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Engineering

Dispositivo microfluídico para a separação de células de câncer de mama não metastático (MCF-7) e não tumoral (MCF-10A) usando dieletroforese AC

Published: August 11, 2022 doi: 10.3791/63850
Automatic Translation
1, 2, 3, 4,5
1Department of Biomedical Engineering, Foundation University Islamabad, 2College of Medical Technology, The Islamic University Najaf, 3Faculty of Mechanical Engineering, University of Tabriz, 4Department of Engineering Mathematics, University of Bristol, 5School of Life Sciences, University of Warwick

Summary

As células do câncer de mama exibem diferentes propriedades dielétricas em comparação com as células epiteliais da mama não tumorais. Foi levantada a hipótese de que, com base nessa diferença nas propriedades dielétricas, as duas populações podem ser separadas para fins de imunoterapia. Para suportar isso, modelamos um dispositivo microfluídico para classificar as células MCF-7 e MCF-10A.

Abstract

Os dispositivos dieletroforéticos são capazes de detectar e manipular células cancerígenas de maneira livre de rótulos, econômica, robusta e precisa, usando o princípio da polarização das células cancerígenas no volume da amostra aplicando um campo elétrico externo. Este artigo demonstra como uma plataforma microfluídica pode ser utilizada para a classificação contínua de alto rendimento de células de câncer de mama não metastático (MCF-7) e células epiteliais de mama não tumorais (MCF-10A) usando dieletroforese hidrodinâmica (HDEP) da mistura celular. Ao gerar um campo elétrico entre dois eletrodos colocados lado a lado com uma lacuna do tamanho de um mícron entre eles em um chip microfluídico HDEP, as células epiteliais mamárias não tumorais (MCF-10A) podem ser afastadas, exibindo DEP negativo dentro do canal principal, enquanto as células de câncer de mama não metastáticas seguem seu curso não afetadas quando suspensas em meio celular devido a terem condutividade maior que a condutividade da membrana. Para demonstrar esse conceito, foram realizadas simulações para diferentes valores de condutividade média, e a classificação das células foi estudada. Um estudo paramétrico foi realizado, e uma condutividade de mistura celular adequada foi encontrada para ser de 0,4 S / m. Mantendo a condutividade média fixa, estabeleceu-se uma frequência CA adequada de 0,8 MHz, dando máxima eficiência de classificação, variando a frequência do campo elétrico. Usando o método demonstrado, depois de escolher a condutividade do meio de suspensão de mistura celular apropriada e a frequência da CA aplicada, a máxima eficiência de classificação pode ser alcançada.

Introduction

Um tumor maligno que se desenvolve dentro e ao redor do tecido mamário é uma causa frequente de câncer de mama em mulheres em todo o mundo, causando um problema crítico de saúde1. Os tumores de mama antes da metástase podem ser tratados através de cirurgia se detectados em um estágio inicial, mas se ignorados, eles podem ter implicações graves na vida do paciente, espalhando-se para seus pulmões, cérebro e ossos. Os tratamentos oferecidos em estágios posteriores, como radiação e terapias químicas, apresentam efeitos colaterais graves2. Estudos recentes têm relatado que o diagnóstico precoce do câncer de mama reduz a taxa de mortalidade em 60%3. Por isso, é imperativo trabalhar em direção a métodos personalizados de detecção precoce. Para tanto, pesquisadores que atuam em diferentes áreas da ciência e da tecnologia têm utilizado a microfluídica para desenvolver dispositivos para o diagnóstico precoce do câncer de mama4. Esses métodos incluem microcromatografia de afinidade celular, classificadores de microcélulas ativadas por magnetismo, captura e separação de células cancerígenas baseadas em tamanho e dieletroforese no chip (DEP)5,6. Essas técnicas microfluídicas relatadas na literatura permitem a manipulação celular precisa, o monitoramento em tempo real e a triagem de amostras bem definidas, que servem como etapa intermediária em muitas aplicações diagnósticas e terapêuticas5. A integração desses mecanismos de classificação com a microfluídica oferece manipulação flexível e confiável das células-alvo 7,8,9,10. Uma das principais vantagens de tal integração é a capacidade de trabalhar com amostras de fluido em volumes nano a microlitros e também ser capaz de manipular as propriedades elétricas do fluido da amostra. Ajustando a condutividade do fluido suspenso no interior de dispositivos microfluídicos, as células biológicas podem ser classificadas com base em seus tamanhos e diferenças em suas propriedades dielétricas11,12.

Entre essas técnicas, o DEP no chip é frequentemente preferido, pois é uma técnica de classificação de células sem rótulo que explora as propriedades elétricas das amostras biológicas. Foi relatado que o DEP manipula bioamostras como DNA13, RNA14, proteínas 15, bactérias16, células sanguíneas 17, células tumorais circulantes (CTCs)18 e células-tronco 19. Dispositivos microfluídicos que empregam DEP para triagem de amostras biológicas têm sido amplamente relatados na literatura20. Dispositivos microfluídicos DEP (rDEP) baseados em reservatórios para triagem de células de levedura viáveis e não viáveis têm sido relatados que protegem as células dos efeitos adversos de reações eletroquímicas21,22. Piacentini e col. relataram um classificador de células microfluídicas casteladas que separou os glóbulos vermelhos das plaquetas com uma eficiência de 97%23. Dispositivos DEP no chip com orifícios assimétricos e eletrodos embutidos também foram relatados para classificar células viáveis e não viáveis24. Valero e Demierre et al. modificaram o classificador de células microfluídicas casteladas introduzindo duas matrizes de microeletrodos em ambos os lados do canal25,26. Isso ajudou a focar as células no centro do canal. Zeynep e col. apresentaram um dispositivo microfluídico baseado em DEP para separar e concentrar células de câncer de mama MCF7 de leucócitos27. Eles relataram uma eficiência de extração de células MCF7 de leucócitos entre 74%-98% com uma frequência de 1 MHz e uma tensão aplicada variando de 10-12 Vpp. A Tabela 1 Suplementar representa uma comparação qualitativa e quantitativa entre os dispositivos de classificação microfluídica baseados em DEP com base em seu projeto, configuração de eletrodos e parâmetros operacionais (frequência e tensão aplicadas).

Mais recentemente, pesquisadores têm tentado medir as diferenças no comportamento dielétrico de células epiteliais mamárias (MCF-10A) e células de câncer de mama não metastático (MCF-7) dentro de um chip microfluídico28,29. Jithin et al. também caracterizaram as respostas dielétricas de diferentes linhagens celulares de câncer usando uma técnica de sonda coaxial aberta com frequências entre 200 MHz e 13,6 GHz30. Essas diferenças nas respostas dielétricas das linhagens celulares MCF-7 e MCF-10A podem ser exploradas para separá-las em tempo de execução e podem levar ao desenvolvimento de dispositivos personalizados de diagnóstico em estágio inicial.

Neste artigo, simulamos a classificação controlada de células de câncer de mama não metastático (MCF-7) e células epiteliais de mama não tumorais (MCF-10A) usando dieletroforese AC. A região de mudança no campo elétrico influencia a classificação dentro do chip microfluídico. A técnica proposta é fácil de implementar e permite a integração da técnica de classificação em vários layouts de chips microfluídicos. Simulações computacionais de dinâmica de fluidos (CFD) foram realizadas para estudar a separação de células de câncer de mama não metastáticas e células epiteliais de mama não tumorais, variando a condutividade do meio fluido em que as células estavam suspensas. Nessas simulações, mostra-se que, mantendo a condutividade constante e alterando a frequência aplicada, a separação de células cancerígenas e células saudáveis pode ser controlada.

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Protocol

NOTA: O protocolo aqui utilizado utiliza o COMSOL, um software de simulação multifísica, para simular a classificação controlada de células de câncer de mama não metastático (MCF-7) e células epiteliais mamárias não tumorais (MCF-10A) usando dieletroforese AC.

1. Projeto do chip e seleção de parâmetros

  1. Abra o software multifísico e selecione Modelo em branco. Clique com o botão direito do mouse nas Definições Globais e selecione Parâmetros. Importe os parâmetros fornecidos na Tabela 1 para definições globais como um arquivo de texto ou insira os valores individualmente.
  2. Selecione Adicionar componente na guia inicial e adicione um componente 2D. Clique com o botão direito do mouse na geometria e importe o arquivo de modelo clicando duas vezes no arquivo.
  3. Escolha um material em branco e use as propriedades do material da Tabela 1.
  4. Selecione Adicionar Física na guia inicial e digite AC/DC. No nó AC/DC, escolha correntes elétricas como Física sob o subnó de campos e correntes elétricas.
  5. Clique com o botão direito do mouse na Corrente Elétrica e escolha os subnós Conservação de Corrente, Isolamento e Potencial Elétrico para isolar as paredes do canal para atribuir potencial aos eletrodos.
  6. Selecione Adicionar Física na guia inicial e, no nó Fluxo de Fluido , escolha Física de Fluxo Rastejante no subnó de Fluxo Monofásico. Clique com o botão direito do mouse em Fluxo unifásico e renderize os limites do chip como paredes usando o subnó Parede.
  7. Clique com o botão direito do mouse em Fluxo unifásico e adicione dois subnós de entrada e um subnó de saída.
  8. Atribua as entradas usando o subnó de entrada e use normal em Velocidade de Fluxo como a Condição de Limite. Atribua a tomada usando o subnó de saída.
  9. Selecione Adicionar Física na guia inicial e, no nó Fluxo de Fluido , escolha Física de Fluxo de Rastreamento de Partículas no subnó de Rastreamento de Partículas.
  10. Clique com o botão direito do mouse no nó Rastreamento de partículas e adicione a parede de subnós, subnós de propriedade de duas partículas, dois subnós de entrada, um subnó de saída, dois subnós de força de dieletroforese e um subnó de força de arrasto.
    1. Defina as Propriedades das Partículas para as células MCF-7 e MCF-10A usando o subnó Propriedades da Partícula . Escolha as propriedades das partículas a partir dos parâmetros na seção Definição Global .
    2. Adicione o subnó Força de arraste para atribuir a força dieletroforética a ambos os tipos de células.
    3. Adicione Propriedades de partícula neste caso a partir da seção de parâmetros. Adicione o subnó Shell ao modelo de células de mamíferos.
  11. Na guia inicial, escolha Adicionar malha e selecione Malha fina. Escolha Build Mesh na guia home para criar uma malha.
  12. Na guia inicial, clique em Adicionar estudo para adicionar três etapas de estudo . O Passo de Estudo 1 é para simular uma resposta de frequência; use um subnó do Domínio de Frequência .
    1. Para simular o fluxo rastejante, escolha um nó Estudo Estacionário . Adicione duas etapas dependentes do tempo para simular condições com força dieletroforética e sem força dieletroforética.
    2. Para a condição sem dieletroforética, escolha Física e Seleção de Variáveis, marque a caixa intitulada Modificar Configuração do Modelo para a etapa de estudo e desative a Etapa Dieletroforética. Para condições dieletroforéticas, não desative. Salve o arquivo e pressione Compute para que a simulação seja executada.
      NOTA: O chip microfluídico projetado para a classificação de células de câncer de mama não metastáticas (MCF-7) e células epiteliais de mama não tumorais (MCF-10A) possui duas entradas separadas para o fluxo de mistura celular e para o foco do fluxo hidrodinâmico, respectivamente, com larguras de 20 μm e 40 μm, respectivamente, como mostrado na Figura Suplementar 1 e na Figura Suplementar 2.
    3. Atribua a frequência (f0) sob o subnó Domínio de Frequência e tensão usando o subnó Potencial Elétrico aos eletrodos de plaina (295 μm de largura) colocados ao longo da parede lateral superior da câmara de classificação. Na saída, use a condição de parede "congelar" para visualizar as partículas classificadas.

2. Modelo matemático e análise computacional

  1. Verifique os parâmetros operacionais para separar células de câncer de mama não metastático e células epiteliais de mama não tumorais dentro do dispositivo microfluídico, configurando um estudo computacional de dinâmica de fluidos (CFD).
    NOTA: Software multifísico (módulos AC/DC, Microfluidics e Particle Tracking) foi utilizado para este fim. As equações governantes e a base teórica são dadas em detalhes no Arquivo Suplementar 1. O modelo foi testado utilizando-se as propriedades dielétricas de células de câncer de mama não metastáticas (MCF7) e células epiteliais mamárias não tumorais (MCF-10A) relatadas na literatura31,32, que estão resumidas na Tabela 1.
  2. Realizar as simulações de CFD introduzindo linhagens celulares de câncer de mama não metastático (MCF7) e epitelial de mama não tumoral (MCF-10A) com uma proporção de 1:1 na entrada da mistura celular.
    1. Inicialmente, realizar um estudo de independência da malha para otimizar o tamanho da malha para as simulações33.
      NOTA: Um estudo de independência da malha foi realizado para encontrar a melhor solução para os parâmetros operacionais. Um conjunto de cinco malhagens diferentes foi escolhido para quantificar o melhor tamanho de elemento possível para a convergência da solução. Observou-se que, quando o número total de elementos que definem uma malha foi de 635 (malha mais grossa), como mostra a Figura Suplementar 3A, a eficiência de classificação foi mais baixa, com algumas das células MCF7 se movendo para a saída inferior, conforme ilustrado na Figura 3B Suplementar. Quando a malhagem foi aumentada para fina, o número de elementos que definem a malha também aumentou para 2.288. A eficiência de classificação estava no seu máximo neste caso, com as células MCF7 e MCF-10A se movendo em direção às suas respectivas saídas. A malha mais fina também foi simulada, com o número de elementos que definem a malha aumentando para 3.188. A eficiência de classificação permaneceu inalterada além desse ponto. Assim, podemos dizer com segurança que a malhagem fina funciona melhor no nosso caso.
    2. Resolva dois conjuntos de estudos de CFD.
    3. Para o primeiro conjunto, clique com o botão direito do mouse no Estudo 1 e adicione o subnó Varredura Paramétrica . Pressione o sinal + para adicionar a condutividade do meio fluido "σm" como a variável de varredura. Realizar um estudo de varredura paramétrica para a condutividade do meio fluido σ m variando de 0,01 S/m a 2,5 S/m , mantendo a frequência aplicada, f (Hz), constante a um valor de 800 kHz.
    4. Para o segundo conjunto, realizar um estudo de Varredura Paramétrica variando a frequência CA aplicada de 100 kHz a 100 MHz, mantendo a condutividade do meio fluido, σ m, fixada em 0,4 S /m para cada caso. Este valor de σm foi escolhido com base nos resultados do primeiro estudo de CFD, pois uma separação máxima entre MCF-7 e MCF-10A foi observada neste valor.
    5. A força da força de dieletroforese (DEP), FDEP (-), exercida sobre uma partícula esférica dielétrica em um meio condutor é dada pela Equação 1T34:
      FDEP Equation 1 [1]
      Use a Equação 1 sob o subnó de força dieletroforética. Na equação 1, r mostra o raio da partícula na qual FDEPé aplicado; K (-) é conhecido como fator de Clausius-Mossotti; εm(-) mostra a permissividade dielétrica do meio; e E(V/m) é o valor quadrado médio da raiz do campo elétrico.
    6. Use a Equação 2 para uma partícula esférica sob o subnó de força dieletroforética.
      Equation 2[2]
      Na Equação 2, Equation 3 (-) mostra a permissividade complexa da partícula sobre a qual a força DEP é aplicada; Equation 4 (-) mostra a permissividade complexa do fluido ao redor da partícula. A permissividade complexa Equation 3 e Equation 4 são definidos da seguinteforma 35:
    7. Use a Equação 3 para uma partícula esférica sob o subnó de força dieletroforética:
      Equation 6[3]
      Na Equação 3, εp (-) mostra a parte real da permissividade complexa da partícula; εm (-) mostra a parte real da permissividade complexa do fluido que envolve a partícula; σp (S/m) mostra a condutividade da partícula; σ m (S/m ) mostra a condutividade do meio que envolve a partícula; e ω (Hz) é a frequência do campo elétrico aplicado.
      NOTA: O sinal de Re(K) determina a polaridade do FDEP. Se o sinal de Re(K) é negativo, então a partícula experimenta uma força dieletroforética negativa (nDEP); ao contrário disso, se o sinal de Re(K) é positivo, implica uma força dieletroforética positiva (pDEP). Para o fator de Clausius-Mossotti (K), a variação está dentro da faixa de -1 a 1.
  3. Use uma forma modificada da Equação 3 para modelar células biológicas, como células de mamíferos, que são mais complexas e têm uma estrutura de várias camadas.
    K (Equation 7) = Equation 8 [4]
    Na Equação 4, (-) incorpora tanto a permissividade complexa do citoplasma, (-), quanto a permissividade complexa da membrana celular, Equation 9 Equation 10 Equation 11 (-), e é dada da seguinte forma:36
  4. Use a Equação 5 para resolver ""Equation 12:
    Equation 13[5]
    Na Equação 5, R cyto (m) e Rmem (m) mostram o raio do citoplasma celular e da membrana celular, respectivamente.
  5. Em seguida, use a Equação 4 para plotar Re(K) como uma função do campo elétrico aplicado para células cancerígenas e saudáveis. Calcule a parte real do fator de Clausius-Mossotti (CM), Re(K), para quantificar a força dieletroforética (DEP) que a partícula experimenta.
  6. Clique com o botão direito do mouse no nó Resultados, adicione o subnó Avaliação de partículas e, na seção expressão, digite fpt.deff1.K para plotar o fator CM para a partícula 1 e fpt.deff2.K para a partícula 2.
    NOTA: Todas as etapas de protocolo listadas no texto principal podem ser visualizadas no vídeo do protocolo (Vídeo 1).

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Representative Results

Investigando os parâmetros operacionais ideais para a classificação eficaz baseada em DEP de células epiteliais não metastáticas de câncer de mama (MCF-7) e epiteliais de mama não tumorais (MCF-10A)
Para alcançar uma separação bem-sucedida de células do câncer de mama não metastático (MCF-7) e epitelial de mama não tumoral (MCF-10A) com propriedades dielétricas divergentes quando submetidas à dieletroforese, seus fatores K devem ser distintos, mantendo a frequência aplicada fixa37,38. A quantificação das respostas dielétricas de células de câncer de mama não metastático e células epiteliais de mama não tumorais sob um campo elétrico aplicado e o cálculo do fator "K" em função da frequência aplicada para ambas as linhagens celulares foram obtidos por meio da Equação 4. Os resultados apresentados na Figura 1 foram gerados mantendo-se fixos todos os parâmetros dielétricos das células de câncer de mama não metastático e epitelial de mama não tumoral, enquanto a frequência aplicada do campo elétrico variou para três diferentes valores de condutividade do meio de suspensão celular, σm.

Como mostra a Figura 1, em cada caso, o valor de K está dentro da faixa de -1 a 1, em consonância com estudos anteriores39,40. No entanto, o gráfico de real (K) versus a frequência muda para células de câncer de mama não metastático (MCF-7) e células epiteliais de mama não tumorais (MCF-10A) de acordo com o valor da condutividade média (σm). Os resultados apresentados na Figura 1 estão de acordo com um estudo recente no qual o efeito da σm sobre Re(K) para células MCF-7 foi quantificado41.

Figure 1
Figura 1: Fator de Clausius-Mossotti. A parte real do fator de Clausius-Mossotti, K, plotada em função da frequência, para células MCF-7 e MCF-10A suspensas em meio caracterizado por uma condutividade de (A) σ m = 0,01 S/m ; (B) σ m = 0,4 S/m ; (C) σ m = 1,2 S/m . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 1 foi plotada utilizando a ferramenta MyDEP para três diferentes valores de σm, mantendo-se e variando a frequência CA aplicada de 100 kHz a 100MHz. Inicialmente, a σ m foi escolhida como sendo 0,01 S/m, e a frequência CA aplicada variou entre 100 kHz e 100 MHz, como mostra a Figura 1A. Em uma frequência CA aplicada de 100 kHz, o valor de Re(K) para as células MCF-10A acabou sendo de 0,82, o que significa que elas experimentam dieletroforese positiva (pDEP) e devem se mover em direção a uma área de alta intensidade de campo elétrico. Da mesma forma, as células MCF-7 a 100 kHz também experimentam pDEP com um valor de Re(K) de 0,76. A frequência foi aumentada em passos de 100 kHz, e o valor do fator MC para ambos os tipos de células permaneceu no lado positivo em todo o espectro de frequência aplicado. Mantendo todos os demais parâmetros operacionais constantes, a condutividade média foi aumentada para 0,4 S/m para plotar o Re(K), como mostra a Figura 1B. MCF-10A e MCF-7 demonstraram comportamento negativo de dieletroforese (nDEP) com valores de Re(k) de -0,46 e -0,31, respectivamente, a 100 kHz. À medida que a frequência foi aumentada para 0,8 MHz, a resposta DEP das células MCF-10 mudou, e elas experimentaram pDEP com um valor Re(K) de 0,014. Esse comportamento das células MCF-7 é causado pela polarização de Maxwell-Wagner na interface entre a membrana celular e o meio de suspensão celular circundante39,41. A frequência em que essa mudança na resposta DEP é observada é conhecida como frequência de cruzamento, como mostra a Figura 1A42,22. As células MCF-7, neste caso, experimentaram nDEP. A frequência foi aumentada até 100 MHz, mas ambos os tipos de células não alteraram seu comportamento DEP e, portanto, permaneceram inalterados pelas variações na frequência do campo elétrico aplicado. Quando a condutividade foi aumentada para 1,2 S/m, as células MCF-10A e MCF-7 experimentaram nDEP a 100 kHz. Os valores de Re(k) para as células MCF-10A e MCF-7, neste caso, foram -0,49 e -0,43, respectivamente, como mostra a Figura 1C. Como a frequência foi aumentada para 0,8 MHz, a resposta DEP das células não se alterou, pois elas continuaram experimentando nDEP. O comportamento DEP negativo das linhagens celulares MCF-7 e MCF-10A em valores elevados de condutividade do meio de suspensão celular está de acordo com estudos relatados anteriormente 39,43,44. O comportamento DEP das células em frequências superiores à primeira frequência cruzada é regido pela interação entre a condutividade citoplasmática e a solução suspensa45,46. Por outro lado, em frequências inferiores à primeira frequência cruzada, a resposta dielétrica das células é determinada pela interação entre a condutividade da membrana celular e o meio de suspensão celular.

Com base nos resultados apresentados na Figura 1, foram montadas simulações COMSOL. Inicialmente, a intensidade do campo elétrico foi quantificada por meio desse software de simulação, como mostra a Figura 2. Pode-se observar que os máximos da magnitude do campo elétrico total gerado por dois eletrodos colocados lado a lado na parede superior do canal de classificação estão localizados perto das bordas dos eletrodos. As setas mostram a direção do campo elétrico.

Figure 2
Figura 2: Intensidade do campo elétrico. O campo elétrico gerado por dois eletrodos colocados lado a lado. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

As simulações para classificar as células MCF-7 e MCF-10A foram configuradas mantendo-se a frequência CA aplicada fixada em 0,8 MHz (frequência cruzada) e alterando-se o valor de σm. Foram escolhidos três valores para σm de acordo com os gráficos de Re(K) apresentados na Figura 1. Inicialmente, quando σ m era de 0,01 S/m , ambos os tipos de células experimentaram DEP positivo, moveram-se em direção à região de alta intensidade do campo elétrico e saíram da saída superior, como mostra a Figura 3A. As condutividades citoplasmáticas σcitoplasma para ambas as linhagens celulares foram superiores à condutividade média σm neste caso particular, forçando ambas as linhagens celulares a se aproximarem dos eletrodos no topo do canal microfluídico47. A resposta DEP das células MCF-10A mudou, e elas experimentaram DEP negativo, quando o σ m foi aumentado para 0,4 S/m com a frequência aplicada fixada em 0,8 MHz. A Figura 3B mostra que as células MCF-10A se movem para a saída superior, enquanto as células MCF-7 se movem para a saída inferior. A razão para essa separação é que as células MCF-7 são mais polarizadas em comparação com MCF-10A, pois sua condutividade citoplasmática σcitoplasma é maior que a condutividade média σm, como mostrado no vídeo de classificação celular (Vídeo 2).

Figure 3
Figura 3: Frequência fixa de classificação de células. Simulação de MCF-7 e separação celular saudável ao longo do tempo por DEP no dispositivo microfluídico projetado. MCF-7 e separação celular saudável em três diferentes valores de condutividade do meio suspenso: (A) 0,01 S/m; (B) 0,4 S/m; (C) 1,2 S/m. Em cada caso, a frequência aplicada foi de 0,8 MHz, a tensão aplicada Vpp foi de 1,5 V e a velocidade de fluxo na entrada de injeção foi de 184 μm/s e 853 μm/s na entrada de foco de fluxo. Na simulação, as células MCF-7 e MCF-10A são representadas com círculos azuis e vermelhos, respectivamente. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

À medida que a condutividade do meio foi aumentada para 1,2 S/m, as células MCF-7 e MCF-10A tornaram-se menos polarizáveis do que o meio que as rodeia devido à menor condutividade citoplasmática σ aos valorescitoplasmáticos . Consequentemente, eles experimentaram nDEP e se afastaram de regiões de alto campo elétrico, como mostra a Figura 3C.

Estes resultados demonstram que a condutividade do meio desempenha um papel importante na separação das células de câncer de mama não metastático MCF-7 das células epiteliais de mama não tumorais MCF-10A baseadas em DEP. Além disso, como mostrado na Figura 3B, para alcançar uma separação efetiva, a condutividade do meio precisa ser ajustada de forma que as células experimentem pDEP ou nDEP, com base em suas respectivas propriedades dielétricas.

Finalmente, o efeito da força dieletroforética aplicada, F DEP, sobre o comportamento de classificação de ambas as linhagens celulares foi investigado mantendo a condutividade do meio constante a 0,4 S/m. FDEP é uma função da frequência do campo elétrico aplicado48,49, e como a frequência do campo elétrico aplicado é alterada, as células mudam seu comportamento DEP. As simulações foram iniciadas ajustando-se a frequência em 100 kHz, observando-se que as linhagens celulares MCF-10A e MCF-7 experimentaram nDEP e se afastaram da região de alto campo elétrico em direção à saída inferior, como mostra a Figura 4A. À medida que a frequência foi aumentada, o comportamento DEP de ambas as linhagens celulares permaneceu inalterado até 0,8 MHz, quando o MCF-10A mudou seu comportamento DEP e passou para a região pDEP. Este é o ponto com a separação máxima entre as células de resposta DEP sob investigação e a máxima eficiência de classificação, como mostra a Figura 4B. Quando a frequência foi aumentada para 100 MHz, observou-se que ambas as linhagens celulares apresentaram pDEP e se moveram em direção à saída superior, como mostra a Figura 4C. Em frequências mais altas acima de 0,8 MHz, as células começaram a se imobilizar nas paredes do canal. A imobilização de células nas paredes do canal pode levar à perda de células durante o processo de classificação, o que, por sua vez, tem um efeito sobre a eficiência geral do dispositivo. O efeito dessas forças também pode causar séria perda na viabilidade celular se expostas por um longo período de tempo. Yang et al. quantificaram o efeito das forças de DEP em uma linhagem celular de Listeria monocytogenes, expondo-as a um campo elétrico CA de 5 MHz e a uma tensão de pico a pico de 20 VPP50. Seus resultados indicaram uma perda celular viável de 56%-89% quando mantida sob o efeito da força DEP por 4 h. Da mesma forma, as forças DEP também foram relatadas como tendo um efeito sobre o movimento das células quando suspensas em um meio polarizável e têm sido usadas para imobilizar células. relataram um dispositivo microfluídico com eletrodos interdigitados (IDEs) que utilizava uma frequência CA de 1 MHz e 20 VPP para imobilizar células de levedura51. Eles mostraram que a imobilização de suas células de levedura dependia da proporção do espaçamento entre seus IDEs e a tensão aplicada. O aumento da proporção do espaçamento IDE resultou em uma diminuição acentuada na imobilização celular e, para imobilizar células em dispositivos com maior espaçamento entre IDEs, foi necessário maior VPP. A imobilização celular é uma aplicação desejada quando as células precisam ser presas para análise ou crescimento. Os resultados anteriores mostraram claramente que a frequência e a tensão CA aplicadas têm um efeito sobre a imobilização celular. Em aplicações em que a classificação ou triagem de alto rendimento é o resultado desejado, a imobilização celular resulta em perda de células e reduz a eficiência de saída do dispositivo.

A fim de quantificar o efeito da frequência e tensão aplicadas na imobilização celular, um conjunto de simulações foi executado da faixa de frequência de kilohertz a mega-hertz a uma tensão aplicada fixa de 1,5 VPP. Os resultados são apresentados na Figura Suplementar S4. Os resultados revelaram que, nas frequências na faixa de kHz, a imobilização das células nas paredes do canal foi muito menor em comparação com as frequências na faixa de MHz. Como a força DEP é diretamente proporcional à frequência AC aplicada, podemos deduzir que, com alta força DEP, a imobilização das células é mais pronunciada. Para este dispositivo microfluídico, haverá uma perda de células durante a classificação das células MCF7 e MCF-10A, pois é necessário operar em frequências superiores a 0,8 MHz. O efeito da distribuição aleatória das células na entrada foi investigado pela escolha de uma condição limite de distribuição aleatória. Mais interações célula-canal foram observadas neste caso, como mostra a Figura Suplementar 5.

Figure 4
Figura 4: Classificação celular com condutividade média fixa. Efeito da frequência do campo CA aplicado na separação de células de câncer de mama não metastático (MCF-7) e células epiteliais mamárias não tumorais (MCF-10A) no dispositivo microfluídico simulado. (A) f= 100 KHz; (B) f= 0,8 MHz; (C) f= 100 MHz. A condutividade do meio fluido foi fixada em σ m = 0,4 S/m . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Propriedades dielétricas para simulação citoplasma ε citoplasma σ
(S/m)		 membrana ε membrana σ
(S/m)
MCF-7 50 0.8 11 6× 10-6
MCF-10A 100 0.1 11 6
f0 800 [kHz] 1,2 x 103 Hz Frequência do campo elétrico
sigma_f 0,4 [S/m] 0,8 S/m Condutividade do meio fluido
epsilon_f 80 80 Permissividade relativa do fluido
rho_f 1000 [kg/m3] 1000 kg/m³ Densidade do fluido
mu_f 1 x 10-3 [Pa·s] 0,001 Pa·s Viscosidade dinâmica dos fluidos
rho_p 1050 [kg/m3] 1050 kg/m³ Densidade de partículas
dp1 17 [μm] 1,7 x 10-5 m Diâmetro das partículas
dp2 16 [um] 1,6 x 10-5 m Diâmetro das partículas
sigma_p1 0,8 [S/m] 0,6 S/m Condutividade das partículas
sigma_p2 0,1 [S/m] 1.1 S/m Condutividade das partículas
epsilon_p1 50 55 Permissividade relativa saudável
epsilon_p2 100 65 Permissividade relativa ao câncer
sigma_s1 6 x 10-6 [S/m] 6 x 10-6 S/m Condutividade elétrica do invólucro
sigma_s2 6 [S/m] 6 S/m Condutividade elétrica do invólucro
epsilon_s1 11 11 Permissividade relativa do shell
epsilon_s2 11 11 Permissividade relativa do shell
th_s1 7 [nm] 7 x 10-9 m Espessura do casco
th_s2 7 [nm] 7 x 10-9 m Espessura do casco

Tabela 1: Parâmetros operacionais. Propriedades dielétricas de MCF-7 e MCF-10A

Vídeo 1: Um vídeo mostrando as etapas do protocolo. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 2: Vídeo de classificação de células. Clique aqui para baixar este vídeo.

Arquivo Suplementar 1: As equações governantes e a fundamentação teórica. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 1 suplementar: Projeto e parâmetros do dispositivo. Design de dispositivo microfluídico destacando diferentes partes do dispositivo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 2 suplementar: Folga entre os eléctrodos. A lacuna entre dois eletrodos de patch. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 3 Suplementar: Estudo de independência da malha. Um estudo de independência de malha que descreve o efeito de diferentes tamanhos de malha na classificação de células MCF-7 e MCF-10A. A) As diferentes malhagens do dispositivo microfluídico, representando o número de elementos para cada malha. O número de elementos que constitui a malha aumenta de malha mais grossa para mais fina. (B) A classificação de células MCF7 e MCF-10A em diferentes malhagens, mantendo todos os outros parâmetros de funcionamento constantes. As malhas finas e mais finas produzem os melhores resultados para a classificação. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 4 suplementar: Imobilização celular e teste de distribuição aleatória. Simulações realizadas para frequências entre 10 KHz e 6 MHz para validar o efeito da força DEP na imobilização celular. (A) Em f = 10 kHz, não se observa triagem e imobilização celular. (B) Em f = 200 kHz, não se observa triagem e imobilização celular. (C) Em f = 0,8 MHz, observa-se a triagem e a imobilização celular nas paredes de saída. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 5 suplementar: Distribuição aleatória. Partículas distribuídas aleatoriamente na entrada do chip. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 1: Comparação de diferentes dispositivos de classificação microfluídica baseados em DEP. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Dispositivos microfluídicos foram relatados anteriormente para cultura celular, aprisionamento e classificação 47,52,53. A fabricação desses dispositivos na sala limpa é um processo caro, e é imperativo quantificar a saída e a eficiência de um dispositivo microfluídico proposto por meio de simulações de CFD. Este estudo apresenta o desenho e as simulações de um dispositivo microfluídico dieletroforético AC para a separação contínua de células de câncer de mama não metastático (MCF-7) e células epiteliais mamárias não tumorais (MCF-10A) com base em suas propriedades dielétricas23.

O dispositivo é operado aplicando um campo elétrico AC através de um conjunto de dois microeletrodos embutidos em um único canal de classificação microfluídica para separar as células MCF-7 e MCF-10A com base em suas propriedades dielétricas. A eficácia de separação do dispositivo foi simulada computacionalmente para diferentes valores de condutividade média e para uma faixa de frequências CA aplicadas. Os valores ótimos de frequência CA aplicada e condutividade média foram de 0,8 MHz e 0,4 S/m, respectivamente. Uma baixa tensão de 1,5 Vp-p foi utilizada durante as simulações. A faixa de frequência CA aplicada e a tensão aplicada são comparáveis à literatura relatada anteriormente23,47. Nas frequências acima de 1 MHz, observou-se o efeito de imobilização celular, o que deve ser levado em consideração para futuros projetos e fabricação de dispositivos. Listamos essa imobilização celular como uma limitação do nosso método no contexto de aplicações de classificação celular. Acreditamos que a imobilização celular em frequências mais altas pode ser utilizada para diferenciação celular, conforme relatado anteriormente na literatura54, dando a este desenho proposto uma nova direção. Esta aplicação seria de grande interesse para os pesquisadores em biologia sintética.

As etapas críticas para a implementação correta deste protocolo incluem a escolha de nós e subnós físicos adequados (etapas 1.5-1.9). Essas etapas formam a base de todo o protocolo de simulação e ajudam a escolher os valores de parâmetros para cada tipo de célula, força aplicada e tensão aplicada. Outro passo crítico é escolher a condutividade correta do meio fluido e a frequência aplicada. Isso pode ser conseguido executando uma etapa de solução de problemas da varredura paramétrica. A varredura paramétrica desses dois parâmetros pode ajudar a decidir os valores ideais para quaisquer simulações futuras. Por último, um estudo de independência da malha também é fundamental no contexto da escolha da malhagem certa para quaisquer simulações futuras. É altamente recomendável que um estudo de independência da malha seja realizado como uma etapa de solução de problemas antes de finalizar quaisquer simulações futuras.

Este estudo fornece o primeiro exemplo baseado em simulação de separação em linha de células de câncer de mama não metastático (MCF-7) e células epiteliais de mama não tumorais (MCF-10A) com base em suas propriedades dielétricas. Acreditamos que este projeto pode ser implementado para a classificação de células viáveis e não viáveis.

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Disclosures

Os autores declaram não haver potenciais conflitos de interesse.

Acknowledgments

Este estudo foi apoiado pela Comissão de Ensino Superior do Paquistão.

Materials

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Engenharia Edição 186
Dispositivo microfluídico para a separação de células de câncer de mama não metastático (MCF-7) e não tumoral (MCF-10A) usando dieletroforese AC
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ur Rehman, A., Zabibah, R. S., Kharratian, S., Mustafa, A. Microfluidic Device for the Separation of Non-Metastatic (MCF-7) and Non-Tumor (MCF-10A) Breast Cancer Cells Using AC Dielectrophoresis. J. Vis. Exp. (186), e63850, doi:10.3791/63850 (2022).

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