Análise de molécula única de motores da família Sf9 superprocessiva superprocessiva cinesina-3

Um ambiente celular imensamente lotado apresenta muitos desafios na classificação de proteínas e moléculas destinadas. Essa intensa carga de trabalho de organização e distribuição espaço-temporal de moléculas dentro do citoplasma é facilitada por motores moleculares e trilhas citoesqueléticas. Os motores moleculares são as enzimas que hidrolisam as moedas de energia, como o ATP, e utilizam essa energia durante a geração de movimento e força¹. Com base na semelhança da sequência de aminoácidos, as cinesinas são agrupadas em 14 famílias e, apesar dessa semelhança, cada motor contribui exclusivamente para o funcionamento de uma célula. Os motores da família Kinesin-3 constituem um dos maiores, compreendendo cinco subfamílias (KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 e KIF28)², associadas a diversas funções celulares e fisiológicas, incluindo transporte de vesículas, sinalização, mitose, migração nuclear e desenvolvimento 3,4,5. O comprometimento da função de transporte da cinesina-3 implica em muitos distúrbios neurodegenerativos, defeitos de desenvolvimento e doenças oncológicas 6,7,8,9.

Trabalhos recentes demonstraram que os motores de cinesina-3 são monômeros, mas sofrem dimerização induzida por carga e resultam em motilidade rápida e superprocessiva em comparação com a cinesina convencional^10,11,12,13. Sua caracterização bioquímica e biofísica precisa de uma grande quantidade de proteínas purificadas e ativas. No entanto, sua produção no sistema de expressão procariótica resultou em motores inativos ou agregados, presumivelmente devido a máquinas incompatíveis de síntese, dobramento e modificação de proteínas 14,15,16,17,18. Para contornar tais limitações e aumentar o rendimento, aqui estabelecemos um sistema robusto de expressão do baculovírus Sf9 para expressar e purificar esses motores.

O sistema de expressão de baculovírus utiliza linhagens celulares de insetos Sf9 como sistema hospedeiro para expressão de proteínas recombinantes eucarióticas de alto rendimento^19,20. O baculovírus possui um forte promotor de poliedrina que auxilia na expressão gênica heteróloga e na produção de proteínas recombinantes solúveis¹⁷. Devido à sua relação custo-benefício, segurança de manusear e alta quantidade de expressão de proteína ativa, tornou-se uma ferramenta poderosa²¹. Para expressar uma proteína de interesse, um passo fundamental é gerar um bacmida recombinante. Como os kits de geração de bacmid disponíveis comercialmente são caros e trabalharemos com mais amostras, desenvolvemos um protocolo interno para inserções grandes e pequenas de motores de cinesina-3 em bacmids. Motores de cinesina-3 purificados com Sf9 foram utilizados para caracterizar as propriedades de deslizamento de microtúbulos monomolécula e multimotor in vitro usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF). Os motores são marcados terminalmente em C com moléculas fluorescentes de 3 tandem (3xmCit) para fornecer sinal aprimorado e fotobranqueamento diminuído. Devido ao aumento da relação sinal-ruído, menor fototoxicidade e imagem seletiva de uma área muito pequena perto da lâmina de cobertura, a imagem TIRF tem sido amplamente utilizada para visualizar a dinâmica de proteínas no nível de molécula única in vivo e in vitro.

Este estudo discute a purificação de motores de cinesina-3 empregando o sistema de expressão do baculovírus Sf9 e imagens in vitro de molécula única e análise de deslizamento multimotor de motores utilizando microscopia TIRF. No total, este estudo mostra que as propriedades de motilidade dos motores purificados Sf9 são idênticas às dos motores preparados a partir de lisatos de células de mamíferos. Assim, acreditamos que o sistema Sf9-baculovírus pode ser adaptado para expressar e purificar qualquer proteína motora de interesse.

1. Cultura, transfecção e geração de vírus Sf9

NOTA: Manter as células Sf9 em 30 ml de meio Sf-900/SFM em balão cónico estéril e descartável de 100 ml sem qualquer antibiótico/antimicótico a 28 °C. Mantenha a cultura da suspensão num agitador orbital a 90 rpm. O fornecimento de CO₂ e a manutenção da umidade não são necessários. As células são geralmente subcultivadas a cada quatro dias, inoculando 0,5 x 10 6 células/mL para atingir 2,0 x 10⁶ células/mL de densidade no quarto dia.

1. Geração de estoque do vírus P0
   1. Para transfecção, células de sementes em um prato de 35 mm com confluência de^4,5 x 10 5 células/mL e manter a 28 °C sem agitação.
   2. Após 24 h, uma vez que as células estejam ligadas e pareçam saudáveis, prossiga para a transfecção conforme descrito abaixo.
      1. Tubo A: Misture 1 μg de DNA bacmid codificando para o motor KIF1A(1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG específico de cinesina-3 com 100 μL de meio de Grace não suplementado.
      2. Tubo B: Misture 6 μL de reagente de transfecção com 100 μL de meio de Grace não suplementado.
      3. Transfira cuidadosamente o conteúdo do tubo A para o tubo B e misture completamente pipetando para cima e para baixo (aproximadamente 20 vezes).
      4. Incubar a mistura por ~45 min à temperatura ambiente.
   3. Depois de completar a incubação, adicione 0,8 mL de meio de Grace não suplementado à mistura acima e misture lentamente por pipetagem.
   4. Aspirar suavemente o meio Sf-900/SFM das células (para remover quaisquer vestígios de soro que possam afetar a eficiência da transfecção).
   5. Adicionar a mistura de transfecção da etapa 1.1.3 gota a gota no topo das células e incubar a placa durante 6 h a 28 °C.
   6. Após a incubação, remover cuidadosamente a mistura de transfecção, adicionar 2 mL de meio Sf-900/SFM e incubar ainda mais por 48 h a 28 °C.
   7. Verifique a expressão da proteína motora sob um microscópio de fluorescência invertida. A proteína motora é marcada com uma proteína fluorescente, mCitrino, uma variante da proteína fluorescente amarela.
      NOTA: As células transfectadas foram visualizadas sob microscópio invertido equipado com contraste diferencial de interferência (DIC) e iluminação de epifluorescência com objetiva de 20x (ampliação de 200 vezes), lâmpada de mercúrio e câmera EM-CCD. Verifique a eficiência da geração e infecção por vírus monitorando a expressão de motores marcados com mCitrino em células através de excitação mCitrino e cubo de filtro de emissão. Além disso, verifique se há alterações morfológicas das células infectadas, como células/núcleos aumentados (Figura 1A-C).
   8. Novamente, verifique as células 72 h após a infecção. Normalmente, as células começam a se desprender da superfície (Figura 2).
   9. Se >5% das células se desprenderem da superfície, colha o meio com células infectadas em tubos de microcentrífuga estéreis de 1,5 mL e gire por 5 min a 500 x g.
   10. Recolher o sobrenadante e as alíquotas de congelamento instantâneo de 1 ml em azoto líquido e armazenar como stock de P0 a -80 °C ou utilizá-lo para gerar o stock de vírus P1.
2. Geração de estoque do vírus P1
   1. Para amplificar ainda mais o estoque de baculovírus P0 e confirmar a expressão de proteínas, cultive células Sf9 em cultura de suspensão líquida.
   2. Num balão cónico estéril de 100 ml, adicionar 10 ml de meio Sf-900/SFM com uma densidade celular de 2 x 10⁶ células/ml e 1 ml de stock do vírus P0. Incubar a 28 °C com agitação constante a 90 rpm.
   3. Após 72 h de infecção, verificar a expressão proteica conforme descrito anteriormente (etapa 1.1.7). Se a expressão da proteína for boa (>90% das células mostram um sinal de fluorescência mCitrino brilhante) e mostra morte celular significativa (aproximadamente 10%-15%), gire as células para baixo em um tubo cônico estéril de 15 mL a 500 x g por 5 min.
   4. Recolher o sobrenadante, alíquotas de congelamento instantâneo de 1 ml (reservado de P1) em azoto líquido e conservar a -80 °C ou proceder a infecção em larga escala e purificação de proteínas.
3. Infecção em larga escala
   1. Para a expressão proteica em larga escala, infectar 30 mL da cultura de suspensão a 2 x 10⁶ células/mL de densidade com 1 mL de estoque do vírus P1 e incubar a 28 °C com agitação constante a 90 rpm.
   2. Após ~ 72 h pós-infecção, verifique a expressão da proteína (em geral, a expressão máxima de proteína é alcançada entre 65-75h pós-infecção).
   3. Se >90% das células apresentarem um sinal fluorescente brilhante com morte celular mínima (<5%), recolher as células num tubo cónico estéril de 50 ml e girar para baixo a 500 x g a 4 °C durante 15 minutos.
      NOTA: Deve haver morte celular mínima (<5%), porque as células mortas liberam o conteúdo celular no meio, o que leva à perda de proteína expressa.
   4. Descarte o sobrenadante, colete o pellet celular e prossiga com a purificação da proteína.

2. Sf9 purificação de motores de cinesina-3

1. Ao pellet celular acima, adicione 3 mL de tampão de lise gelada (Tabela Suplementar 1) recém-suplementado com DTT de 5 mM, 5 μg/mL de aprotinina, 5 μg/mL de leupeptina e 5 μg/mL de PMSF e lise as células pipetando 20-25 vezes sem gerar bolhas de ar. Para todas as composições de tampão e reagentes, consultar o Quadro Suplementar 1.
2. Gire o lisado celular a 150.000 x g durante 30 min a 4 °C.
3. Recolha o sobrenadante num tubo fresco e estéril e misture com ~40 μL de resina de afinidade 50% anti-FLAG M2. Incubar a mistura durante 3 h a 4 °C com tombo de ponta a ponta.
4. Após incubação, pellet a resina FLAG girando a 500 x g durante 1 min a 4 °C. Aspirar suavemente o sobrenadante sem perturbar o pellet com uma agulha de 26 G e descartar.
5. Lave o pellet de resina FLAG três vezes com tampão de lavagem gelada (Tabela Suplementar 1) recém-suplementado com 2 mM de TDT, 5 μg/mL de aprotinina, 5 μg/mL de leupeptina e 5 μg/mL de PMSF. Pellet as contas girando a 500 x g durante 1 min a 4 °C em cada lavagem.
6. Após a terceira lavagem, escorra cuidadosamente o tampão de lavagem o máximo possível sem perturbar o pellet. Para a eluição da proteína, adicionar ~70 μL de tampão de lavagem contendo 100 μg/mL de peptídeo FLAG ao pellet de resina e incubar durante a noite a 4 °C com tombo de ponta a ponta.
7. No dia seguinte, girar a resina a 500 x g durante 1 min a 4 °C. Recolha o sobrenadante contendo proteína purificada num tubo fresco e suplemente com 10% de glicerol. Fixar alíquotas de congelação de 5 μL em azoto líquido e conservar a -80 °C até nova utilização.
8. Execute o gel SDS-PAGE para determinar a concentração e o rendimento da proteína. Juntamente com a proteína purificada de interesse, um controle proteico padrão, BSA de concentrações conhecidas variando de 0,2 μg, 0,4 μg, 0,6 μg, 0,8 μg e 1 μg são carregadas para gerar uma curva padrão. Coloração do gel com Coomassie Brilliant blue (Figura 3).
9. Analise o gel usando uma ferramenta de quantificação de gel integrada no software ImageJ. Primeiro, meça a intensidade da banda das concentrações conhecidas de BSA e gere a curva padrão. Em seguida, meça a intensidade da banda de proteína purificada e determine a concentração de proteína. Para fazer isso, abra o software Image J, clique na opção Analisar na barra de menus e selecione Géis no menu suspenso.

3. Ensaio de motilidade de molécula única in vitro usando motores de cinesina-3 purificados por Sf9

NOTA: Os motores de cinesina-3 purificados com Sf9 podem ser usados para estudar propriedades bioquímicas e biofísicas, como taxa de rotatividade de ATP, afinidade de microtúbulos, velocidade, comprimento de execução, tamanho do passo e geração de força. Aqui, um protocolo detalhado para análise de motilidade de molécula única in vitro de KIF1A(1-393LZ) usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) é descrito. Para toda a composição e reagentes de tampões, consulte o Quadro Suplementar 1.

1. Polimerização de microtúbulos
   1. Em um tubo de microcentrífuga pré-resfriado de 0,5 mL, preparar uma mistura de polimerização por pipetagem na seguinte ordem: 12,0 μL de tampão BRB80, pH 6,9; 0,45 μL de 100 mM MgCl₂, 1 μL de 25 mM GTP.
   2. Retirar uma alíquota de 10 μL de 10 mg/mL de tubulina armazenada em nitrogênio líquido, descongelar imediatamente e adicionar à mistura de polimerização acima. Misture suavemente pipetando 2-3 vezes sem criar bolhas de ar.
      NOTA: Execute as etapas acima de forma rápida e rigorosa no gelo.
   3. Deixe a mistura acima descansar no gelo por 5 min.
      NOTA: Este é um passo crítico para evitar a desnaturação da tubulina ou para evitar a formação de sementes de microtúbulos curtos.
   4. Transferir o tubo para um bloco de calor/banho-maria pré-aquecido a 37 °C e incubar durante 30 min para polimerização dos microtúbulos.
   5. Enquanto os microtúbulos estão polimerizando, descongele uma alíquota do tampão P12 e leve-a à temperatura ambiente.
   6. Antes de completar 30 minutos de incubação, comece a preparar o tampão de estabilização MT pipetando 100 μL de tampão P12 em um tubo de microcentrífuga fresco. Para isso, adicione 1 μL de taxol de 1 mM e imediatamente vórtice a mistura.
      NOTA: Comece a preparar o tampão de estabilização MT aproximadamente 5 min antes de concluir a incubação na etapa 3.1.4. O taxol estabiliza os microtúbulos polimerizados ligando-se à β-tubulina.
   7. Aqueça o tampão de estabilização de microtúbulos por 2-3 min a 37 °C e adicione-o suavemente aos microtúbulos polimerizados sem perturbar a mistura de polimerização no fundo.
      NOTA: O aquecimento do tampão de estabilização o levará à mesma temperatura que a mistura de polimerização.
   8. Não bata nem pipete a mistura e incube ainda mais a 37 °C durante 5 minutos.
   9. Bata suavemente na mistura e misture-a com uma ponta de corte chanfrada (capacidade de 200 μL) lentamente usando a pipeta.
      NOTA: A partir deste ponto, manuseie sempre os microtúbulos com uma ponta de corte chanfrada para evitar o cisalhamento dos microtúbulos.
   10. Tome 10-15 μL de microtúbulos polimerizados em uma célula de fluxo para verificar a polimerização adequada dos microtúbulos.
       NOTA: Pode-se visualizar os microtúbulos não rotulados usando uma configuração de microscopia DIC.
   11. Se os microtúbulos estiverem concentrados, dilua-os em tampão P12 suplementado com taxol de 10 μM.
2. Preparação da câmara celular de fluxo de motilidade
   1. Prepare uma câmara de motilidade usando uma lâmina de vidro, fita dupla face e tampa de vidro (22 mm x 30 mm).
   2. Pegue uma lâmina de vidro, coloque uma gota (~ 70 μL) de água destilada deionizada no meio e limpe-a com um papel de seda sem fiapos.
   3. Corte duas tiras de fita dupla face (~35 x 3 mm) e cole-as firmemente à lâmina de vidro paralelamente, deixando uma lacuna de ~4-5 mm entre duas tiras para criar uma passagem estreita.
   4. Em seguida, pegue uma tampa e adicione uma gota (~ 20 μL) de água destilada deionizada no meio. Coloque uma tira de papel de seda de limpeza de lentes sem fiapos na gota de água até que ela absorva a água. Em seguida, deslize-o lentamente em direção a uma extremidade da tampa.
      NOTA: A tampa deve estar completamente seca. Nenhuma água deve ser visível na tampa.
   5. Coloque a tampa nas tiras de dupla face presas no slide e pressione a tampa uniformemente ao longo das tiras para grudar firmemente.
      NOTA: Certifique-se de que o lado limpo da tampa está virado para a lâmina de vidro.
   6. Certifique-se de que, juntos, isso crie uma câmara estreita de capacidade de 10-15 μL para realizar o ensaio de motilidade (Figura 4A).
3. Ensaio de motilidade de molécula única in vitro
   NOTA: Para estudar as propriedades de motilidade de molécula única baseadas em microtúbulos de motores, os microtúbulos precisam ser adsorvidos na superfície de deslizamento da cobertura na câmara de motilidade.
   1. Diluir os microtúbulos estabilizados com taxol polimerizados em tampão P12 suplementado com taxol de 10 μM nas proporções de 1:5 e misturar pipetando lentamente com uma ponta chanfrada.
   2. Mantenha a câmara de fluxo em uma posição inclinada (~ 15-20 °). Fluir 30 μL de solução de microtúbulos diluída através da câmara de fluxo da extremidade superior, mantendo um papel de seda sem fiapos na extremidade inferior para absorver o líquido. Isso cria uma força de cisalhamento para alinhar o microtúbulo na direção do fluxo e ajuda a adsorver os microtúbulos retos e alinhar paralelamente.
   3. Deixe uma pequena gota de líquido em ambas as extremidades da câmara e mantenha a célula de fluxo em uma posição invertida (tampa voltada para o fundo) em uma câmara fechada e úmida para evitar a secagem da câmara de motilidade.
   4. Deixe descansar por ~ 30 minutos para que os microtúbulos adsorvam a superfície da tampa dentro da câmara de motilidade.
   5. Enquanto isso, prepare o buffer de bloqueio misturando o buffer P12-BSA de 500 μL com 5 μL de taxol de 1 mM.
   6. Vazar 40-50 μL de tampão de bloqueio e incubar a lâmina em posição invertida por 10 min em câmara úmida.
   7. Preparar a mistura de motilidade pipetando os seguintes componentes num tubo de microcentrífuga estéril com capacidade de 500 μL pela seguinte ordem: 25 μL de tampão P12 com taxol, 0,5 μL de 100 mM de MgCl₂, 0,5 μL de 100 mM de TDT, 0,5 μL de 20 mg/ml de glicose oxidase, 0,5 μL de 8 mg/ml de catalase, 0,5 μL de 2,25 M de Glicose e 1,0 μL de 100 mM de ATP.
      NOTA: A imagem por fluorescência tem sido amplamente utilizada para aplicações biológicas 22,23,24,25,26. A fotoexcitação de proteínas fluorescentes gera espécies reativas de oxigênio (EROs), que podem causar fotobranqueamento das proteínas fluorescentes e danos às amostras biológicas^27,28. Sequestradores de oxigênio, como glicose, glicose oxidase e catalase, são rotineiramente usados em ensaios de motilidade para limitar o fotodano e prolongar o tempo de branqueamento de proteínas fluorescentes.
   8. Finalmente, adicione 1 μL do motor purificado à mistura de motilidade acima e misture bem antes de fluir para a câmara de motilidade.
   9. Sele ambas as extremidades da câmara de motilidade com cera de parafina líquida e imediatamente a imagem sob iluminação TIRF usando a objetiva TIRF 100X de 1,49 NA com ampliação de 1,5x.
   10. Para focar a superfície da tampa, primeiro, concentre-se em uma das bordas internas da fita dupla face na câmara de motilidade sob iluminação de contraste de interferência diferencial (DIC).
       NOTA: A superfície brilhante e irregular será visível.
   11. Em seguida, mova o foco para a câmara de motilidade. Usando um ajuste fino, foque a superfície da tampa e procure os microtúbulos adsorvidos na superfície da tampa.
   12. Uma vez que os microtúbulos estejam focados, mude para a iluminação TIRF com um laser de excitação de 488 nm e ajuste a profundidade de iluminação alterando o ângulo do feixe de excitação para obter a melhor e mais uniforme iluminação TIRF (Figura 4B).
   13. Foque os motores individuais marcados com mCitrino movendo-se processivamente ao longo da superfície dos microtúbulos com exposição de 100 ms e registre o movimento usando uma câmera EM-CCD.
       NOTA: Embora os ensaios de motilidade tenham sido realizados em microtúbulos não marcados, a função de projeção z de intensidade máxima pode ser usada para revelar o contorno da trilha de microtúbulos. Preferencialmente, eventos em longas trilhas de microtúbulos foram considerados para análise de rastreamento.
   14. Rastreie manualmente a posição dos motores individuais marcados fluorescentemente andando em longas trilhas de microtúbulos quadro a quadro usando um plug-in personalizado no software ImageJ (nih.gov), conforme descrito anteriormente²⁹.
   15. Gere os histogramas de velocidade e comprimento de execução para a população motora plotando o número de eventos em cada bin. Ajuste esses histogramas a uma única função de pico gaussiana para obter velocidade média e comprimento de execução¹² (Figura 4C-E).

4. Ensaio de deslizamento de microtúbulos in vitro

NOTA: Para compreender o comportamento coletivo dos motores de cinesina-3, foi realizado ensaio in vitro de deslizamento de microtúbulos 18,30,31. Quando os motores são imobilizados na tampa em uma posição invertida e após a adição de microtúbulos na câmara, os microtúbulos pousam nos motores e deslizam enquanto os motores tentam andar sobre eles (Figura 5A,B).

1. Polimerização de microtúbulos fluorescentes: Polimerizar os microtúbulos seguindo o protocolo descrito anteriormente, exceto para a mistura de tubulina marcada com rodamina (3 mg/mL) com tubulina não marcada (10 mg/mL) na proporção de 1:10.
2. Após 30 min de polimerização, adicionar suavemente 30 μL de tampão de estabilização de microtúbulos pré-aquecido e incubar ainda mais por 5 min a 37 °C.
3. Em seguida, cisalhamento dos microtúbulos pipetando com a ponta de carga capilar (~ 25-30 vezes).
4. Preparar a câmara de fluxo de motilidade conforme descrito anteriormente, vazar 50 μL de nanocorpos de GFP purificados com Sf9 (2,5 μL de 100 nM diluídos em 50 μL de tampão P12) e incubar por 30 min à temperatura ambiente com a cobertura voltada para baixo em uma câmara úmida.
   NOTA: Os motores são C-terminally marcados com mCitrino. Os nanocorpos de GFP são utilizados para imobilizar os motores devido à sua baixa constante de dissociação³².
5. Bloqueie a superfície da tampa fluindo 50 μL de tampão de bloco para a câmara de fluxo para evitar a adsorção de proteínas inespecíficas e incube ainda mais por 5 min.
6. Prepare a mistura do motor pipetando 50 μL de buffer de bloco, 1 μL de ATP de 100mM e 5 μL de motores de cinesina 3 purificados por Sf9 de 100 nM. Misture suavemente antes de fluir para a câmara e incube por 30 minutos à temperatura ambiente em uma câmara úmida.
7. Lavar a câmara duas vezes com 50 μL de caseína P12.
8. Em um tubo de microcentrífuga estéril, preparar a mistura de ensaio de deslizamento na seguinte ordem, 45 μL de P12-caseína com taxol de 10 μM, 1 μL de ATP de 100 mM, 0,5 μL de 8 mg/mL de catalase, 0,5 μL de 20 mg/mL de glicose oxidase, 0,5 μL de glicose 2,25 M e 1 μL de microtúbulos fluorescentes cisalhados. Misture suavemente o conteúdo antes de fluir para a câmara de motilidade e sele as extremidades da câmara com cera de parafina líquida.
9. Imagem microtúbulo deslizando sob iluminação TIRF a 100 ms de exposição e capturar as imagens com câmera EM-CCD conectada.
   NOTA: A velocidade média de deslizamento dos microtúbulos foi determinada pelo rastreamento manual de aproximadamente 100 microtúbulos individuais quadro a quadro usando um plug-in personalizado no ImageJ²⁹. Determinar a velocidade média de deslizamento dos microtúbulos gerando um histograma e ajustando-se a uma função gaussiana (Figura 5C,D).

Para expressar e purificar proteínas motoras recombinantes ativas e funcionais em larga escala usando a expressão do baculovírus Sf9, o sistema precisa da geração de partículas virais carregando de forma estável uma sequência de codificação para infectar as células Sf9. Para isso, células Sf9 foram transfectadas com bacmida recombinante codificando KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG. Após 72 h, uma população significativa de células apresentou expressão de proteína verde fluorescente (mCitrino) com células e núcleos aumentados (Figura 1 e Figura 2), sugerindo geração bem-sucedida de partículas virais (P0). Essas partículas virais foram expandidas ainda mais infectando a população fresca de Sf9 em um volume maior para gerar estoques virais P1 para armazenamento e infecção em larga escala. Para purificação do motor de cinesina-3, uma cultura de 30 mL de células Sf9 foi infectada com 1 mL de partículas virais P1. Após 72 h de infecção, as células que expressam brilhantemente a proteína fluorescente verde foram colhidas, lisadas e purificadas usando purificação de afinidade de tag FLAG C-terminal com resina revestida de anticorpos anti-FLAG. Curiosamente, a adição do peptídeo FLAG às esferas ligadas com motores de cinesina-3 eluiu a maior parte da proteína em uma única fração e a proteína purificada foi de alta pureza, mostrada como uma faixa de ~120 kDa na Pista 7 da Figura 3.

A polimerização bem-sucedida de microtúbulos longos e saudáveis para estudar as propriedades de motilidade de motores de cinesina-3 purificados com S9 em um nível de molécula única requer tubulina pura. No presente estudo, os microtúbulos foram polimerizados utilizando tubulina ciclada 2X purificada do cérebro caprino em uma concentração crítica entre ~2,5-3,0 mg/mL por 30 min na ausência de taxol, pois o taxol diminui a concentração crítica de nucleação de microtúbulos e gera um grande número de microtúbulos curtos33,34,35 . Taxol foi adicionado pós-polimerização para estabilizar os microtúbulos e prevenir a despolimerização. Microtúbulos polimerizados usando este método resultaram em estruturas longas e uniformes (Vídeo 1) com um comprimento médio de 60-70 μm.

A análise in vitro da motilidade de molécula única do motor de cinesina-3 purificada por Sf9, KIF1A(1-393LZ) sob iluminação TIRF (Figura 4B) exibiu movimento unidirecional, rápido e superprocessivo ao longo do microtúbulo (Vídeo 2), como mostrado no quimógrafo como longas linhas brancas diagonais (Figura 4C). A análise de rastreamento desses eventos de motilidade superprocessiva longa mostrou velocidade média e comprimento de execução de 2,44 ± 0,02 μms-1 e 10,79 ± 0,28 μm (Figura 4D-E), respectivamente. Esses resultados estão de acordo com nossos dados publicados anteriormente12,13 utilizando motores preparados a partir de lisado celular de mamíferos por superexpressão. Além disso, o ensaio de deslizamento de microtúbulos multimotor usando motores purificados Sf9 presos na tampa sob iluminação TIRF exibiu movimento longo, uniforme e unidirecional (Figura 5C e Vídeo 3). A análise de rastreamento desses eventos de deslizamento de microtúbulos longos mostrou uma velocidade média de 1,37 ± 0,01 μms-1 (Figura 5D).

Juntos, esses resultados sugerem que o sistema Sf9-baculovírus fornece um excelente sistema para a expressão e purificação de proteínas motoras ativas que geralmente são difíceis usando o sistema procariótico. A etiqueta FLAG oferece uma vantagem da purificação de proteína em uma única etapa em sua forma pura. Além disso, a polimerização de microtúbulos usando tubulina fresca e pura e sua estabilização após a polimerização produz microtúbulos longos e uniformes. Além disso, a análise de motilidade de molécula única in vitro sugere que os motores purificados por Sf9 eram robustos e exibiam propriedades de motilidade semelhantes aos motores expressos em sistemas de mamíferos.

Figura 1: 48 h pós-transfecção de células Sf9 com motor de cinesina-3 com marcação fluorescente: As células Sf9 foram revestidas em um prato de 35 mm a uma densidade de 4,5 x 105 células/mL. Após 24 h, as células foram transfectadas com DNA bacmida recombinante codificando motor específico de cinesina-3, KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG usando reagente de transfecção. Após 48 h de transfecção, as imagens foram captadas sob interferência diferencial e contraste (CIVD) e iluminação por epifluorescência. (A) Células não transfectadas, pequenas, redondas e firmemente ligadas. (B) Células transfectadas expressando KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG proteína marcada mostrando diâmetro celular aumentado e frouxamente ligado à superfície. Barra de escala, 100 μm. (C) Gráfico de barras indicando o diâmetro celular médio das células não transfectadas e transfectadas. As barras de erro representam a média ± DP. N = 50 células. O teste t de Student é usado para encontrar o valor de significância (****p < 0,0001). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: 72 h pós-transfecção de células Sf9 com motor de cinesina-3 com marcação fluorescente: Imagens mostrando mais de 90% das células Sf9 expressando motor de cinesina-3 com marcação fluorescente, KIF1A(1-393LZ). As células estão frouxamente ligadas à superfície. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Motor de cinesina 3 purificada por Sf9: Gel SDS-PAGE corado de Coomassie representando o motor de cinesina 3 purificado de Sf9, KIF1A(1-393LZ) C-terminalmente marcado com 3xmCit-FLAG. Da esquerda para a direita, escada de proteína (M), controle de proteína padrão BSA, 0,2 μg (pista 2), 0,4 μg (pista 3), 0,6 μg (pista 4), 0,8 μg (pista 5) e 1,0 μg (pista 6), motor de cinesina 3 purificada (S) (faixa 7). A ASC foi utilizada como padrão para estimar a concentração de proteína purificada. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Ensaio de motilidade de molécula única in vitro usando motores de cinesina-3 purificados Sf9:(A) Câmara de motilidade de célula de fluxo esquemática preparada usando uma lâmina de vidro, fita dupla face e tampa de vidro. (B) Diagrama de desenho animado ilustrando imagens in vitro de molécula única de motores fluorescentemente marcados movendo-se ao longo da superfície dos microtúbulos adsorvidos na folha de cobertura usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF). Apenas as moléculas muito próximas ao deslizamento da cobertura ficam excitadas devido ao campo evanescente (~150-200 nm) formado pela reflexão completa da luz incidente quando iluminada em um ângulo além do ângulo crítico. (C) O quimógrafo mostra o motor de cinesina-3 andando processivamente (linhas brancas diagonais) ao longo da superfície dos microtúbulos. Tempo no eixo y (seta vertical) e distância no eixo x (seta horizontal). (D-E) Os histogramas de velocidade (D) e comprimento de corrida (E) foram determinados pelo rastreamento de motores individuais que caminham sobre a superfície dos microtúbulos quadro a quadro e histogramas foram plotados para cada população de motores e ajustados a um único Gaussiano. O pico representa a velocidade média e o comprimento da corrida e os valores são mostrados no gráfico como média ± MEV. N = Número de eventos contados. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Ensaio de deslizamento de microtúbulos in vitro usando motores de cinesina-3 purificados Sf9: (A) Esquema da câmara de célula de fluxo preparada usando uma lâmina de vidro, fita dupla face e tampa de vidro. (B) Diagrama de desenho animado ilustrando microtúbulos marcados com rodamina deslizando na superfície de motores de cinesina-3 constitutivamente ativos. Como os motores de cinesina-3 são marcados terminalmente com mCitrino, nanocorpos de GFP foram usados para anexá-los à superfície do vidro. Posteriormente, microtúbulos tosquiados marcados com rodamina foram introduzidos na câmara de fluxo e imagens de movimento de deslizamento de microtúbulos foram capturadas sob iluminação TIRF. (C) O quimógrafo representa o deslizamento suave dos microtúbulos (faixa branca diagonal) pelos motores de cinesina-3. Tempo no eixo y (seta vertical) e distância no eixo x (seta horizontal). Não. O histograma da velocidade foi plotado para uma população de microtúbulos e ajustado a um único pico gaussiano. A velocidade média de deslizamento é indicada no canto superior esquerdo como média ± MEV. N = Número de moléculas contadas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1: Microtúbulos polimerizados. Imagem TIRF de microtúbulos polimerizados antes da diluição para ensaio de motilidade. O filme foi adquirido a 100 ms de exposição e o vídeo é reproduzido a 60 frames/s. Barra de escala, 10 μm. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 2: Ensaio in vitro de molécula única do motor constitutivamente ativo da cinesina-3. Motores KIF1A(1-393LZ) com marcação fluorescente purificados a partir de células Sf9 movendo-se progressivamente ao longo da superfície do microtúbulo (não marcada) adsorvida na tampa em uma câmara de ensaio de motilidade. A imagem foi realizada em iluminação TIRF e as imagens foram adquiridas a 100 ms de exposição. O vídeo é reproduzido a 30 quadros/s. Barra de escala, 10 μm. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 3: Ensaio de deslizamento de microtúbulos do motor de cinesina-3 constitutivamente ativo. Microtúbulos marcados com Rhodamina deslizando suavemente na superfície da tampa de vidro revestida com motor KIF1A (1-393LZ) purificado Sf9. A imagem foi realizada em iluminação TIRF e as imagens foram adquiridas a 100 ms de exposição. O vídeo é reproduzido a 60 quadros/s. Barra de escala, 10 μm. Clique aqui para baixar este vídeo.

Tabela Suplementar 1: Composição de tampões e reagentes. Clique aqui para baixar este arquivo.

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes a declarar.