Artigo de método

Medição das Taxas de Rotatividade de Proteínas em Células Cultivadas Senescentes e Não-Divisórias com Rotulagem Metabólica e Espectrometria de Massa

6K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/63835

⸱

6 de abril de 2022

 ,  , 
1Laboratory of Genetics and Genomics, National Institute on Aging Intramural Research Program, National Institutes of Health, 2Translational Gerontology Branch, National Institute on Aging Intramural Research Program, National Institutes of Health

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve o fluxo de trabalho para rotulagem metabólica de células senescentes e não-divisórias com SILAC pulsado, análise de espectrometria de massa não-alvo, e um cálculo simplificado de meias-vidas proteicas.

Resumo

Evidências crescentes mostraram que o acúmulo de células senescentes no sistema nervoso central contribui para distúrbios neurodegenerativos como Alzheimer e Doenças de Parkinson. Senescência celular é um estado de prisão permanente do ciclo celular que normalmente ocorre em resposta à exposição a estresses sub-letais. No entanto, como outras células não-divisórias, as células senescentes permanecem metabolicamente ativas e realizam muitas funções que requerem demandas transcricionais e translacionais únicas e mudanças generalizadas nos proteomes intracelulares e secretados. Entender como as taxas de síntese e decadência das proteínas mudam durante a senescência pode iluminar os mecanismos subjacentes da senescência celular e encontrar potenciais caminhos terapêuticos para doenças exacerbadas por células senescentes. Este artigo descreve um método para avaliação em escala proteome de meia-vidas proteoma em células não-divisórias usando rotulagem de isótopos estáveis pulsados por aminoácidos na cultura celular (pSILAC) em combinação com espectrometria de massa. pSILAC envolve rotulagem metabólica de células com versões de isótopos pesados estáveis contendo aminoácidos. Juntamente com as abordagens modernas de espectrometria de massa, o pSILAC permite a medição do volume de negócios proteicos de centenas ou milhares de proteínas em misturas complexas. Após a rotulagem metabólica, a dinâmica de volume de negócios das proteínas pode ser determinada com base no enriquecimento relativo de isótopos pesados em peptídeos detectados pela espectrometria de massa. Neste protocolo, um fluxo de trabalho é descrito para a geração de culturas de fibroblastos senescentes e fibroblastos quiescentes da mesma forma presos, bem como um ponto simplificado, um único ponto de rotulagem de tempo-curso que maximiza a cobertura das taxas de rotatividade de proteínas previstas. Além disso, é apresentado um pipeline para análise dos dados de espectrometria de massa do pSILAC e cálculo fácil de usar das taxas de degradação de proteínas usando planilhas. A aplicação deste protocolo pode ser estendida além das células senescentes para quaisquer células cultivadas não-divisórias, como neurônios.

Introdução

A senescência foi identificada pela primeira vez como um estado de prisão por crescimento indefinido exibida por células primárias cultivadas após atingir a exaustão replicativa1. Desde então, foi demonstrado que a senescência pode surgir em resposta a numerosos insultos celulares, incluindo tensões genotoxilicas, mitocondriais e oncogênicas, entre outros2. Embora a senescência tenha vários papéis fisiologicamente importantes, como supressão de tumor e cicatrização de feridas, o acúmulo de células senescentes durante o envelhecimento está associado a uma série de efeitos deletérios na saúde3, incluindo várias condições neurodegenerativas 4,5,6. A senescência celular ocorre em múltiplos tipos de células cerebrais, incluindo neurônios 7,8,9,10, astrócitos11, microglia 12 e precursores do oligodendrocyte13, e contribui para neurodegeneração e disfunção cognitiva. Os oligômeros beta amiloides, uma das marcas da doença de Alzheimer14, têm sido mostrados para acelerar a senescência neuronal 13,15,16. Um aumento da prevalência de células senescentes também tem sido associado à doença de Parkinson17, especialmente decorrente de estressores ambientais11,18. É importante ressaltar que a eliminação seletiva de células senescentes em modelos pré-clínicos prolonga a vida útil e mitiga uma infinidade de doenças relacionadas à idade 3,5,12 e melhora os déficits cognitivos 8,11,12,13. As células senescentes emergiram, portanto, como alvos terapêuticos promissores para o tratamento de muitas condições relacionadas à idade.

Grande parte do efeito prejudicial das células senescentes é causada pelo fenótipo secreto associado à senescência (SASP), uma mistura complexa de moléculas bioativas secretadas por células senescentes que podem causar inflamação local, angiogênese, destruição da matriz extracelular e propagação da senescência no tecido circundante 19,20,21 . O SASP também representa um interessante fenômeno biológico de senescência porque requer um considerável esforço transcricional e translacional durante um estado de prisão do ciclo celular. De fato, as células senescentes têm mostrado uma diminuição na biogêneseribosa 22,23,24 que deve reduzir a síntese proteica. Em vez disso, as células senescentes traduzem robustamente algumas proteínas, particularmente fatores SASP, e influenciam o metabolismo do tecido circundante25. Assim, há um interesse considerável em entender como as células senescentes submetidas a uma parada permanente do ciclo celular continuam a manter a homeostase proteica e, ao mesmo tempo, expressam robustamente os fatores SASP e outras proteínas selecionadas.

Este método descreve como usar espectrometria de massa e rotulagem de isótopos pulsados-estáveis por aminoácidos na cultura celular (pSILAC) para medir globalmente as meias-vidas de proteínas em células senescentes em uma escala proteome-em toda a escala. No SILAC tradicional, as células cultivadas são completamente metabolicamente rotuladas com isótopos pesados e leves não radioativos de aminoácidos para análise a jusante da abundância de proteínas. Este método foi previamente aplicado para avaliar as mudanças de abundância de forma abrangente e quantitativa no SASP dos fibroblastos cultivados26. No pSILAC, as células são metabolicamente rotuladas com um pulso de isótopo pesado que segue a pré-rotulagem com isótopo leve, e depois colhidas em intervalos de tempo ou mais. As taxas de incorporação de isótopos pesados em referência ao isótopo leve pré-existente são então utilizadas para calcular taxas relativas de rotatividade de proteínas. Geralmente, isótopos de arginina e liseina são usados porque a trypsin se corta nesses resíduos; assim, todos os peptídeos da digestão padrão conterão potencialmente o rótulo pesado. Pares de peptídeos que diferem apenas pela presença ou ausência de lisetopesina ou arginina são quimicamente idênticos e podem ser diferenciados e quantificados por um espectrômetro de massa. Após a análise da espectrometria de massa, os peptídeos podem ser identificados como recém-sintetizados ou pré-existentes com base na presença ou ausência do rótulo isotópico nas identificações de peptídeos resultantes. As taxas de rotatividade de proteínas podem então ser determinadas montagem da razão de peptídeos leves (13 C-15 N)para uma determinada proteína a modelos cinéticos para crescimento exponencial ou decadência27,28. o pSILAC tem sido usado em várias comparações das taxas de rotatividade de proteínas 29,30,31,32 e é atualmente o método mais abrangente e de alto rendimento para a medição de meias-vidas proteicas.

Este protocolo detalha a preparação de células senescentes em paralelo com células quiescentes presas em crescimento semelhante na cultura, seguidas pela rotulagem metabólica com pSILAC. As células são então colhidas, homogeneizadas em lises e processadas para aquisição e análise de espectrometria de massa. Os dados obtidos a partir da espectrometria de massa são então usados para determinar meias-vidas proteicas usando um método quantitativo simplificado empregando um único ponto de tempo e cálculos de meia-vida realizados em uma planilha. Usando essa abordagem, as estimativas de meia-vida proteica podem ser medidas de forma abrangente e quantitativa que seja mais autêntica às condições celulares não perturbadas do que protocolos que usam bloqueadores de síntese proteica ou rotatividade.

Protocolo

1. Preparação de células quiescentes e células senescentes pela exposição à radiação ionizante (IR)

NOTA: A senescência celular e a quiescência podem ser induzidas usando múltiplos métodos, conforme descrito em detalhes em outros lugares 33,34,35. Os estímulos utilizados para induzir senescência e quiescência podem depender do tipo de interesse celular e da questão biológica em investigação. As células utilizadas neste estudo estão disponíveis comercialmente.

  1. Descongele os fibroblastos diploides humanos IMR-90 (~1 x 106 células) de uma criovial e emplaque-os em 20 mL de DMEM suplementados com 10% de soro bovino fetal (FBS) (Tabela 1) em uma placa de 150 mm.
  2. Cresça as células em condições fisiológicas de oxigênio (3% O2, 5% CO2, 37 °C) e expanda as culturas em mídia contendo 10% de FBS até que sejam estabelecidas réplicas suficientes para células quiscentes e senescentes (pelo menos 3-5 réplicas são recomendadas por condição).
    NOTA: O oxigênio fisiológico (3%) é ideal para células primárias do fibroblasto humano, mas as condições de cultura adequadas para outros tipos de células podem variar e devem ser determinadas caso a caso.
  3. Gerar células senescentes expondo células proliferadoras a 15 cinzas (Gy) de radiação ionizante (IR).
    NOTA: A intensidade da exposição à radiação pode variar de acordo com o tipo celular. Enquanto 15 Gy é usado aqui, 10 Gy também é uma dose de radiação comumente usada para fibroblastos; outras células, como monócitos, podem exigir uma dose tão baixa quanto 5 Gy. A dose é geralmente determinada empiricamente pela pesar a viabilidade contra a indução da senescência.
    1. Expor as células a 40%-60% de confluência ao IR em mídia contendo 10% de FBS.
    2. Após a exposição ao IR, mude para mídia fresca contendo 10% de FBS.
    3. Change media (20 mL, contendo 10% FBS) a cada 2 dias durante 8 dias.
      NOTA: As células são expostas ao IR em menor confluência porque as células tratadas com IR se expandirão na cultura antes de pararem de crescer. Neste experimento, as células não eram células divididas durante o estabelecimento da senescência, e embora se tornassem mais confluentes, elas ainda exibiam marcadores celulares senescentes na colheita. Nos fibroblastos, o fenótipo senescente se desenvolve dentro de 7-10 dias.
  4. Gerar células de controle quiescentes alterando a mídia em células de proliferação banhadas para mídias contendo 0,2% FBS (fome de soro) (Tabela 1).
    1. Continuar cultivando células que serão usadas para o controle de quiescência em mídias contendo 10% de FBS até o dia 4 após células senescentes serem expostas ao IR, dividindo-se quando necessário.
    2. No dia 4 após o IR, mude a mídia de células quiescentes para 20 mL de mídia contendo 0,2% de FBS (Tabela 1) e continue crescendo por mais 6 dias, mudando a mídia a cada 2 dias.
      NOTA: Mesmo em meios que contenham 0,2% de FBS, os fibroblastos continuarão a crescer um pouco e podem parecer confluentes até o final da safra. Como regra geral, visam coletar células quiescentes quando atingirem confluência semelhante à das culturas celulares senescentes.

2. Rotulagem de células para SILAC pulsado e colheita de lises

  1. Altere a mídia em células senescentes e quiescentes (12 placas) para SILAC Light (Tabela 1) e cresça por 2 dias.
    NOTA: Esta rotulagem ajuda a reduzir o ruído de fundo, uma vez que há uma baixa abundância natural de 13C e 15N. Esta etapa pode ser ignorada em condições limitantes de reagentes, mas resultará em uma ligeira superestimação de uma nova síntese proteica.
  2. Substitua a mídia por SILAC DMEM (Tabela 1) para rotulagem metabólica.
    NOTA: As mídias SILAC DMEM são especialmente formuladas para conter isótopos puramente leves ou pesados de arginina e liseina para rotulagem metabólica. Eles não devem ser substituídos por formulações DMEM padrão em subpassos 2.2.1 ou 2.2.2.
    1. Para três placas senescentes e três quiescentes, substitua a mídia por 30 mL de SILAC Light (Tabela 1) e cresça por 3 dias sem alterar a mídia.
    2. Por um mínimo de três placas senescentes e três quiescentes, substitua a mídia por 30 mL de SILAC Heavy (Tabela 1) e cresça por 3 dias sem alterar a mídia.
      NOTA: Há uma opção neste momento de colher quais serão as células rotuladas pela luz imediatamente, em vez de rotulá-las por mais 3 dias. Para um único ponto de tempo, é preferível rotular células pesadas e levemente pelo mesmo período que é feito neste protocolo para minimizar os efeitos em lote.
  3. Retire as células das placas de cultura adicionando 5 mL de reagente de trippsina pré-aquecido a cada prato e incubando por 5 min a 37 °C.
  4. Resuspende as células separadas em 5 mL da mesma mídia usada para cultura (silac light ou SILAC Heavy) a um volume total de 10 mL.
  5. Colher as células para extração de lises e validação de marcadores de senescência.
    1. Para cada suspensão, alíquota de 0,6 x 106 de células em 2 mL de mídia contendo 0,2% FBS em um prato de 6 poços (dois pratos, um para células cultivadas SILAC Light e um para células cultivadas SILAC Pesada) e coloque a 37 °C para incubação durante a noite.
      NOTA: Estas placas (substep 2.5.1) serão utilizadas para a detecção da atividade β-galactosidase associada à senescência (SA-βGal) (etapa 3.1).
    2. Para cada suspensão, alíquota de 1 x 106 de células em um tubo de microcentrifuuge e gire para baixo em uma centrífuga de mesa a velocidade máxima por 1 min. Remova o supernatante e resuspense a pelota em 1 mL de fenol; Nesta etapa, o RNA pode ser totalmente purificado, conforme descrito no manual do fornecedor de fenol ou armazenado a longo prazo a -80 °C.
      ATENÇÃO: O fenol é corrosivo e deve ser manuseado exclusivamente em um capô com luvas e um jaleco.
      NOTA: O RNA extraído será usado para a detecção de fatores SASP de codificação mRNAs utilizando transcrição reversa (RT) seguido de análise PCR (Q) (RT-qPCR) em tempo real (TR-qPCR). Outro ensaio confiável para indução de senescência é um teste para incorporação de uridina dihidroxy 5 (EdU), que indica a presença de células proliferadoras. A ausência de proliferação pode ser usada para confirmar quiescência e senescência.
    3. Transfira as células restantes para o gelo e gire para baixo a 300 x g e 4 °C.
  6. Remova o supernasciente e lave as células duas vezes em 1 mL de PBS frio para remover a contaminação da mídia/trippsina e proteína exógena do soro bovino fetal do meio cultural.
  7. Gire as células novamente, remova o sobrenante e prossiga para a lise.
  8. Resuspengem as pelotas de célula em 150 μL de 8 M ureia 50 mM de biocarbonato de lysis buffer (Tabela 1), e misture por pipetação para cima e para baixo.
  9. Sonicar os lises em um sônico de água por 2,5 min com 30 s on/off em potência média a 4 °C.
  10. Transfira os lises para um bloco de calor pré-aquecido de 95 °C e desnatura por 4 min.
  11. Girar para baixo os lysates; Os lises agora podem ser armazenados a -80 °C ou usados imediatamente para quantificação.
  12. Faça um estoque de 30 μL de diluições de 1:10 para cada lise em Lysis Buffer.
  13. Meça a concentração de proteína com o Kit de Ensaio BCA usando uma curva padrão preparada em 1/10x Lysis Buffer diluída em ddH2O. As lysates agora podem ser armazenadas a -80 °C indefinidamente.

3. Validação da senescência pela atividade de β-Galactosidase (SA-βGal) associada à senescência e análise RT-qPCR de mRNAs associadas à senescência

NOTA: O material de partida para essas etapas é coletado durante a etapa 2.5

  1. A partir das placas de 6 poços que foram configuradas na subjunção 2.5.1, analise as células para a atividade SA-βGal usando o kit de coloração Senescence β-Galactosidase seguindo o protocolo do fabricante. Visualize a coloração sob campo brilhante com a cor habilitada, como descrito anteriormente36.
    NOTA: O SA-βGal é quantificado comparando a porcentagem de células positivas (cor azul visível) em condições de controle senescente versus quiescente. Um mínimo de 70% das células devem ser SA-βGal positivo para confirmação bem sucedida da senescência. As células de controle quiescentes devem ser menos de 10% positivas para SA-βGal.
  2. Extrair o RNA da suspensão do fenol (subcamada 2.5.2) e analisar usando RT-qPCR para aumentar os níveis de mRNAs codificando fatores SASP (IL6, CXCL8, IL1B), marcadores de ciclo celular (CDKN2A/p16, CDKN1A/p21) e outros indicadores de senescência (perda de LMNB1 e PCNA).
    NOTA: O RNA é instável e deve, portanto, ser manuseado com equipamentos sem RNase, luvas frescas e no gelo, a menos que seja observado de outra forma no protocolo.
    1. A partir da suspensão do fenol, adicione 200 μL de clorofórmio por 1 mL de fenol e gire a 12.000 x g por 15 min a 4 °C.
    2. Remova cuidadosamente a fase aquosa e adicione 1:1 volume de isopropanol, 15 μg de co-precipitante glicogênio e, em seguida, incubar a 4 °C por 10 minutos para precipitar o RNA.
    3. Após a incubação, pelota o RNA por centrifugação a 12.000 x g para 20 min a 4 °C seguido por uma lavagem em 75% EtOH igual a 1 volume de fenol utilizado. Resuspend o RNA em 50 μL de água destilada sem nuclease; O RNA pode ser armazenado a -80 °C indefinidamente.
    4. Às amostras de RNA, adicione 38 μL de água destilada sem nuclease, 10 μL de tampão de reação DNAse de 10x e 2 μL de DNase I seguido por mistura.
      NOTA: Gerar uma mistura comum de todos os reagentes na subpassa 3.2.3 multiplicada pelo número de amostras para tratamento para distribuição igualitária às amostras é a melhor prática.
    5. Incubar amostras de RNA tratadas com DNase I a 37 °C por 30 min.
    6. Remova o DNase das amostras usando 1 volume de uma mistura de álcool fenol/clorofórmio/isoamila (25:24:1) mistura por vórtice e fiação a velocidade máxima em uma centrífuga de mesa por 5 min; o RNA será contido na fase aquosa.
    7. Repita os subpassos 3.2.2 e 3.2.3 para precipitar o RNA. Resuspend em 20 μL de água destilada sem nuclease; O RNA pode ser armazenado a -80 °C indefinidamente.
    8. Gerar cDNA a partir de RNA purificado incubando 0,5-1,0 μg de RNA purificado com 200 U de transcriptase reversa, 100 primers aleatórios pMol e 10 mM de uma mistura dNTP em 1x tampão de reação fornecido com a transcriptase reversa; incubar por 10 min a 25 °C, depois para 30 min a 50 °C, com uma etapa final de inativação a 85 °C por 5 min.
    9. Analisar o cDNA a partir da etapa RT (subcaminho 3.2.3) do controle quiescente e células senescentes usando células em tempo real, análise quantitativa (q) PCR para avaliar o nível de marcadores de mRNA conhecidos por serem aumentados (CDKN2A/p16, CDKN1A/p21, IL1B, IL6 e CXCL8 mRNAs) ou diminuídos (LMNB1 e PCNA mRNAs) com senescência conforme descrito em outros lugares. ACTB mRNA, codificando a proteína de limpeza β-Actin, é muitas vezes um bom mRNA para normalizar diferenças no material de entrada. Os primers usados estão na Tabela 2.
      NOTA: A análise relativa do RT-qPCR depende de suposições de eficiência de ligação igual entre os pares de primer de destino e um par de primer de referência. Essas suposições devem ser testadas para novos conjuntos de primer como detalhados em outros lugares37. Além disso, os marcadores de referência devem ser constantes entre os tipos de células que estão sendo comparados, e várias opções adicionais para células senescentes foram previamente identificadas38.

4. Digestão de trippsina na solução

NOTA: A partir deste ponto, é fundamental usar tampões de grau de espectrometria de massa, solventes e produtos químicos para evitar interferências de impurezas durante a análise de espectrometria de massa. Todos os tampões devem ser compostos de ingredientes adequados à análise de espectrometria de massa cromatografia líquida, incluindo água e acetonitrilo. Consulte a Tabela de Materiais para obter uma lista de produtos químicos e solventes adequados.

  1. Alíquota de 50 μg de cada amostra de proteína em novos tubos e traz a volumes iguais com Lysis Buffer.
  2. A cada amostra, adicione DTT a uma concentração final de 20 mM para reduzir as ligações de dissulfeto.
  3. Incubar as amostras a 37 °C por 30 minutos com agitação e, em seguida, permitir que as amostras esfriem à temperatura ambiente (RT, ~10 min).
  4. Adicione iodoacetamida a uma concentração final de 40 mM para alardear irreversivelmente os grupos sulfhydryl que foram reduzidos na etapa anterior. Incubar as amostras em RT no escuro por 30 minutos.
  5. Diluir cada amostra para abaixo de 1 M Ureia com um buffer composto de 50 mM de bicarbonato de amônio. Verifique se o pH é aproximadamente 8 por pipetar uma pequena quantidade de amostra em tiras de pH.
  6. Adicione 1 μg de trippsina a cada amostra por 50 μg de proteína inicial, ou em 1:50 razão de trippsina:proteína, por massa, se digerindo uma quantidade de proteína diferente. Por exemplo, 3 μg de trippsina seriam adicionados para a digestão de 150 μg de proteína.
  7. Incubar as amostras durante a noite a 37 °C com agitação para digerir proteínas em peptídeos.
  8. Adicione ácido fórmico a 1%, em volume, de cada amostra para saciar a digestão proteica.
    NOTA: O experimento pode ser pausado aqui. Congele as amostras a -80 °C e continue para o próximo passo em uma data posterior, se necessário.

5. Limpeza de amostras com extração em fase sólida (SPE)

NOTA: Este protocolo de extração em fase sólida requer cartuchos de extração em fase sólida e uma configuração de coletor de vácuo. Outros protocolos equivalentes de extração em fase sólida (SPE) podem ser realizados a critério do pesquisador antes da análise da espectrometria em massa.

  1. Prepare-se para a SPE colocando cartuchos de extração em fase sólida em um coletor de vácuo, usando um cartucho de extração para cada amostra.
    NOTA: Consulte as diretrizes do fabricante para a quantidade de sorbent a ser utilizada no protocolo SPE. Para 50 μg de amostras de peptídeos, recomenda-se o uso de cartuchos sorbent de 10 mg.
  2. Condicionar cada cartucho de SPE adicionando 800 μL de Buffer de Elução SPE (Tabela 1) e use sucção a vácuo para desenhar o solvente através do cartucho.
  3. Repita o passo 5.2.
  4. Equilibre cada cartucho adicionando 800 μL de tampão de lavagem SPE (Tabela 1) e use sucção de vácuo para desenhar o buffer através dos cartuchos.
  5. Repita a etapa 5.4 duas vezes adicionais para um total de três vezes.
  6. Carregue as amostras de peptídeos em cartuchos SPE e use sucção a vácuo para extrair amostras através dos cartuchos.
    NOTA: Neste ponto, os peptídeos estão ligados ao sorbent dentro dos cartuchos.
  7. Lave cada cartucho com buffer de lavagem SPE e use sucção de vácuo para desenhar o buffer através dos cartuchos.
  8. Repita a etapa 5.7 duas vezes adicionais para um total de três lavagens.
  9. Antes da etapa de eluição, organize os tubos de coleta dentro do coletor de vácuo abaixo de cada cartucho, garantindo cuidadosamente o alinhamento entre os tubos de coleta e os cartuchos.
  10. Aos peptídeos elutos, adicione 800 μL de tampão de eluição SPE a cada cartucho e peptídeos elutos em tubos de coleta com sucção a vácuo.
  11. Repita o passo 5.10 com 400 μL de Buffer de Elução SPE.
  12. Remova as amostras de peptídeos do coletor de vácuo e seque completamente em um concentrador de vácuo (a secagem leva aproximadamente 3 h).
    NOTA: O experimento pode ser pausado aqui. Congele as amostras a -80 °C e continue em uma data posterior, se necessário.

6. Análise de espectrometria de massa de aquisição dependente de dados (DDA)

  1. Resuspend as amostras de peptídeos a uma concentração de 400 ng/μL em um buffer composto de ácido fórmico de 0,2% na água.
  2. Para auxiliar na ressubilização dos peptídeos, o vórtice das amostras por 5 minutos. Em seguida, sonicar as amostras por 5 minutos em um sônico de banho de água.
  3. Pellet quaisquer materiais insolúveis por centrifugação amostras a 15.000 x g por 15 min a 4 °C. Transfira os supernantes peptídeos para frascos de MS.
  4. Adicione os padrões de peptídeo indexado (iRT) de escolha a cada amostra em uma concentração de 1:30 iRT:sample, por volume.
  5. Submeta as amostras para análise proteômica utilizando a análise de espectrometria de massa de tandem líquido-cromatografia (LC-MS/MS).
    1. Use as configurações LC-MS/MS recomendadas para análise não-fixada pela instalação de espectrometria de massa. As configurações de exemplo para análise são mostradas na Figura 3, configurada para análise em um espectrômetro de massa Orbitrap acoplado a um sistema de cromatografia nano líquida no modo nano-fluxo. Segue-se um protocolo de exemplo.
    2. Carregue 1 μg (5 μL) de cada amostra em uma coluna de armadilha (1 cm de comprimento x 100 μm de diâmetro) e lave-os com solvente de carregamento (tabela 1) a uma taxa de fluxo de 10 μL/min por 5 min.
    3. Carregue as amostras em uma coluna analítica (50 cm de comprimento x 100 μm de diâmetro) com uma taxa de fluxo de 400 nL/min.
    4. Elute os peptídeos sobre um gradiente linear de 90 minutos com um solvente orgânico (0,2 % ácido fórmico e 99,8% de acetonitrilo) e solvente inorgânico (0,2% ácido fórmico em 99,8% de água), variando de 5% a 35% de solvente orgânico.
    5. Adquira dados de espectrometria em massa no modo dependente de dados com um ciclo contínuo de varreduras de pesquisa MS1 (resolução de 60.000, 3e6 Meta AGC, tempo máximo de acumulação de 100 ms e 400-1.600 m/z de massa) seguido por 20 varreduras MS2 dependentes de dados (resolução de 15.000, meta de 1e5 AGC, tempo máximo de injeção de 25 ms e 1,6 m/z de isolamento de largura) com fragmentação de HCD (energia de colisão normal de 27%).
  6. Após a aquisição de todas as amostras em MS, importe arquivos de espectrometria de massa bruta em uma ferramenta de software de análise de proteômica de espectrometria de massa para identificação e quantificação de áreas de pico de peptídeos.
    NOTA: Para a identificação de peptídeos e proteínas neste experimento, a ferramenta de pesquisa de banco de dados mascote foi utilizada com o banco de dados de sequência de proteome humano uniprot revisado (Proteome ID: UP000005640). Os seguintes parâmetros de pesquisa foram especificados no Mascote:
    • Quantitação: SILAC K+8 R+10 [MD] Enzima: Trypsin/p Modificação fixa: carbamidomethyl (C)
    • Modificações variáveis: acetil (Protein N-term), Gln->pyro-Glu (N-term Q), Oxidação (M), Rótulo:13C(6)15N(2) (K), Rótulo:13C(6)15N(4) (R)
    • Tolerância à massa de peptídeos: 10 ppm
    • Tolerância em massa de fragmentos: 0.08 Da
    • Max errou decotes: 2
    • Todos os parâmetros não especificados eram padrão
  7. Quantifique as áreas de pico de peptídeos para peptídeos pesados e leves na ferramenta de software de quantitação proteome. Para a quantificação das áreas de pico neste experimento, a plataforma de software Skyline de código aberto e livre foi utilizada39,40. Exportar áreas de pico de peptídeos pesados e leves para estimativa de meias-vidas proteicas.

7. Cálculo de meia-vidas proteicas

  1. Abra a pasta de trabalho de análise SILAC (Tabela 3) para a primeira folha denominada 1) Dados Brutos e cole em IDs UniProt, nomes de genes, áreas de pico pesado e áreas de pico de luz nas colunas indicadas (SH = Senescent-Heavy, SL = Senescent-Light, CH = Control (quiescente)-Heavy, CL = Control (quiescent)-Light).
  2. Abra as folhas 2-4 e garanta que as colunas UniProt ID e Gene correspondam ao número de proteínas identificadas a partir da análise (esses experimentos identificaram 841 proteínas). O resto das colunas se encherão automaticamente de dados depois de terem sido arrastadas para cobrir as proteínas identificadas.
  3. Abra a quarta folha denominada 4) Análise e remoção de linhas onde as colunas G e H indicam que a amostra está fora de alcance; manter linhas que lêem dentro do alcance. O enredo do vulcão na quinta folha irá preencher automaticamente.

Resultados

Este protocolo descreve um método para comparar globalmente meias-vidas proteicas entre células de controle senescentes e não-divisórias usando pSILAC e pontos de tempo mínimos. Este protocolo detalha a geração de células senescentes e quiescentes na cultura, rotulagem metabólica de células com isótopos estáveis de arginina e lise ao longo de 3 dias, quantificando as abundâncias relativas de isótopos de peptídeos pesados e leves por espectrometria de massa, e um cálculo simples e acessível de meias-vidas proteicas usando fórmulas (Figura 1). Este método é altamente flexível e pode ser adaptado a inúmeros tipos e condições celulares.

Como parte da geração de células senescentes para este protocolo, dois métodos de validação de senescência são utilizados: células SA-βGal-positivas visualizadas por microscopia e níveis aumentados de marcadores senescentes quantificados através da análise RT-qPCR. A medição dos marcadores senescentes deve produzir distinções claras entre células quiescentes e senescentes para comparações das populações das duas células a serem consideradas válidas. Para a atividade SA-βGal, as células senescentes devem parecer azuis, enquanto as células de controle quiescentes não têm ou muito pouca cor (Figura 2A). Este ensaio pode ser quantificado contando as células positivas e manchadas de azul como uma porcentagem do número total de células e, em seguida, comparando a taxa de positividade percentual entre o controle quiescente e as células senescentes. É importante que este protocolo seja realizado ao mesmo tempo para a comparação de ambos os estados celulares; A atividade SA-βGal baseia-se no pH da solução de coloração, de modo que os resultados podem variar substancialmente entre os ensaios e devem ser considerados uma medida qualitativa.

A análise RT-qPCR dos marcadores senescentes mostrará altos níveis dos mRNAs codificando fatores SASP (IL6, CXCL8, IL1B) e os inibidores do ciclo celular (CDKN2A/p16, CDKN1A/p21) na maioria dos modelos senescentes. Embora alguma variação seja esperada com base no tipo celular, condição de cultura e indutor senescente41,42, a maioria das células senescentes apresentam níveis cinco vezes maiores de IL6, CXCL8 e CDKN1A/p21 mRNAs em comparação com células de controle quiescentes; por outro lado, os níveis de LMNB1 e PCNA mRNAs, marcadores de proliferação de codificação, devem ser baixos ou ausentes em células senescentes em comparação com células quiescentes (Figura 2B). Juntos, uma porcentagem significativa da positividade SA-βGal e a expressão esperada de um painel de marcadores mRNA associados à senescência são suficientes para confirmar a indução da senescência em um experimento.

O processamento de amostras de proteína para análise de espectrometria de massa consiste em digestão em solução (2 dias) e extração em fase sólida (4-6 h). Para realizar análises proteômicas não-marcadas, os peptídeos resultantes são submetidos à análise LC-MS/MS por meio de aquisição dependente de dados (DDA). Nos instrumentos Orbitrap, um método DDA pode ser especificado no editor do método de software de instrumento de espectrometria de massa. As configurações do espectrômetro de massa utilizadas neste estudo são mostradas na Figura 3A. As configurações de cromatografia líquida também podem ser especificadas dentro do editor do método. Para este estudo, utilizou-se um gradiente linear de 90 minutos com fase orgânica crescente (acetonitrila) (Figura 3B). Após uma aquisição bem sucedida, a corrente de íon total (TIC) deve conter um sinal intenso durante a porção linear de gradiente do método (Figura 3C). Este protocolo descreve um protocolo de exemplo em um instrumento Orbitrap, mas o cálculo de meias-vidas proteicas pode ser realizado em dados obtidos a partir de qualquer espectrômetro de massa que foi coletado no modo DDA, que está disponível em vários tipos de instrumentos (por exemplo, Orbitraps e instrumentos de tempo de voo) e fornecedores. As configurações de aquisição serão exclusivas do tipo e configuração do instrumento utilizado, e recomenda-se usar as configurações sugeridas pela instalação de espectrometria de massa. Este método também é compatível com métodos não-DDA (SRM, PRM, DIA), desde que áreas quantitativas de pico cromatográficos para picos pesados e leves possam ser extraídas dos arquivos de dados brutos e inseridas nas fórmulas de planilha.

Os arquivos de espectrometria de massa bruta são pesquisados com uma das muitas ferramentas de pesquisa de banco de dados proteômicos disponíveis para identificar peptídeos e proteínas. Por exemplo, este estudo utilizou o mecanismo de busca Mascot43. Para obter áreas de pico cromatográficas para quantificação de peptídeos pesados e leves, os resultados de pesquisa de banco de dados são importados para um software proteômico capaz de áreas de pico cromatográficas, como o Skyline39,40. O exame dos cromatógrafos de íons extraídos dos peptídeos (Figura 4) revelará a proporção relativa de sinais de peptídeos pesados e leves. Uma menor proporção de sinal de peptídeo pesado em relação ao sinal de peptídeo leve em células senescentes indica uma taxa de rotatividade de proteínas mais lenta (Figura 4A), e um sinal de peptídeo pesado mais alto em relação à luz indica uma taxa de rotatividade de proteínas mais rápida (Figura 4B). As amostras não rotuladas devem mostrar pouco ou nenhum sinal de peptídeo pesado. Qualquer sinal aparente de peptídeo pesado nas amostras não rotuladas é considerado ruído de fundo e será subtraído durante os cálculos finais. A quantificação de áreas de pico cromatográficos para peptídeos leves e pesados para todas as condições de tratamento e rotulagem deve ser exportada para o cálculo subsequente das taxas de rotatividade de proteínas e análise estatística.

Usando a análise de ponto único, a quantificação de meias-vidas proteicas é simples de realizar e pode ser feita convenientemente em planilhas. Na Tabela 3, foram calculadas as meias-vidas para 695 proteínas identificadas a partir da análise de espectrometria de massa. A partir de abundâncias de isótopos pesados e leves em nível de proteína para cada proteína nas amostras (entrada para a folha de dados brutos 1 ), um isótopo por cento pesado (chamado de Razão, R) é então calculado automaticamente na folha intitulada 2) Razão H | H + L. Nesta etapa, o R de amostras rotuladas pesadas é normalizado subtraindo o R de amostras não rotuladas para produzir um R final para os triplicados quiescentes e senescentes. Uma vez que amostras não rotuladas não devem ter nenhum isótopo exogenously adicionado, eles são usados para eliminar o sinal de fundo. A partir de R, o kdeg (taxa de rotatividade) é calculado usando a seguinte fórmula:

figure-results-1

A meia-vida (H, em dias) é determinada para cada proteína no controle quiescente e triplicados senescentes (folha intitulada 3) Half-Life (dias)) usando a seguinte fórmula:

figure-results-2

Essas meias-vidas são então mediadas entre os triplicados quiescentes e senescentes para gerar uma meia-vida quiescente e senescente para cada proteína, bem como um valor p. Meias-vidas calculadas são então filtradas para valores negativos, o que ocorre quando o sinal pesado de células de rotulagem leve (o fundo) é maior do que o sinal pesado de células de rotulagem pesada. Esta filtragem resultou em 707 proteínas de 841 identificadas com meias-vidas válidas para os resultados aqui apresentados.

A meia-vida é então relatada como uma proporção de log2 de senescente sobre células de controle quiescente (log2FC) e plotada em um enredo de vulcão (Figura 5). Por exemplo, olhando para a folha de análise 5) a proteína do receptor de trombina coagulação II (F2R) pode ser vista com meia-vida em células quiescentes de 0,51 dias (coluna B) e meia-vida em células senescentes de 1,07 dias (coluna C) que rendeu um registro2FC de ~1,06 (coluna D) com um valor p de 0,001.

figure-results-3
Figura 1: Diagrama do fluxo de trabalho pSILAC para células de controle senescentes e quiescentes. Os fibroblastos humanos IMR-90 foram usados para preparar culturas celulares quiescentes (baixo soro) ou senescente (IR) para comparação de meias-vidas proteicas. As células foram então rotuladas com mídia SILAC Light ou SILAC Heavy com arginina isotópica e liseina por 3 dias. Os lysatos foram extraídos de células, digeridos, desácidos e analisados por espectrometria de massa. Picos de isótopos de peptídeos pesados e leves correspondem a peptídeos recém-sintetizados e pré-existentes, respectivamente. Meias-vidas foram calculadas usando uma equação para decadência exponencial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 2: A validação de fenótipos senescentes usando análises SA-βGal e RT-qPCR. (A) As células senescentes e quiescentes são re-banhadas no momento da colheita em uma placa de 6 poços e manchadas para SA-βGal usando o kit de coloração SA-βGal. A cor azul no corpo celular é positiva para senescência. As imagens são tiradas em campo brilhante com cor a 10x de ampliação, marcador de tamanho em vermelho. (B) Análise RT-qPCR comparando células senescentes (vermelhas) e células ciclísticas (cinza) de um experimento não relacionado. Aumentos nos níveis de CDKN1A/p21, CXCL8 e IL6 mRNAs são indicativos de senescência, assim como a diminuição dos níveis de LMNB1 mRNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-5
Figura 3: Métodos representativos para varreduras de aquisição dependentes de dados (DDA) e gradiente de cromatografia líquida das culturas pSILAC no espectrômetro de massa Q-Exactive HF orbitrap. (A) Configurações de instrumentos recomendadas no software de instrumento para análise dependente de dados de lysatos de células inteiras a partir de um experimento pSILAC. (B) Exemplo de configurações do método de gradiente de fluxo de cromatografia líquida. Peptídeos são elucidos sobre um gradiente linear de 90 min variando de 5% a 35% de tampão B (0,2 % ácido fórmico e 99,8% de acetonitrilo), seguido por uma lavagem de 10 min com 80% de tampão B, e 25 min de equilíbrio com 5% tampão B. (C) Um cromatógrama de íon total (TIC) representativo de uma aquisição de espectrometria de massa de peptídeos fibroblastos IMR-90 adquiridos com as configurações especificadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-6
Figura 4: Cromatógramas de íons extraídos representativos de peptídeos com rotatividade alterada durante senescência. (A) Áreas de pico cromatugráficas do peptídeo FQMTQEVVCDECPNVK++ da proteína DnaJ homólogo membro subfamiliar B 11 (DNAJB11) em células senescentes e não-senescentes. Após 3 dias de SILAC, as células senescentes incorporam isótopos menos pesados neste peptídeo em comparação com células quiescentes (não senescentes), como indicado por uma redução na área de pico de peptídeos pesados contendo isótopos (azul) em relação ao peptídeo leve (vermelho), indicando que este peptídeo reduziu a rotatividade em células senescentes. (B) Áreas de pico cromatográficas do peptídeo VQAQVIQETIVPK++ da proteína Splicing Factor 3a Subunit 1 (SF3A1) em células senescentes e não senescentes. Após 3 dias de SILAC, as células senescentes incorporam uma maior proporção de isótopo pesado neste peptídeo em comparação com células quiescentes (não senescentes), como indicado por uma redução na área de pico de peptídeo pesado contendo isótopos (azul) em relação ao peptídeo leve (vermelho), indicando que este peptídeo aumentou a rotatividade em células senescentes. As condições não rotuladas (Dia 0) não mostram incorporação de isótopos pesados para ambos os peptídeos, como esperado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-7
Figura 5: Comparação de meia-vidas proteicas em células senescentes e quiescentes determinadas a partir da rotulagem pSILAC. (A) Enredo vulcânico exibindo a proporção log2 de senescente /controle (quiescente) para cada uma das 695 proteínas identificadas; neste experimento, a mídia de rotulagem leve e pesada não continha glicose e nenhum vermelho fenol. (B) Tabelas que mostram as 10 proteínas mais aumentadas ou diminuídas em células quiescentes versus células senescentes (esquerda e direita, respectivamente). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Mídia e buffers usados neste protocolo. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 2: Primers RT-qPCR usados neste protocolo. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 3: Pasta de trabalho de análise do SILAC para cálculo de meias-vidas proteicas, alterações de dobra e testes T. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Discussão

pSILAC é uma técnica poderosa que permite a quantificação global das taxas de rotatividade de proteínas em múltiplas condições celulares. Este artigo detalha o uso do pSILAC para comparar meias-vidas globais de proteína entre células senescentes e quiescentes, incluindo instruções para a preparação de células senescentes e quiescentes, rotulagem e colheita de SILAC e, finalmente, análise usando espectrometria de massa DDA. Além disso, um teste de duas etapas é descrito para validação do fenótipo de senescência usando análise SA-βGal e RT-qPCR de um painel de mRNAs codificando proteínas associadas à senescência. Além da validação da senescência com as duas abordagens descritas, uma terceira validação da senescência pode ser realizada após a análise de espectrometria de massa, buscando alterações nos marcadores de senescência conhecidos entre células senescentes e quiescentes no nível proteômico. As proteínas associadas à senescência que devem ser elevadas incluem p16, p21 e BCL2, entre outras, descritas em outroslugares 44,45. No protocolo descrito acima, a radiação ionizante foi utilizada para a indução da senescência e da fome de soro para células quiescentes. Para a indução da senescência, há múltiplas opções disponíveis e há heterogeneidade substancial entre elas 41,42,46. Atualmente, não há um método senescente que seja considerado o "mais fisiológico", por isso a escolha do indutor senescente é em grande parte baseada no contexto do experimento. No entanto, experimentos com o objetivo de afirmar um fenômeno geral sobre senescência são recomendados para usar pelo menos dois indutores senescentes diferentes. Discutir a gama de paradigmas de senescência está além do escopo deste artigo, mas alguns métodos comuns para induzir senescência incluem desencadear danos ao DNA (IR, doxorubicina, exaustão replicativa), expressar proteínas oncogênicas (HRAS, BRAF) e interromper a função mitocôndria2.

Além da escolha do indutor senescente, a escolha das células de controle é uma consideração igualmente importante. As células senescentes estão, por definição, sob prisão por crescimento indefinido, por isso uma comparação com outras células presas ao crescimento são frequentemente escolhidas. Para pSILAC, as células presas do ciclo celular são geralmente preferíveis porque não se replicam e, portanto, são mais fáceis de usar para cálculos de meia-vidaproteica 47. No entanto, uma vez que as células cultivadas muitas vezes retêm algumas células divisórias, é importante que os métodos usados para induzir a prisão do ciclo celular produzam uma resposta tão homogênea quanto possível para minimizar o erro das células que ainda estão se proliferando. Para calcular as taxas de degradação proteica para células ciclísticas usando pSILAC requer cálculos adicionais para compensar a taxa em que a proteína é diluída em célulasfilhas 27. No entanto, a prisão por crescimento quiescente em si não é sem complicações. Existem dois métodos gerais de parada do ciclo celular: privação de soro e inibição de contato48. Nem todas as células podem ser quiescentes através da inibição de contato, embora alguns fibroblastos tenham sido mostrados para demonstrar quiescência após vários dias de cultivo49. Este método usou a privação de soro porque é mais comumente usado para comparações de células senescentes, embora exija que a célula senescente seja igualmente privada de soro para comparações precisas. O soro ativa o complexo mTOR e, portanto, a privação de soro tem vários efeitos a jusante na célula, além da prisão do ciclocelular 50. Notavelmente, as células senescentes têm sido mostradas para exibir um SASP reduzido após a privação de soro ou inibição mTOR51,52.

Outro ponto importante a considerar no pSILAC é quantos pontos de tempo para testar. Este protocolo coletou células em um único ponto de tempo (3 dias de rotulagem leve ou pesada), o que simplifica substancialmente a análise resultante. A escolha do ponto de tempo deve base no objetivo do experimento. Para análise global, espera-se que 3 dias capturem a maioria das proteínas, embora meias vidas para proteínas de curta duração que tenham um volume de negócios total dentro de 3 dias (todo o sinal de luz é perdido) não podem ser medidos neste momento. Por outro lado, proteínas de longa duração com muito pouca rotatividade em 3 dias também são difíceis de quantificar e muitas vezes aparecem como tendo meias-vidas extremamente grandes (na ordem das semanas) que são tipicamente apenas uma consequência de muito pouco acúmulo de sinal pesado. Devido à relação não linear na proporção de sinais de peptídeos pesados e leves versus a porcentagem de proteína recém-sintetizada em pontos de tempo mais curtos e longos, a quantificação de meias vidas poderia ser melhorada adicionando pontos de tempo adicionais de rotulagem. Para comparações relativas entre dois estados celulares, como neste protocolo, uma meia-vida aproximada pode ser suficiente, mas pontos de tempo adicionais podem ser usados para melhorar a precisão quantitativa.

Este protocolo descreve como realizar uma análise não-alvo baseada em DDA sobre o volume de negócios de proteínas. No entanto, os cálculos de rotatividade de proteínas podem ser aplicados geralmente a qualquer esquema de aquisição que seja capaz de derivar a abundância relativa de pares de peptídeos pesados e leves. Por exemplo, métodos baseados em MS2, como a aquisição independente de dados (DIA/SWATH), também podem ser aplicados para o cálculo das taxas de rotatividade com sucesso53. Além disso, os pipelines de instrumentação e software diferentes dos descritos neste protocolo podem ser usados para realizar análises de DDA, identificação de proteínas e quantificação de proteínas. Ao usar plataformas de software de quantificação de proteínas, como o Skyline, para extrair áreas de pico de peptídeos, é aconselhável inspecionar manualmente cromatogramas de íons extraídos no espaço de trabalho do documento, identificar picos que foram erroneamente integrados e não quantitativos e fazer a curadoria do documento de acordo. Uma extensa coleção de tutoriais está disponível online para Skyline (skyline.ms).

pSILAC representa um dos métodos mais ideais para quantificação global de meias-vidas proteicas em células cultivadas devido ao multiplexing superior (cobertura proteome) e throughput. Embora o pSILAC não forneça taxas diretas de síntese ou degradação, uma vez que a mudança no sinal leve e pesado é devido a uma confluência de fatores, o pSILAC é altamente útil para comparações entre condições e diferentes tipos de células. Os métodos de baixa produtividade geralmente caem em dois tipos: 1) tratamento de células com ciclohiteximida para bloquear a síntese proteica e colheita em intervalos de tempo após a adição à decadência monitor, ou 2) tratamento de células com um inibidor de decadência proteica e colheita em intervalos de tempo após a adição para monitorar o acúmulo de proteínas, inferindo assim as taxas de decomposição proteica. A limitação de ambos os métodos é que tais tratamentos inevitavelmente causarão mudanças substanciais na fisiologia celular. Em contraste, o pSILAC não requer nenhuma intervenção substancial e teoricamente não tem efeitos detectáveis na fisiologia celular, uma vez que os aminoácidos isotópicos diferem por apenas um único nêutron de suas contrapartes não isotópicas. Assim, o método aqui descrito para pSILAC representa um protocolo simples para a medição global da proteína mais fisiológica meia-vidas em células não-divisórias.

Alterações na rotatividade de proteínas têm uma relação próxima com o envelhecimento, doenças relacionadas à idade, neurodegeneração e longevidade54,55. Este protocolo descreve um método para interrogar essas relações usando isótopos estáveis rotulando aminoácidos na cultura celular para medir as taxas de rotatividade de proteínas em células de senescência. No entanto, existem inúmeros métodos análogos para a realização de estudos no contexto do envelhecimento e da neurodegeneração in vivo em organismos inteiros, como camundongos. De fato, esses estudos enfatizaram a importância de medir as taxas de rotatividade de proteínas no contexto de doenças relacionadas à idade 56,57,58,59.

Neste estudo, as proteínas ribossômicas e proteínas residentes no ânticulo endoplasmático destacaram-se como duas categorias de proteínas com diminuição e aumento de meias-vidas em células senescentes, respectivamente. Embora uma análise mais aprofundada dos níveis de estado estável seja necessária para conclusões definitivas, esses resultados sugerem ainda que as células senescentes podem regular exclusivamente a tradução através da diminuição da meia-vida das proteínas ribossômicas. Daqui para frente, aplicar abordagens estáveis de rotulagem de isótopos para estudar a relação entre senescência celular e neurodegeneração in vivo em modelos de camundongos será uma extensão promissora da abordagem de rotulagem de isótopos descrita por este protocolo.

Divulgações

Os autores não têm revelações.

Agradecimentos

Este trabalho contou com o apoio dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) e do Programa de Pesquisa Intramuros (IRP), Instituto Nacional do Envelhecimento (NIA). N.B. foi apoiado pelo Longevity Impetus Grants, e pelo Programa de Estudiosos do Office of Dietry Supplements (ODS). A Figura 1 foi criada com BioRender.com.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Acetonitrila (grau LC-MS)GraingerAH015
Bicarbonato de amônioMillipore-Sigma9830
Antibiótico-Antimicótico (100x)ThermoFisher15240062
Kit de ensaio BCAThermoFisher23227
Ditiotreotol (DTT)SigmaD9779
DMEM, glicose alta, HEPESThermoFisher12430112
dNTP MixThermoFisherR0191
Soro Fetal Bovino, certificado, inativado pelo calorThermoFisher10082147
Ácido FórmicoSigma27001
Gammacel 40 ExactorMelhor Irradiador de Césio Theratronicspara células
GlycoBlueThermoFisherAM2238
Iodoacetamida (IAA)SigmaI1149
Fibroblastos pulmonares primários IMR-90 sensíveis àATCCCCL-186
iRT Kit (tempo de retenção indexado)BiognosysKi-3002-2Tempo de retenção indexado Padrões de peptídeos
IsopropanolThermoFisher423835000
MascotMatrix ScienceMascot Daemon 2.8Software de busca de banco de dados proteômico
Maxima Reverse Transcritase (200 U/µ L)ThermoFisherEP0742
MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100x)ThermoFisher11140050
Nano LC SystemThermoFisherULTIM3000RSLCNANO
Oasis HLB Extração em Fase Sólida CartirdgesÁguas186000383
Espectrômetro de Massa OrbitrapThermoFisherQ Exactive HF Orbitrap
Fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1), EDTA 100 mM, pH 8,0ThermoFisher327110025
solução salina tamponada com fosfato (PBS)ThermoFisher10010023
Pierce SILAC Protein Quantitation Kit (tripsina) -DMEMThermoFisherA33972
QuantStudio 6 Sistema de PCR em tempo realThermoFisher
Random Hexamer PrimerThermoFisherSO142
Senescência β-Kit de Coloração de GalactosidaseSinalização Celular9860
SkylineUniversity of WashingtonSkyline-Daily v21.2.1.424Software proteômico qantiativo gratuito e de código aberto. Disponível em www.skyline.ms
Sonicator BransonCPX-952-516R
TRIzol ReagentThermoFisher15596018Referido como fenol no texto; perigoso
TRYPle ExpressThermoFisher12605010
Tripsina (grau de sequenciamento)PromegaV5113
TURBO Dnase (2U / uL)ThermoFisherAM2238
ThermoFisher29700ureia
(categoria LC-MS)GraingerAH365
luz Água da

Referências

  1. Hayflick, L. The cell biology of aging. Journal of Investigative Dermatology. 73 (1), 8-14 (1979).
  2. Gorgoulis, V., et al. Cellular senescence: Defining a path forward. Cell. 179 (4), 813-827 (2019).
  3. Borghesan, M., Hoogaars, W. M. H., Varela-Eirin, M., Talma, N., Demaria, M. A senescence-centric view of aging: Implications for longevity and disease. Trends in Cell Biology. 30 (10), 777-791 (2020).
  4. Martinez-Cue, C., Rueda, N. Cellular senescence in neurodegenerative diseases. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 16(2020).
  5. Wissler Gerdes, E. O., et al. Cellular senescence in aging and age-related diseases: Implications for neurodegenerative diseases. International Review of Neurobiology. 155, 203-234 (2020).
  6. Baker, D. J., Petersen, R. C. Cellular senescence in brain aging and neurodegenerative diseases: evidence and perspectives. Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1208-1216 (2018).
  7. Musi, N., et al. Tau protein aggregation is associated with cellular senescence in the brain. Aging Cell. 17 (6), 12840(2018).
  8. Ogrodnik, M., et al. Obesity-induced cellular senescence drives anxiety and impairs neurogenesis. Cell Metabolism. 29 (5), 1061-1077 (2019).
  9. Chow, H. M., et al. Age-related hyperinsulinemia leads to insulin resistance in neurons and cell-cycle-induced senescence. Nature Neuroscience. 22 (11), 1806-1819 (2019).
  10. Dehkordi, S. K., et al. Profiling senescent cells in human brains reveals neurons with CDKN2D/p19 and tau neuropathology. Nature Aging. 1, 1107-1116 (2021).
  11. Chinta, S. J., et al. Cellular senescence is induced by the environmental neurotoxin paraquat and contributes to neuropathology linked to Parkinson's disease. Cell Reports. 22 (4), 930-940 (2018).
  12. Bussian, T. J., et al. Clearance of senescent glial cells prevents tau-dependent pathology and cognitive decline. Nature. 562 (7728), 578-582 (2018).
  13. Zhang, P., et al. Senolytic therapy alleviates Abeta-associated oligodendrocyte progenitor cell senescence and cognitive deficits in an Alzheimer's disease model. Nature Neuroscience. 22 (5), 719-728 (2019).
  14. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8 (6), 595-608 (2016).
  15. Wei, Z., et al. Amyloid beta protein aggravates neuronal senescence and cognitive deficits in 5xfad mouse model of Alzheimer's disease. Chinese Medical Journal (England). 129 (15), 1835-1844 (2016).
  16. He, N., et al. Amyloid-beta(1-42) oligomer accelerates senescence in adult hippocampal neural stem/progenitor cells via formylpeptide receptor 2. Cell Death & Disease. 4 (11), 924(2013).
  17. van Dijk, K. D., et al. Changes in endolysosomal enzyme activities in cerebrospinal fluid of patients with Parkinson's disease. Movement Disorders: Offical Journal of Movement Disorder Society. 28 (6), 747-754 (2013).
  18. Chinta, S. J., et al. Environmental stress, ageing and glial cell senescence: a novel mechanistic link to Parkinson's disease. Journal of Internal Medicine. 273 (5), 429-436 (2013).
  19. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  20. Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annual Review of Patholology. 5, 99-118 (2010).
  21. Acosta, J. C., et al. A complex secretory program orchestrated by the inflammasome controls paracrine senescence. Nature Cell Biology. 15 (8), 978-990 (2013).
  22. Payea, M. J., Anerillas, C., Tharakan, R., Gorospe, M. Translational control during cellular senescence. Molecular and Cellular Biology. 41 (2), 00512(2021).
  23. Nishimura, K., et al. Perturbation of ribosome biogenesis drives cells into senescence through 5S RNP-mediated p53 activation. Cell Reports. 10 (8), 1310-1323 (2015).
  24. Lessard, F., et al. Senescence-associated ribosome biogenesis defects contributes to cell cycle arrest through the Rb pathway. Nature Cell Biology. 20 (7), 789-799 (2018).
  25. Xu, M., et al. Senolytics improve physical function and increase lifespan in old age. Nature Medicine. 24 (8), 1246-1256 (2018).
  26. Wiley, C. D., et al. SILAC Analysis reveals increased secretion of hemostasis-related factors by senescent cells. Cell Reports. 28 (13), 3329-3337 (2019).
  27. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  28. Doherty, M. K., Hammond, D. E., Clague, M. J., Gaskell, S. J., Beynon, R. J. Turnover of the human proteome: determination of protein intracellular stability by dynamic SILAC. Journal of Proteome Research. 8 (1), 104-112 (2009).
  29. Riba, A., et al. Protein synthesis rates and ribosome occupancies reveal determinants of translation elongation rates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (30), 15023-15032 (2019).
  30. Mathieson, T., et al. Systematic analysis of protein turnover in primary cells. Nature Communications. 9 (1), 689(2018).
  31. Liu, T. Y., et al. Time-resolved proteomics extends ribosome profiling-based measurements of protein synthesis dynamics. Cell Systems. 4 (6), 636-644 (2017).
  32. Welle, K. A., et al. Time-resolved analysis of proteome dynamics by tandem mass tags and stable isotope labeling in cell culture (TMT-SILAC) hyperplexing. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (12), 3551-3563 (2016).
  33. Neri, F., Basisty, N., Desprez, P. Y., Campisi, J., Schilling, B. Quantitative proteomic analysis of the senescence-associated secretory phenotype by data-independent acquisition. Current Protocols. 1 (2), 32(2021).
  34. Hernandez-Segura, A., Brandenburg, S., Demaria, M. Induction and validation of cellular senescence in primary human cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57782(2018).
  35. Noren Hooten, N., Evans, M. K. Techniques to Induce and quantify cellular senescence. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55533(2017).
  36. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-βgal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  37. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  38. Hernandez-Segura, A., Rubingh, R., Demaria, M. Identification of stable senescence-associated reference genes. Aging Cell. 18 (2), 12911(2019).
  39. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
  40. Pino, L. K., et al. The Skyline ecosystem: Informatics for quantitative mass spectrometry proteomics. Mass Spectrometry Reviews. 39 (3), 229-244 (2020).
  41. Casella, G., et al. Transcriptome signature of cellular senescence. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7294-7305 (2019).
  42. Basisty, N., et al. A proteomic atlas of senescence-associated secretomes for aging biomarker development. PLoS Biology. 18 (1), 3000599(2020).
  43. Perkins, D. N., Pappin, D. J., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).
  44. Hernandez-Segura, A., Nehme, J., Demaria, M. Hallmarks of cellular senescence. Trends in Cell Biology. 28 (6), 436-453 (2018).
  45. Kohli, J., et al. Algorithmic assessment of cellular senescence in experimental and clinical specimens. Nature Protocols. 16 (5), 2471-2498 (2021).
  46. Hernandez-Segura, A., et al. Unmasking transcriptional heterogeneity in senescent cells. Current Biology: CB. 27 (17), 2652-2660 (2017).
  47. Swovick, K., et al. Interspecies differences in proteome turnover kinetics are correlated with life spans and energetic demands. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100041(2021).
  48. Marescal, O., Cheeseman, I. M. Cellular mechanisms and regulation of quiescence. Developmental Cell. 55 (3), 259-271 (2020).
  49. Lacorazza, H. D. Cellular Quiescence. , Springer, Humana Press. New York. (2018).
  50. Saxton, R. A., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth, metabolism, and disease. Cell. 168 (6), 960-976 (2017).
  51. Herranz, N., et al. mTOR regulates MAPKAPK2 translation to control the senescence-associated secretory phenotype. Nature Cell Biology. 17 (9), 1205-1217 (2015).
  52. Laberge, R. M., et al. MTOR regulates the pro-tumorigenic senescence-associated secretory phenotype by promoting IL1A translation. Nature Cell Biology. 17 (8), 1049-1061 (2015).
  53. Pino, L. K., Baeza, J., Lauman, R., Schilling, B., Garcia, B. A. Improved SILAC quantification with data-independent acquisition to investigate Bortezomib-induced protein degradation. Journal of Proteome Research. 20 (4), 1918-1927 (2021).
  54. Basisty, N., Meyer, J. G., Schilling, B. Protein turnover in aging and longevity. Proteomics. 18 (5-6), 1700108(2018).
  55. Basisty, N., Holtz, A., Schilling, B. Accumulation of "Old Proteins" and the critical need for MS-based protein turnover measurements in aging and longevity. Proteomics. 20 (5-6), 1800403(2020).
  56. Basisty, N., et al. Mitochondrial-targeted catalase is good for the old mouse proteome, but not for the young: 'reverse' antagonistic pleiotropy. Aging Cell. 15 (4), 634-645 (2016).
  57. Dai, D. F., et al. Altered proteome turnover and remodeling by short-term caloric restriction or rapamycin rejuvenate the aging heart. Aging Cell. 13 (3), 529-539 (2014).
  58. Karunadharma, P. P., et al. Subacute calorie restriction and rapamycin discordantly alter mouse liver proteome homeostasis and reverse aging effects. Aging Cell. 14 (4), 547-557 (2015).
  59. Basisty, N. B., et al. Stable isotope labeling reveals novel insights into ubiquitin-mediated protein aggregation with age, calorie restriction, and rapamycin treatment. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 73 (5), 561-570 (2018).

Reimpressões e permissões

Explorar mais artigos

Senescência CelularMeia-Vida de ProteínasMarcação SILACCélulas Não DivisionaisAnálise do ProteomaDegradação de ProteínasFibroblastos Quiescentes
Medição das Taxas de Rotatividade de Proteínas em Células Cultivadas Senescentes e Não-Divisórias com Rotulagem Metabólica e Espectrometria de Massa
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.