g por 2 min a 4 °C.
    8. Remova o sobrenatante da pelota celular e adicione 100 μL de solução de eletroporação por reação ao longo da lateral da parede do tubo. Resuspenque os hepatócitos na solução de eletroporação balançando o tubo suavemente à mão.
  2. Eletroporação de RNPs CRISPR-Cas9 e mRNA em hepatócitos
    1. Uma vez que os hepatócitos pareçam uniformemente dispersos na solução de eletroporação, transfira 100 μL da suspensão do hepatócito para os tubos de tira contendo os complexos Cas9.
      NOTA: Use pontas de pipeta largas ao transferir hepatócitos para preservar a viabilidade celular.
    2. Transfira bem o conteúdo da tira para um vaso de eletroporação.
    3. Coloque o vaso nucleovette na ranhura no dispositivo de eletroporação. Eletroporar os hepatócitos pressionando o botão x . Após a eletroporação, espere uma tela aparecer no dispositivo que diz OK. Pressione novamente o botão x e remova o recipiente.
    4. Incubar o recipiente eletroporado no gelo por 15 minutos.
    5. Adicione 500 μL de PM pré-armado ao navio de eletroporação.
    6. Transfira 300 μL da reação de eletroporação para cada destino bem na placa pré-armada.
      NOTA: Deve haver dois poços de destino por reação de eletroporação. Um poço será usado para quantificar a eficiência de edição de genes; o outro poço será usado para os ensaios MTT e albumina.
    7. Para evitar que os hepatócitos se acumulem no centro do poço, disperse as células movendo suavemente placas horizontal e verticalmente em um movimento norte-sul e leste-oeste. Certifique-se de que a placa mantenha contato com a prateleira da incubadora enquanto ela está sendo movida. Repita este movimento aos 15, 30, 45, 60 e 90 minutos depois de emplacamento dos hepatócitos eletroporados.
    8. Incubar as placas durante a noite a 37 °C.
    9. Remova o meio dos poços designados para análise de edição de genes 24 horas após o revestimento das células e substitua por sobreposição da matriz da membrana do porão de 0,25 mg/mL.
      NOTA: Se armazenado no congelador, transfira a matriz de membrana para 4 °C e deixe descongelar. Como a matriz de membrana do porão é sólida acima de 10 °C, é crucial que a matriz de membrana do porão permaneça no gelo ou a 4 °C até estar pronta para usar.

5. Calcule o volume da matriz de membrana para misturar com MM para dar uma concentração final de 0,25 mg/mL

NOTA: Para uma placa de 6 poços, é necessário 2 mL de sobreposição por bem.

6. Adicione o volume calculado da matriz de membrana ao mm gelado e misture por pipetar para cima e para baixo 10 vezes

  1. Pipeta a mistura de sobreposição lentamente em cima das células e coloque a placa de volta na incubadora de 37 °C.
  2. Substitua o meio por meio de manutenção fresco a cada 24 horas.
  3. Às 24 horas após o revestimento, transfira o meio condicionado do poço designado para ensaios MTT e albumina. Armazene o meio condicionado em um tubo de microfuge até que esteja pronto para executar o ensaio albumin. Prossiga para a etapa 7.1 para o ensaio MTT.
    NOTA: Armazene o meio condicionado a 4 °C para armazenamento a curto prazo (menos de um dia). Para maior armazenamento, armazene o meio a -80 °C.

7. Análise da eficiência de entrega, viabilidade e edição on-target em hepatócitos de camundongos eletroporados

  1. Medição de viabilidade usando ensaio MTT
    1. Prepare a solução de estoque MTT de 12 mM adicionando 1 mL de PBS a um frasco de 5 mg de MTT.
    2. Adicione 150 μL da solução de estoque MTT aos poços e incubar por 24 h.
    3. Após a incubação, adicione 1,5 mL de sulfato-cloridrato de sódio (SDS-HCl) para cada poço e, em seguida, pipeta para misturar.
    4. Incubar a placa por 4h a 37 °C e procurar uma mudança na cor do meio de claro para roxo para indicar células viáveis.
    5. Misture cada amostra novamente usando uma pipeta e leia a absorvância a 570 nm usando um leitor de microplacas.
    6. Calcule a viabilidade normalizada para amostras tratadas com Cas9 usando Eq (1):
      Equation 1 (1)
  2. Ensaio de albumina para avaliar a funcionalidade do hepatócito
    1. Transfira 50 μL do meio condicionado para os poços na placa fornecida pelo kit albumina. Cubra os poços e incubar por 2h em temperatura ambiente.
    2. Lave os poços 5x com 200 μL de tampão de lavagem.
    3. Inverta a placa para esvaziar cada poço em papel de tecido e bata algumas vezes.
    4. Após a lavagem, adicione 50 μL do anticorpo biotinínado fornecido no kit de ensaio de albumina a cada poço e incubar à temperatura ambiente por 1h.
    5. Repita as etapas 5.2.2-5.2.3 para lavar os poços.
    6. Adicione 50 μL de streptavidin-peroxidase fornecido no kit de ensaio de albumina para cada poço e incubar em temperatura ambiente por 30 minutos.
    7. Repita o passo 5.2.2.
    8. Adicione 50 μL do substrato de cromosgógo fornecido no kit de ensaio de albumina por poço e incubar por 30 minutos à temperatura ambiente. Toque suavemente na placa para garantir a mistura. Remova as bolhas de ar com uma ponta de pipeta.
    9. Por fim, adicione 50 μL de solução stop a cada poço e procure uma mudança de cor de amarelo para azul para indicar células funcionais.
    10. Prossiga imediatamente para ler a absorvância em 450 nm usando um leitor de microplacas.
  3. Estime a eficiência de entrega em poços eletroporados com eGFP mRNA.
    1. Capturar imagens de contraste de fase e fluorescência verde de hepatócitos 24 h após eletroporação. Tire três imagens em diferentes locais dentro do poço.
    2. Envie imagens das células para ImageJ. Na guia Imagem , selecione Tipo | 16 bits para converter imagem em escala de cinza.
    3. Para destacar estruturas celulares na imagem, sob a guia Imagem , selecione Ajustar | O limiar. Ajuste o controle deslizante para destacar as células.
    4. Na guia Processar , selecione Subtrair o fundo para remover o ruído de fundo.
    5. Conte as células clicando na guia Analisar e selecione Analisar partículas. Clique em Ok para gerar uma lista de partículas contadas.
    6. Calcule a porcentagem de células positivas de GFP dividindo o número de partículas contadas nas imagens de fluorescência verde pelo número de partículas contadas na imagem de contraste de fase correspondente.
  4. Análise da atividade cas9 on-target
    1. Extrair DNA genômico de células eletroporadas.
      1. Retire o meio da placa 3 dias após a eletroporação e adicione 500 μL de trippsina de 0,25%. Incubar a 37 °C por 5 min. Pipeta várias vezes após a incubação para garantir que os hepatócitos tenham se separado da placa.
      2. Transfira a suspensão celular experimentada para tubos de microcentrifuuge e gire em uma centrífuga de mesa a 800 × g por 10 minutos à temperatura ambiente. Depois de girar, examine os tubos em busca de pelotas.
      3. Remova o supernatante contendo trippsina por pipetação. Certifique-se de não perturbar a pelota. Resuspenque a pelota em 80 μL de solução de extração de DNA. Se a pelota for difícil de ver, resuspenque o conteúdo do tubo em 50 μL de solução de extração de DNA.
      4. Vórtice para 30 s para garantir que a pelota seja resuspendida. Transfira a suspensão para tubos de tira dividida PCR e coloque-os no cicloviário térmico. Corra por 15 min a 95 °C e 8 min a 68 °C.
    2. PCR-amplificar o lócus no alvo.
    3. Siga o procedimento descrito abaixo para amplificar a região alvo do Hpd usando polimerase de DNA.
      1. Prepare uma reação contendo 0,5 μL de 10 mM dNTPs, 0,5 μL de primer 10 μM Forward, 0,5 μL de primer reverso de 10 μM, 0,125 μL de polimerase Taq, 5 μL de DNA genômico extraído dos hepatócitos e 18,375 μL de água livre nuclease. Consulte a tabela suplementar S1 para obter sequências de primer.
      2. Brevemente vórtice e centrifugar rapidamente a mistura PCR para garantir que a solução esteja na parte inferior do tubo.
      3. Coloque a mistura de PCR em um cicloviário térmico e amplie nessas condições: 94 °C para 30 s para desnaturação, 30 ciclos de 94 °C para 30 s, 57 °C para 45 s para ressarnamento, 68 °C para 1 min e uma extensão final de 68 °C para 5 min.
        NOTA: A temperatura de ressarcial para a reação pcr varia dependendo da composição dos primers. Considere usar uma calculadora de temperatura de fusão antes de realizar o PCR.
      4. Para confirmar o tamanho correto do produto, misture 3 μL dos produtos PCR com 2 μL de água e 1 μL de corante de 6x. Execute com um gel de 1,5% de agarose e confirme o tamanho correto do produto.
    4. Purificar o DNA usando contas magnéticas.
      NOTA: As colunas de giro também podem ser usadas para limpeza do PCR. Abaixo estão os procedimentos para purificar produtos PCR usando contas magnéticas.
      1. Remova as contas magnéticas a partir de 4 °C e permita que elas atinjam a temperatura ambiente.
      2. Brevemente vórtice e centrifugar rapidamente a mistura PCR.
      3. Adicione um volume de contas iguais a 1,8× o volume da mistura PCR. Pipeta o mix pcr-contas 10x para garantir que a solução seja igualmente misturada.
      4. Incubar em temperatura ambiente por 10 minutos.
      5. Transfira a mistura pcr-contas para uma placa PCR e coloque-a em uma placa magnética.
      6. Incubar a placa no ímã por 5 minutos. Após os 5 minutos, verifique se a solução está clara, e as contas estão ligadas ao ímã antes de passar para o próximo passo.
      7. Descarte o supernatante.
      8. Adicione 200 μL de 70% de etanol ao poço e incubar por 30 s.
        NOTA: O etanol de 70% deve ser preparado pouco antes de realizar a limpeza para evitar a perda de DNA.
      9. Descarte o supernatante e repita o passo 7.4.4.8.
      10. Retire o supernaspe e deixe secar por 3 minutos à temperatura ambiente para remover vestígios de etanol.
      11. Retire a placa do ímã e adicione 22 μL de água à amostra. Pipeta para cima e para baixo 10x para misturar água e contas.
      12. Incubar as amostras por 3 minutos em temperatura ambiente.
      13. Transfira a placa de volta para o ímã e incubar por 3 minutos ou até que a solução esteja clara.
      14. Transfira 20 μL da amostra para um tubo PCR. Tome cuidado para que nenhuma conta seja levada.
    5. Sequência purificada amplicon de DNA por sanger sequenciamento.
    6. Envie arquivos de sequência .ab1 para amostras tratadas e de controle (não tratadas) para rastreamento de indels por Decomposição (TIDE)16 para quantificar indels no local alvo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isolamento de hepatócitos primários plateable do fígado
O processo global de perfusão hepática e isolamento hepatocito é ilustrado na Figura 1. Neste experimento, foram utilizados ratos C57BL6/6J de 8-10 semanas de idade. Espera-se que o procedimento produza 20-50 × 106 células por rato com uma viabilidade entre 85% e 95%. Se a viabilidade for <70%, o tratamento percoll deve ser seguido para remover células mortas. Hepatócitos recém-isolados devem ser banhados em placas de cultura tecidual revestidas de colágeno ou contendo nitrogênio. Dentro de 3-12 h de revestimento, espera-se que os hepatócitos aderam à placa, e a morfologia celular assume uma aparência típica poligonal ou hexagonal dentro de 24 h (Figura 2). Hepatócitos são as únicas células no fígado que armazenam glicose na forma de glicogênio. Para verificar a pureza das células isoladas, a coloração de glicogênio é realizada utilizando-se reagente ácido-Schiff periódico às 24 horas após o revestimento. O citoplasma dos hepatócitos manchados aparece magenta (Figura 3).

Eletroporação de RNPs CRISPR-Cas9 e mRNA em hepatócitos de rato isolados
Os hepatócitos de camundongos recém-isolados foram eletroporados com eGFP mRNA, Cas9 mRNA juntamente com sgRNA direcionado ao Hpd, ou proteína Cas9 complexada com Hpd-sgRNA (RNP). O Hpd-sgRNA foi quimicamente modificado com ligações de fosforotioato de 2′-O-metil para o primeiro e último três nucleotídeos consecutivos nas extremidades 5′ e 3′14. Estreptococo pyogenes Cas9 foi usado para experimentos. Os hepatócitos foram imageados 24 h após a eletroporação usando um microscópio de fluorescência, e a porcentagem de células GFP positivas foi contada nas imagens (Figura 4A). Em média, 89,8% [faixa 87,1%-92,4%] dos hepatócitos foram GFP-positivos. Aos 3 dias após a eletroporação, foram analisadas inserções e exclusões induzidas pelo Cas9 (indels) no lócus do Hpd utilizando-se a TIDE16. Os resultados mostram indels on-target de 47,4% em hepatócitos eletroporados com CRISPR-Cas9 mRNA e 78,4% indels para o Cas9 RNP (Figura 4B). Ensaios de MTT e albumina foram realizados para avaliar a viabilidade e funcionalidade do hepatocito após a eletroporação crispr-Cas9. Os resultados do MTT mostram viabilidade de 35,4% e 45,9% nos hepatócitos tratados com CRISPR-Cas9 mRNA e RNP, respectivamente (Figura 4C). Consistente com os resultados do MTT, os níveis de albumina normalizados foram de 31,8% em hepatócitos tratados com Cas9 mRNA e 34,5% para Cas9 RNP (Figura 4D).

Figure 1
Figura 1: Esquema do protocolo de perfusão e isolamento hepatocitado. Após a canulação da veia cava inferior, a veia portal é cortada, e as Soluções de Perfusão 1, 2 e 3 são bombeadas através do fígado. A cápsula hepática está rompida, e as células são liberadas usando um levantador de células. As células liberadas são tensas e centrifugadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Hepatócitos primários recém-isolados. Hepatócitos isolados de ratos C57BL/6J foram banhados em placas de 6 poços revestidos de colágeno com Hepatocyte Plating Media. Imagens tiradas às 24h após o revestimento. Barra de escala = 400 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Mancha de glicogênio. Hepatócitos de camundongos primários recém-isolados foram manchados para glicogênio para confirmar a pureza. A coloração foi feita usando o Reagente Schiff às 24 horas após o revestimento. Citoplasma dos hepatócitos manchados aparecem magenta. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Eletroporação de Crispr-Cas9 de mira de Hpd em hepatócitos primários recém-isolados. (A) Contraste de fase e imagens de microscopia de fluorescência verde de hepatócitos de camundongos recém-isolados a 24 h após a eletroporação. As imagens na linha superior são hepatócitos transfectados com eGFP mRNA e as imagens na linha inferior são hepatócitos de controle não transtraídos. Barras de escala = 400 μm. (B) Indels on-target para hepatócitos de rato eletroporados com Cas9 mRNA combinado com sgRNA ou RNP. (C) Viabilidade normalizada para hepatócitos de controle não transtrafetos em ensaio MTT a 24 h após a eletroporação. (D) Níveis de albumina em hepatócitos de controle não transtratodos medidos a 24 h após eletroporação(n = 3) com duas réplicas técnicas. A análise estatística foi realizada por testes t não realizados. Este número foi modificado de 14. Abreviaturas: Hpd = 4-hidroxifenylpyruvate dioxygenase; CRISPR = agrupamento regularmente interespaçado repetições palindômicas curtas; Cas9 = Proteína associada ao CRISPR 9; sgRNA = RNA guia único; RNP = ribonucleoproteína; INDEL = deserção-exclusão; MTT = 3-[4,5-dimetilthiazol-2-yl]-2,5 brometo de tetrazolium de difenil. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Solução de problemas para a perfusão hepática e protocolo de isolamento de hepatocitte. Esta tabela destaca problemas comuns encontrados durante o protocolo e sugere possíveis soluções. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Figura suplementar S1: Cavidade abdominal do rato durante a cirurgia. O cateter é inserido na veia cava inferior (ponto azul) antes dos ramos renais (não vistos). Abreviaturas: L = Fígado; K = Rim; I = Intestinos Pequenos. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Tabela Suplementar S1: Guia Cas9 e sequências de primer PCR. A sequência de guia e PAM para sgRNA visando o Hpd e as sequências de primer PCR para amplificação do Hpd. Abreviaturas: Hpd = 4-hidroxifenylpyruvate dioxygenase; CRISPR = agrupamento regularmente interespaçado repetições palindômicas curtas; Cas9 = Proteína associada ao CRISPR 9; sgRNA = RNA guia único; PAM = motivo adjacente protoespaço. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

As etapas descritas no protocolo para isolamento hepatócito são desafiadoras e exigem prática de proficiência. Existem vários passos-chave para o isolamento hepatócito bem sucedido do fígado. Em primeiro lugar, a canulação adequada da veia cava inferior é essencial para a perfusão hepática completa. A ausência de branqueamento no fígado após a perfusão indica deslocamento do cateter (Tabela 1). A veia cava inferior (perfusão retrógrada) foi cânulada no procedimento por ser mais simples e acessível que a veia portal (perfusão antegrada)17,18. Alguns protocolos usam suturas para proteger o cateter19; no entanto, as suturas complicam o processo. A sutura do cateter pode resultar em resultados indesejados, como o deslocamento do cateter e impossibilitar o ajuste de sua posição. Além disso, é possível realizar a cannulação no fígado sem remover a agulha, o que pode simplificar ainda mais a perfusão hepática. Conectar a bomba ao cateter é desnecessário com a agulha na veia. Além disso, há uma possibilidade reduzida de acidentalmente retirar o cateter e formar coágulos sanguíneos. Inserir apenas a ponta do cateter com um ângulo plano em relação à veia melhorou a canulação. A veia cava inferior tem vários ramos, então inserir o cateter no local errado causará perfusão em outra parte do corpo e não no fígado (Tabela 1). Assim, é vital colocar o cateter em um local que evite os galhos. A estrutura vascular variará ligeiramente entre diferentes camundongos; assim, é importante examinar as veias antes de cânular para determinar o melhor local para injetar o cateter. A farinha de fundo de sangue dentro do cateter depois de remover a agulha é uma excelente indicação de cannulação adequada. A canulação adequada também pode ser verificada procurando inchaço hepático quando a pressão é momentaneamente aplicada na veia portal (passo 1.3.13).

Ao isolar hepatócitos, o segundo passo crítico é reconhecer quando ocorreu a digestão completa do fígado. A qualidade e concentração da enzima são essenciais para a digestão adequada. Em contraste com os protocolos encontrados em 20,21, este protocolo sugere o uso do Liberase, composto por duas isoformas de colagenase, pois proporciona melhor consistência na atividade enzimática e variação reduzida em lote a lote do que a colagem regular22. Variações na qualidade e atividade da enzima digestiva podem causar inconsistências no isolamento. É essencial monitorar o fígado durante a digestão e parar a digestão imediatamente após o fígado ter suavizado. Um fígado digerido será flexível e mostrará uma perda de elasticidade verificada pela depressão do fígado usando fórceps ou cotonetes de algodão para confirmar que as recuos se formam sem que o tecido salte para trás. Neste protocolo, a quantidade máxima de solução Liberase recomendada por fígado é de 50 mL; um volume maior resultaria em superdigestão. Se a canulação for perfeitamente realizada, 30 mL da solução Liberase é suficiente para alcançar a digestão adequada. As etapas críticas finais do procedimento são as etapas de isolamento e lavagem. Depois de dissecar o fígado e transferi-lo para uma placa de Petri estéril contendo DMEM gelado com FBS, é crucial evitar cortar o fígado em pedaços. Nesta fase, use um levantador de células para liberar as células suavemente e maximizar a viabilidade celular. Inclinar o prato para submergir o fígado no DMEM facilita a liberação de células da cápsula em suspensão e deve ser feito lentamente e no gelo. Deve ser fácil interromper a cápsula do Glisson durante a etapa de liberação, e o meio deve ficar nublado e marrom. A dificuldade ao interromper a cápsula é um indicador de má digestão (Tabela 1).

Este protocolo é adequado para gerar altos níveis de edições CRISPR-Cas9 em hepatócitos de rato recém-isolados. Os indels gerados por Cas9 RNP e mRNA foram comparados no estudo. Níveis mais elevados de edição de genes foram observados em hepatócitos eletroporados com o Cas9 RNP do que mRNA, o que é consistente com os achados de outros estudos 14,23,24. A vantagem do Cas9 RNP sobre o mRNA é que ele fornece menor edição fora do alvo, uma vez que a proteína Cas9 existe na célula por períodos mais curtos do que mRNA23,24. Como a eficiência das sgRNAs varia de acordo com o design e o site-alvo, vários sgRNAs devem ser projetados e testados para a eficiência de edição no gene de interesse. Selecione o design de pontuação de maior especificidade ao escolher entre sgRNA ter alta eficiência genética. Se a edição de genes for consistentemente baixa, considere co-entregar um repórter, como o eGFP mRNA, para confirmar a entrega. Baixos níveis de células positivas do eGFP após a eletroporação podem indicar tampão de eletroporação expirado, problemas de dispositivos de eletroporação ou bolhas de ar na reação. Se houver um alto número de células positivas eGFP, mas baixa eficiência de edição, teste o design sgRNA em uma linha celular para confirmar a atividade de edição e ajuste as quantidades de Cas9 e sgRNA eletroporados em células. Por fim, considere o método utilizado para avaliar a atividade de edição. Ensaios baseados em gel, como O T7 Endonuclease I, podem sub-relatar a edição de genes devido à baixa sensibilidade para incompatibilidades de 1 bp no local do corte. O sequenciamento profundo é o método mais preciso para quantificar a edição de genes Cas9, particularmente para eventos de baixa edição em locais fora do alvo.

Outro aspecto desafiador do protocolo é a colheita de hepatócitos recém-isolados após a eletroporação. Os usuários devem manusear as células suavemente durante cada etapa do protocolo para obter hepatócitos viáveis e plateíveis após a eletroporação. Evite dispersar hepatócitos por vórtice; em vez disso, arrase o frasco contendo células suavemente até que as células fiquem resuspendidas. Ao transferir hepatócitos, use pontas de pipeta largas para manter a viabilidade. Incubar as cuvetas no gelo por 15 minutos após a eletroporação permite que a membrana celular se ressal e melhore a viabilidade. Após o revestimento, coloque a placa na incubadora e mova suavemente a placa horizontal e verticalmente em um movimento norte-sul e leste-oeste para garantir que os hepatócitos se dispersem uniformemente e mantenham a viabilidade celular. Se os hepatócitos não se apegarem à placa, considere aumentar o número de células para 1,3 × 106 na reação de eletroporação.

Uma aplicação promissora para o protocolo é a geração de modelos de mouse de IMDs humanos do fígado. Hepatócitos de camundongos que são positivos para a codificação genética para hidrolase fumarylacetoacetato (Fah) têm sido mostrados para enxercer eficientemente e repovoar o fígado após o transplante em camundongos fah-deficientes (Fah-/-)25. Uma nova abordagem para o desenvolvimento de modelos de camundongos de IMDs do fígado é eletroporar CRISPR-Cas9 em hepatócitos de camundongos selvagens para introduzir edições associadas a uma doença, seguida pelo transplante dos hepatócitos editados por genes em camundongos Fah/- . Os hepatócitos editados pelo Cas9 teriam uma vantagem seletiva natural após o transplante em comparação com as células nativas deficientes fah para repovoar o fígado.

Em conclusão, este protocolo equipa os usuários com a capacidade de isolar hepatócitos primários do fígado do rato, seguido pela edição de genes usando CRISPR-Cas9 mRNA e RNPs. O protocolo pode ser modificado para uso em diferentes cepas de camundongos para estudar vários tipos de doenças genéticas que afetam o fígado in vitro e in vivo e testar abordagens terapêuticas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm interesses concorrentes para divulgar.

Acknowledgments

A RNC recebeu financiamento do Centro de Bioengenharia da Carolina do Sul de Regeneração e Formação de Tecidos A bolsa piloto apoiada pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (NIGMS) dos Institutos Nacionais de Saúde, da Associação Americana para o Estudo das Doenças hepáticas e da Sociedade Americana de Terapia Genética & Celular sob os números de subvenção P30 GM131959, 2021000920, e 2022000099, respectivamente. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais da Sociedade Americana de Terapia Genética & Celular ou da Associação Americana para o Estudo das Doenças Hepáticas. O esquema para a Figura 1 foi criado com BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
0.2 mL PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, natural USA Scientific 1402-4700
6-well Collagen Plates Advanced Biomatrix 5073
accuSpin Micro 17R Fisher Scientific 13-100-675
All-in-one Fluorescent Microscope Keyence BZ-X810
Analog Vortex Mixer VWR 97043-562
ART Wide BORE filtered tips 1,000 µL ThermoFisher Scientific 2079GPK
Automated Cell Counter Bio-Rad Laboratories TC20
Blue Wax Dissection Tray Braintree Scientific Inc. DTW1 9" x 6.5" x 1/2"+F21
Cell scraper/lifter Argos Technologies UX-04396-53 Non-pyrogenic, sterile
Conical tubes (15 mL) Fisher Scientific 339650
Conical tubes (50 mL) Fisher Scientific 14-432-22
Cotton applicators Fisher Scientific 22-363-170
Curved scissors Cooper Surgical 62131
Disposable Petri Dishes Falcon 351029 100mm,sterile
Disposable Petri Dishes VWR 25373-100 35mm, sterile
Epoch Microplate Spectrophotometer BioTek Instruments 250082
Falcon Cell strainer (70 µm) Fisher Scientific 08-771-2
Forceps Cooper Surgical 61864 Euro-Med Adson Tissue Forceps
IV catheters  BD 382612 24 G x 0.75 in
IV infusion set Baxter 2C6401
MyFuge 12 Mini Centrifuge Benchmark Scientific 1220P38
Needles Fisher Scientific 05-561-20 25 G
Nucleofector 2b Device Lonza AAB-1001 Program T-028 was used for electroporation in mouse hepatocytes
Peristaltic Pump Masterflex  HV-77120-42 10 to 60 rpm; 90 to 260 VAC
Precision pump tubing Masterflex HV-96410-14 25 ft, silicone
Primaria Culture Plates Corning Life Sciences 353846 Nitrogen-containing tissue culture plates
Serological Pipets (25 mL) Fisher Scientific 12-567-604
Syringes BD 329464 1 mL, sterile
T100 Thermal Cycler Bio-Rad Laboratories 1861096
Water bath ALT 27577 Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 Series, 2.5 L
Reagents
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 IDT 1081058
Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL Fisher Scientific NC9959336
CleanCap Cas9 mRNA Trilink Biotechnologies L-7606-100
CleanCap EGFP mRNA Trilink Biotechnologies L-7201-100
Corning Matrigel Matrix Corning Life Sciences 356234
DMEM ThermoFisher Scientific 11885076 Low glucose, pyruvate
Ethanol 70% VWR 71001-652
Fetal bovine serum Thermoscientific 26140-079
Hepatocyte Maintenance Medium (MM) Lonza MM250
Hepatocyte Plating Medium (PM) Lonza MP100
Mouse Albumin ELISA Kit Fisher Scientific NC0010653
Mouse/Rat Hepatocyte Nucleofector Kit Lonza VPL-1004
OneTaq HotStart DNA Polymerase New England Biolabs M0481L
PBS 10x pH 7.4  Thermoscientific 70011-044 No calcium or magnesium chloride
Percoll (PVP solution) Santa Cruz Biotechnology sc-500790A
Periodic acid Sigma-Aldrich P7875-25G
Permount Mounting Medium VWR 100496-550
QuickExtract DNA Extraction Solution Lucigen Corporation QE05090
Schiff’s fuchsin-sulfite reagent Sigma-Aldrich S5133
Trypsin-EDTA (0.25%) ThermoFisher Scientific 25200056 Phenol red
Vybrant MTT Cell Viability Assay ThermoFisher Scientific V13154
Perfusion Solution 1 (pH 7.4, filter sterilized)  Stable at 4 °C for 2 months
EBSS Fisher Scientific 14155063 Complete to 200 mL
EGTA (0.5 M) Bioworld 40520008-1 200 µL
HEPES (pH 7.3, 1 M) ThermoFisher Scientific AAJ16924AE 2 mL 
Perfusion Solution 2 (pH 7.4, filter sterilized)  Stable at 4 °C for 2 months
CaCl2·2H20 (1.8 mM) Sigma C7902-500G 360 µL of 1 M stock 
EBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red) Fisher Scientific 14-155-063 Complete to 200 mL
HEPES (1 M) ThermoFisher Scientific AAJ16924AE 2 mL 
MgSO4·7H20 (0.8 mM) Sigma 30391-25G 160 µL of 1 M stock
Perfusion Solution 3  Prepared fresh prior to use
Solution 2 50 mL
Liberase Roche 5401127001 0.094 Wunsch units/mL
Mouse Anesthetic Cocktail 
Acepromzine 0.25 mg/mL final concentration
Ketamine 7.5 mg/mL final concentration
Xylazine 1.5 mg/mL final concentration
Software URL
Benchling https://www.benchling.com/
ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/
TIDE: Tracking of Indels by Decomposition https://tide.nki.nl/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pampols, T. Inherited metabolic rare disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 686, 397-431 (2010).
  2. Saudubray, J. M., Sedel, F., Walter, J. H. Clinical approach to treatable inborn metabolic diseases: an introduction. Journal of Inherited Metabolic Disease. 29 (2-3), 261-274 (2006).
  3. Arnon, R., et al. Liver transplantation in children with metabolic diseases: the studies of pediatric liver transplantation experience. Pediatric Transplantation. 14 (6), 796-805 (2010).
  4. Maiorana, A., et al. Preemptive liver transplantation in a child with familial hypercholesterolemia. Pediatric Transplantation. 15 (2), 25-29 (2011).
  5. OPTN/SRTR 2019 Annual Data Report: Liver. , Available from: https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2019/Liver.aspx (2019).
  6. Fabris, L., Strazzabosco, M. Rare and undiagnosed liver diseases: challenges and opportunities. Translational Gastroenterology and Hepatology. 6, (2020).
  7. Haugabook, S. J., Ferrer, M., Ottinger, E. A. In vitro and in vivo translational models for rare liver diseases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1865 (5), 1003-1018 (2019).
  8. Xue, Y., et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the notch ligand Jagged1. Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).
  9. Lima, A., Maddalo, D. SEMMs: Somatically engineered mouse models. a new tool for in vivo disease modeling for basic and translational research. Frontiers in Oncology. 11, 1117 (2021).
  10. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  11. Ye, L., et al. Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Delta32 mutation confers resistance to HIV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (26), 9591-9596 (2014).
  12. Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons. PLoS One. 9 (8), 105584 (2014).
  13. Hoban, M. D., et al. CRISPR/Cas9-mediated correction of the sickle mutation in human CD34+ cells. Molecular Therapy. 24 (9), 1561-1569 (2016).
  14. Rathbone, T., et al. Electroporation-mediated delivery of Cas9 ribonucleoproteins results in high levels of gene editing in primary hepatocytes. The CRISPR Journal. , (2022).
  15. Benchling [Biology Software]. , Available from: https://benchling.com (2022).
  16. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
  17. Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
  18. Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475 (7356), 386-389 (2011).
  19. Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
  20. Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).
  21. Kim, Y., et al. Three-dimensional (3D) printing of mouse primary hepatocytes to generate 3D hepatic structure. Annals of Surgical Treatment and Research. 92 (2), 67-72 (2017).
  22. Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
  23. Lattanzi, A., et al. Optimization of CRISPR/Cas9 delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells for therapeutic genomic rearrangements. Molecular Therapy. 27 (1), 137-150 (2019).
  24. Dever, D. P., et al. CRISPR/Cas9 beta-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells. Nature. 539 (7629), 384-389 (2016).
  25. Grompe, M. Hereditary Tyrosinemia: Pathogenesis, Screening and Management. Tanguay, R. M. , Springer International Publishing. 215-230 (2017).

Tags

Bioengenharia Edição 184
Entrega mediada por eletroporação de cas9 ribonucleoproteínas e mRNA em hepatócitos de rato primário recém-isolados
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rathbone, T., Ates, I., Stuart, C.,… More

Rathbone, T., Ates, I., Stuart, C., Parker, T., Cottle, R. N. Electroporation-Mediated Delivery of Cas9 Ribonucleoproteins and mRNA into Freshly Isolated Primary Mouse Hepatocytes. J. Vis. Exp. (184), e63828, doi:10.3791/63828 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter