Summary
Das Ziel dieses Manuskripts ist es, das KitV558Δ/+ Mausmodell und Techniken für die erfolgreiche Dissektion und Verarbeitung von Mausproben zu beschreiben.
Abstract
Der gastrointestinale Stromatumor (GIST) ist das häufigste menschliche Sarkom und wird typischerweise durch eine einzige Mutation im KIT-Rezeptor verursacht. Über alle Tumorarten hinweg wurden zahlreiche Mausmodelle entwickelt, um die nächste Generation von Krebstherapien zu untersuchen. In GIST verwenden die meisten In-vivo-Studien jedoch Xenograft-Mausmodelle, die inhärente Einschränkungen aufweisen. Hier beschreiben wir ein immunkompetentes, gentechnisch verändertes Mausmodell eines gastrointestinalen Stromatumors, der eine KitV558Δ/+ Mutation beherbergt. In diesem Modell wird das mutierte KIT, das für die meisten GISTs verantwortliche Onkogen, von seinem endogenen Promotor angetrieben, was zu einem GIST führt, der das histologische Erscheinungsbild und das Immuninfiltrat in menschlichen GISTs nachahmt. Darüber hinaus wurde dieses Modell erfolgreich eingesetzt, um sowohl gezielte molekulare als auch Immuntherapien zu untersuchen. Hier beschreiben wir die Zucht und Pflege einer KitV558Δ/+ Mauskolonie. Darüber hinaus beschreibt dieses Papier die Behandlung und Beschaffung von GIST, drainierendem mesenterialen Lymphknoten und angrenzendem Blinddarm in KitV558Δ / + -Mäusen sowie die Probenvorbereitung für molekulare und immunologische Analysen.
Introduction
GIST ist das häufigste Sarkom beim Menschen mit einer Inzidenz von etwa 6.000 Fällen in den Vereinigten Staaten von Amerika1. GIST scheint von den gastrointestinalen Schrittmacherzellen zu stammen, die als interstitielle Zellen von Cajal bezeichnet werden, und wird typischerweise durch eine einzige Mutation in der Tyrosinkinase KIT oder PDGFRA2 angetrieben. Chirurgie ist die Hauptstütze der Behandlung von GIST und kann kurativ sein, aber Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung können mit dem Tyrosinkinase-Inhibitor (TKI), Imatinib, behandelt werden. Seit seiner Einführung vor über 20 Jahren hat Imatinib das Behandlungsparadigma in GIST verändert und das Überleben bei fortgeschrittenen Erkrankungen von 1 auf über 5 Jahreverbessert 3,4,5. Leider ist Imatinib aufgrund erworbener KIT-Mutationen selten kurativ, so dass neue Behandlungen für diesen Tumor erforderlich sind.
Mausmodelle sind ein wichtiges Forschungsinstrument bei der Erforschung neuartiger Therapien bei Krebserkrankungen. Mehrere subkutane Xenotransplantat- und patientenabgeleitete Xenograft-Modelle wurden in GIST 6,7 entwickelt und untersucht. Immundefiziente Mäuse repräsentieren jedoch nicht vollständig die menschliche GIST, da GISTs je nach onkogener Mutation unterschiedliche Immunprofile aufweisen und die Veränderung der gastrointestinalen Tumormikroumgebung die Wirkung der TKI-Therapie verbessert 8,9. Die Kit V558Δ/+ Maus hat eine heterozygote Keimbahndeletion in Kit Exon 11, die die Juxtamembrandomäne kodiert, die am häufigsten mutierte Stelle im menschlichen GIST10. KitV558Δ/+ Mäuse entwickeln ein einzelnes CECAL GIST mit 100% Penetranz, und Tumore haben eine ähnliche Histologie, molekulare Signalgebung, Immuninfiltration und Reaktion auf die Therapie wie menschliche GIST 8,11,12,13. Hier beschreiben wir die Züchtung, Behandlung und Probenisolierung und -verarbeitung in KitV558Δ/+-Mäusen für den Einsatz in der molekularen und immunologischen Forschung in GIST.
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Protocol
Alle Mäuse wurden unter pathogenfreien Bedingungen an der University of Pennsylvania nach NIH-Richtlinien und mit Genehmigung der University of Pennsylvania IAUC untergebracht. Euthanasie wurde nach den Standardarbeitsanweisungen der University of Pennsylvania Laboratory Animal Resources durchgeführt.
1. KitV558Δ/+ Mauszucht
- Überqueren Sie die KitV558Δ/+ Mäuse mehr als 10 Mal auf einem C57BL/6J-Hintergrund mit C57BL/6J-Mäusen. Züchten Sie dazu die männlichen KitV558Δ/+ Mäuse mit weiblichen C57BL/6J Mäusen im Verhältnis 1:2.
HINWEIS: Der homozygote Kit V558 Δ/V558Δ Genotyp ist in utero tödlich. Es ist möglich, weibliche KitV558Δ / + Mäuse mit männlichen C57BL / 6J-Mäusen zu züchten, aber die Wurfgröße ist etwa halb so groß wie bei weiblichen Wildtyp-C57BL / 6J-Mäusen. Darüber hinaus produzieren weibliche KitV558Δ/+ Mäuse nach 4 Monaten begrenzte Würfe. - Genotypisieren Sie die Welpen im Alter von 7-14 Tagen durch Zehenclipping, um das Vorhandensein des KitV558Δ/+ Genotyps zu bestätigen. Verwenden Sie den Vorwärtsprimer: TCTCCTCCAGAAACCCATGTATGAA; Reporter 1: CCTCGACAACCTTCCA; Reverse-Primer: TTGCGTCGGGTCTATGTAAACAT; und Reporter 2: TCTCCTCGACCTTCCA für Genotypisierung.
2. KitV558Δ/+ Mausbehandlung
- Alter und Geschlecht stimmen mit dem KitV558Δ/+Mäuse vor der Behandlung überein. Verwenden Sie die alters- und geschlechtsangepassten Mäuse in Kohorten, da Tumore von weiblichen KitV558Δ / + Mäusen größer sind als die bei männlichen Mäusen. Behandeln Sie die Mäuse im Alter von 8-12 Wochen, zu welchem Zeitpunkt Tumore festgestellt werden (Abbildung 1).
- Tyrosinkinase-Hemmer oral oder durch intraperitoneale (i.p.) Injektion geben; KitV558Δ/+ Tumore sind empfindlich gegenüber Tyrosinkinase-Hemmern. Bieten Sie Imatinib in einer Dosis von 600 mg/l im Trinkwasser oder i.p. Injektionen von 45 mg/kg zweimal täglich an. Messen Sie die Tumorgewichtsreduktion mit digitalen Waagen nach der Dissektion des Tumors, wie in Schritt 3 gezeigt, die etwa 50% nach 1 Woche und 80% nach 4 Wochen nach der Behandlung mit Imatinib beträgt (Abbildung 2).
3. BausatzV558Δ/+ Maus Organentnahme
- Euthanasie Mäuse durch CO2 Narkose mit einer Durchflussrate von 60% Kammervolumen pro min. Lassen Sie die Mäuse mindestens 2 Minuten nach Beendigung der Atmung in der Kammer und führen Sie dann eine Zervixdislokation durch, um den Tod zu bestätigen.
- Sterilisieren Sie alle Instrumente, tragen Sie während des gesamten Eingriffs Handschuhe und pflegen Sie ein steriles Feld. Bereiten Sie die Haut mit 70% Ethanol vor. Machen Sie einen vertikalen Schnitt von 2 cm in der Mitte mit einer Schere und betreten Sie die Bauchhöhle. Lyse alle intraabdominalen Adhäsionen scharf.
- Um den drainierenden mesenterialen Lymphknoten zu entfernen, führen Sie die unten beschriebenen Schritte aus.
- Identifizieren Sie den Blinddarm und heben Sie sein Mesenterium überlegen an. Ungefähr in der Mitte der Basis des Dickdarmmesenteriums identifizieren Sie den mesenterialen Lymphknoten und sezieren Sie ihn scharf. Der Lymphknoten ist cremefarben und etwa 0,5 cm x 0,5 cm groß.
- Teilen Sie das Lymphknotengewebe in Drittel für die Proteinisolierung, Histologie und Einzelzellsuspension, je nach Bedarf. Für Einzelzellsuspensionen legen Sie Lymphknotengewebe in 20 ml serumfreie Medien (RPMI) und halten Sie es auf Eis.
- Führen Sie zur Isolierung von GIST und Blinddarm die unten beschriebenen Schritte aus.
- Der Blinddarm in KitV558Δ/+ Mäusen wird meist durch einen GIST ersetzt. Teilen Sie die ileokolische Verbindung vorsichtig von der Basis des Tumors ab. Um den Blinddarm zu sammeln, teilen Sie den Dickdarm wieder, 2 cm proximal zur Basis des Tumors.
- Bei 50%-60% der KitV558Δ/+ Mäuse enthält der Kopf des Tumors eine Kappe aus zeralem Gewebe, die typischerweise seröse Flüssigkeit enthält, aber selten Eiter enthalten kann (Abbildung 3). Sezieren Sie das Kappengewebe scharf vom Tumorgewebe weg.
- Teilen Sie Tumorgewebe und / oder Blinddarm in Drittel für Proteinisolierung, Histologie und Einzelzellsuspension, je nach Bedarf. Für Einzelzellsuspensionen legen Sie Tumorgewebe oder Blinddarm in HBSS mit 2% FCS, genug, um die Probe zu bedecken und auf Eis zu halten.
4. Western Blot Analyse von GIST-Gewebe
- Herstellen eines Gewebelysepuffers mit 50 mM TrisHCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% nicht denaturierendem Reinigungsmittel, 2 mM Na3VO4, 1 mM PMSF, 10 mM NaF und 20 μl/ml Proteinase-Inhibitor-Mischung.
- Bereiten Sie eine 1x Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit 1% Tween 20 (TBST) vor, indem Sie 1800 ml deionisiertes Wasser, 2 ml Tween 20 und 200 ml 10x Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) kombinieren.
- Resuspendieren Sie das Gewebe aus Schritt 3.4.3 in einem FACS-Röhrchen in 5 ml / g Gewebelysepuffer und homogenisieren Sie zweimal mit einem mechanischen Homogenisator bei 15.000 U / min für 15 s auf Eis. Inkubieren Sie Lysat für 30 min auf Eis.
- Lysat in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Zentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit für 20 min bei 4 °C. Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
- Lysate auf einem 4% bis 15% igen Gradientengel laufen lassen und dann auf eine Nitrocellulosemembran übertragen, wie in14 beschrieben.
- Waschen Sie die Membran einmal in 1x TBS für 5 min und blockieren Sie dann die Membran in 5% Milch für 1 h. Auch hier die Membran einmal in 1x TBS für 10 min waschen.
- Inkubationsmembran im primären Antikörper, verdünnt 1:1000 in 5% BSA bei 4 °C über Nacht. Membran 3x in 1x TBST für jeweils 10 min waschen. Inkubationstuplikat mit sekundärem Antikörper verdünnt 1:2500 in 2,5% Milch für 1 h bei Raumtemperatur.
- Membran einmal in 1x TBS für 5 min waschen. Fügen Sie genügend HRP-Substrat hinzu, um die Membran abzudecken, typischerweise 200-500 μL, und verwenden Sie einen digitalen Imager, um die Chemilumineszenz zu erkennen und zu quantifizieren.
5. Immunhistochemie von GIST-Gewebe
- Gewebe aus Schritt 3.3.2 oder 3.4.3 in 4% Paraformaldehyd bei 4 °C über Nacht fixieren. Lagern Sie das Gewebe in 70% EtOH, bis es zur Verarbeitung bereit ist. Einbetten und Schneiden von Blöcken mit einer Dicke von 5 μm auf Glasobjektträgern, wie beschrieben15,16.
- Vollständiger immunhistochemischer Nachweis mit einem grundlegenden Immundetektionskit, wie zuvor beschrieben17.
6. Einzelzellige Suspension des mesenterialen Lymphknotens
- Gießen Sie RPMI-Medien mit Lymphknotenproben aus Schritt 3.3.2 über einen 100-μm-Filter. Bewegen Sie den Filter auf einen neuen konischen 50-ml-Lymphknoten und einen Maischelymphknoten mit dem weichen Ende einer 3-ml-Kunststoffspritze. Waschfilter mit 20 ml RPMI-Medien.
- Das Filtrat bei 450 x g bei 4 °C für 5 min zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand.
- Resuspendieren Sie das Pellet in 20 ml von 1% FBS in PBS (Perlenpuffer) und gießen Sie es über einen 40-μm-Filter. Sammeln Sie das Zellfiltrat. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer.
- Das Filtrat bei 450 x g bei 4 °C für 5 min zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand. Resuspendieren Sie im Perlenpuffer bei 6 x 10 7 Zellen / ml für die Durchflusszytometrie.
7. Einzelzellsuspension von GIST
- Bereiten Sie den Kollagenasepuffer vor, indem Sie 250 mg Kollagenase IV, eine Tablette EDTA-freien Proteasehemmers und 100 μL DNase I zu 50 ml HBSS hinzufügen. Bei Raumtemperatur 10 min drehen, bis sie sich aufgelöst haben.
- Geben Sie GIST in eine sterile Schale und fügen Sie 2,5 ml Kollagenasepuffer hinzu. Zerkleinern Sie den Tumor mit einem sterilen Skalpell und einer Schere, bis der Tumor in feinen Fragmenten ist. Verwenden Sie eine Pipette mit großer Bohrung, um den Tumor und die Kollagenase in eine 50-ml-Röhre zu aspirieren.
- Inkubieren Sie in einem Schüttelinkubator bei 100 U / min bei 37 ° C für 30 min. Quench-Reaktion mit 2 ml FBS.
- Gießen Sie Kollagenase mit GIST-Probe über einen 100-μm-Filter und zerdrücken Sie den Tumor mit dem weichen Ende einer 3-ml-Kunststoffspritze und sammeln Sie ihn in einem 50-ml-Röhrchen. Waschfilter mit 20 ml HBSS. Das Filtrat bei 450 x g, 4 °C für 5 min zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand.
- Schwebe das Pellet in 20 ml Perlenpuffer und gieße es über einen 40-μm-Filter. Sammeln Sie das Filtrat und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Das Filtrat bei 450 x g, 4 °C für 5 min zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand. Resuspendieren Sie im Perlenpuffer bei 6 x 10 7 Zellen / ml für die Durchflusszytometrie.
8. Einzelzellige Suspension des Blinddarms
- Bereiten Sie den Kollagenasepuffer wie in Schritt 7.1 vor. Spalten Sie den Blinddarm mit einer Schere in Längsrichtung, um die innere Schleimhaut freizulegen. In 0,5 cm große Abschnitte schneiden und in ein 50 ml Rohr mit 5 ml HBSS mit 2% FBS legen. 30 s kräftig schütteln, 20 s mit 450 x g zentrifugieren, dann den Überstand abpumpen.
- Fügen Sie 5 ml HBSS mit 2 mM EDTA hinzu. Inkubator in einem Schüttelinkubator bei 37 °C bei 100 U/min für 15 min inkubieren. Zentrifuge bei 450 x g für 20 s. Aspirieren Sie den Überstand.
- Fügen Sie 5 ml HBSS hinzu. 30 s kräftig schütteln, 20 s mit 450 x g zentrifugieren, dann den Überstand abpumpen. Wiederholen Sie den Vorgang.
- Fügen Sie 5 ml Kollagenasepuffer hinzu. Inkubieren Sie in einem Schüttelinkubator bei 37 °C für 30 min bei 100 U / min. Alle 10 Minuten kräftig schütteln. Quench-Reaktion mit 2 ml FBS.
- Kollagenase mit Blinddarmprobe über einen 100-μm-Filter gießen und mit dem weichen Ende einer 3-ml-Kunststoffspritze zerdrücken. Waschfilter mit 20 ml HBSS. Sammeln Sie Filtrat.
- Das Filtrat bei 450 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Pellet in 20 ml Perlenpuffer und gießen Sie es über einen 40-μm-Filter. Sammeln Sie Filtrat und zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer.
- Das Filtrat bei 450 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand. Resuspendieren Sie im Perlenpuffer bei 6 x 10 7 Zellen / ml für die Durchflusszytometrie.
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Representative Results
Das Mausmodell KitV558Δ/+ ermöglicht die Untersuchung von Therapeutika in einem immunkompetenten Mausmodell. KitV558Δ/+ Mäuse haben aufgrund einer fortschreitenden Darmobstruktion eine durchschnittliche Lebensdauer von 8 Monaten (Abbildung 4). Tumore von KitV558Δ/+-Mäusen exprimieren kanonische Marker von GIST, einschließlich der Tyrosinkinase KIT und des Transmembrankanals DOG1 (Abbildung 5) sowie des Transkriptionsfaktors ETV1 (nicht gezeigt). Tumore können auf Veränderungen im KIT-Signalweg untersucht werden, wie die nachgeschalteten Marker ERK und AKT (Abbildung 6), oder auf Immunmikroumgebung, die den menschlichen GIST 8,11,12,13 genau nachahmt. MRT8 oder CT (Abbildung 7) können auch verwendet werden, um das Tumorvolumen als genaue Messung der Tumorreaktion zu verfolgen. Eine unbehandelte KitV558Δ/+ Maus erhielt 1 h vor der Bildgebung 200 μL Gastrograffin oral. Die CT-Bildgebung wurde auf einer vivaCT 80-Plattform durchgeführt. Die 3D-Rekonstruktion wurde mit Fidschi-Software durchgeführt, die auch das Tumorvolumen messen kann.
Abbildung 1: Vergleich der Tumorgewichte bei männlichen und weiblichen KitV558Δ/+Mäusen . Tumore von 9 Wochen alten unbehandelten KitV558Δ/+ männlichen und weiblichen Mäusen wurden isoliert und gewogen (n = 15 Mäuse/Gruppe). Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardmittelwert (SEM) dar; p-Werte wurden mit Hilfe eines Schüler-t-Tests berechnet; * = P < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Wirkung von Imatinib auf Tumore von KitV558Δ/+ Mäusen. KitV558Δ/+ Mäuse wurden 1 oder 4 Wochen lang mit Vehikel oder 600 mg/L Imatinib im Trinkwasser behandelt. Tumore wurden isoliert und gewogen (n = 4-5 Mäuse/Gruppe). Die Daten stellen den Mittelwert ± REM dar; p-Werte wurden unter Verwendung eines unidirektionalen ANOVA-Vergleichs mit einem Bonferroni-Post-Test zum Vergleich einzelner Gruppen berechnet; * = P < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: KitV558Δ/+ Tumor mit Kappe. Repräsentatives Foto eines Tumors von einer KitV558Δ/+ Maus mit einer cecal Kappe, die seröse Flüssigkeit enthält. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Lebensdauer der Mäuse KitV558Δ/+ Das Überleben der unbehandelten KitV558Δ/+ Mäuse wurde > 400 Tage lang verfolgt (n = 43 Mäuse). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Immunhistochemische Analyse. Repräsentative Histologie eines KitV558Δ/+ Tumors, bei dem der Skalenstab 40 μm beträgt. Abkürzungen: H&E = Hämatoxylin- und Eosinfärbung; Kit = ein kanonisches Zeichen von GIST und Rezeptortyrosinkinase; Dog1 = ein kanonischer Marker von GIST mit Rolle im Anionentransport. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Molekulare Signalanalyse. KitV558Δ/+ Mäuse wurden 1 Woche lang mit Vehikel oder 600 mg/L Imatinib im Trinkwasser behandelt. Den Mäusen wurde vor der Analyse eine einmalige i.p. Injektion des Fahrzeugs oder 45 mg/kg Imatinib 6 h verabreicht. Proteinlysate aus KitV558Δ/+ Tumoren wurden mittels Western Blot (n = 2 Mäuse/Gruppe) untersucht. Abkürzungen: P Kit = phosphorylierte Kit-Rezeptor-Tyrosinkinase; T-Kit = Gesamt-Kit-Rezeptor-Tyrosinkinase; P ERK = phosphorylierte mitogenaktivierte Proteinkinase; T ERK = totale mitogenaktivierte Proteinkinase; P AKT = phosphorylierte Serin-Threonin-Proteinkinase; T AKT = totale Serin-Threonin-Proteinkinase. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: CT-Bildgebungsanalyse. 3D-CT-Rekonstruktion einer unbehandelten KitV558Δ/+ Maus, die einen Tumor (Pfeil) im Becken demonstriert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Das Mausmodell KitV558Δ/+ ist ein leistungsfähiges Forschungswerkzeug in der molekularen und immunologischen Analyse von GIST. Obwohl die Züchtungsstrategie eine einzige Kreuzung erfordert, erfordert die Verwendung von KitV558Δ/+ Mauskohorten in Experimenten, die die Tumorreaktion analysieren, eine umfangreiche Zucht. Mäuse sollten alters- und geschlechtsgerecht sein, um ähnliche Tumorgewichte zu gewährleisten, und 10% der Mäuse sterben vor dem Alter von 8 Wochen, wenn Tumore festgestellt werden. Weniger umfangreiche Züchtungsstrategien sind möglich, wenn fortschrittliche bildgebende Verfahren wie CT oder MRT verwendet werden, um das Tumorvolumen innerhalb einzelner Mäuse zu verfolgen. Nichtsdestotrotz wurden KitV558Δ/+ -Mäuse erfolgreich mit anderen Knock-out- oder induzierbaren Mausmodellen gekreuzt, wodurch wichtige Immun- und molekulare Mechanismen aufgedecktwurden 12.
Tumorzellen von KitV558Δ/+ Mäusen lassen sich leicht durch Säulensortierung für KIT (CD117) oder durch Durchflusszytometrie18 isolieren. Isolierte Tumorzellen aus KitV558Δ/+ Mäusen können in vitro12 gezüchtet werden. In frühen Passagen behalten isolierte Tumorzellen aus KitV558Δ/+-Mäusen die KIT-Expression bei und können für In-vitro-Studien verwendet werden. Nach mehreren Passagen verlieren diese Zelllinien jedoch die KIT-Expression, was ihre Anwendbarkeit einschränkt. Wie die meisten Mausmodelle metastasieren KitV558Δ/+ Tumore nicht, was die Untersuchung des extraintestinalen GIST einschränkt. In ähnlicher Weise treten Tumore von Kit V558Δ/+-Mäusen nur im Blinddarm auf, und Zellen, die aus KitV558Δ/+-Tumoren isoliert wurden, wachsen nicht, wenn sie isoliert und in die Leber oder Milz injiziert werden, was die Beurteilung der Tumormikroumgebung von verschiedenen Krankheitsstellen aus einschränkt. Auch die KitV558Δ/+ Mutation hat in diesem Mausmodell keinen bekannten Einfluss auf die hämatologische Entwicklung von Zellen.
Die Immunmikroumgebung in Tumoren von KitV558Δ/+ -Mäusen enthält hauptsächlich Makrophagen, gefolgt von T-Zellen, die dem menschlichen GIST11 sehr ähnlich sind. Es ist jedoch unerlässlich, dass die CECAL-Kappe vollständig aus dem Tumor entfernt wird, bevor das Tumorgewicht oder das Immuninfiltrat beurteilt wird, da im Tumor unterschiedliche Immunpopulationen im Vergleich zum Blinddarm vorhanden sind. Nach unserer Erfahrung sind Tumorgewichte auch bei denen mit Kappen vergleichbar, und es gibt keinen signifikanten Zusammenhang zwischen der Tyrosinkinase-Inhibitor-Therapie und der Entwicklung einer cecal cap. Darüber hinaus haben wir keinen signifikanten Unterschied in der Tumormikroumgebung gefunden, der Tumore mit und ohne cecal caps vergleicht.
Viele gentechnisch veränderte Mausmodelle wurden für den Einsatz in der Krebsforschung entwickelt, insbesondere seit dem Aufkommen der CRISPR-Genbearbeitung. Während zahlreiche immunkompetente Modelle auf die cre-loxP-vermittelte Aktivierung von Onkogenen oder die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen setzen, werden die KitV558Δ/+ Tumoren durch ihren endogenen Promotor angetrieben. Dementsprechend sind die Erkenntnisse im Mausmodell KitV558Δ/+ in hohem Maße auf menschliche Krankheiten übertragbar, insbesondere in der Bewertung der KIT-Signalgebung19. Mit Blick auf die Zukunft sollte die KitV558Δ/+ Maus weiterhin als wertvolles Modell dienen, da neuartige Behandlungsstrategien wie Checkpoint-Blockade und CAR-T-Therapie weiterhin für die Behandlung von Weichteiltumoren einschließlich GIST erforscht werden.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
KitV558Δ/+ Mäuse wurden gentechnisch verändert und von Dr. Peter Besmer10 geteilt. Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse R01 CA102613 und T32 CA251063 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 micron filter | EMSCO | 1194-2360 | |
| 1x RBC lysis buffer | Life Technologies | 00-4333-57 | |
| 3mL syringe | Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences | 14823435 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl | Bio-Rad | 4561083 | |
| 4% Paraformaldehyde Solution | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 40 micron filter | EMSCO | 1194-2340 | |
| 5M NaCl | Sigma Aldrich | S6546 | |
| 70 micron filter | EMSCO | 1194-2350 | |
| AKT antibody (C67E7) | Cell Signaling | 4691 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | ||
| Collagenase IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Complete mini edta free protease inhibitor | Thomas Scientific | C852A34 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Disposable Scalpels | Thermo Fisher Scientific/Exel International | 14-840-00 | |
| Dnase I | Thomas Scientific | C756V81 | |
| Dog1 antibody | abcam | ab64085 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884 | |
| ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9102 | |
| FBS | Thomas Scientific | C788U23 | |
| FIJI software | FIJI | https://imagej.net/software/fiji | |
| Fisherbrand 850 Homogenizer | Thermo Fisher Scientific | 15-340-169 | |
| HBSS | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Imatinib mesylate | Selleck Chemicals | S1026 | |
| KIT antibody (D13A2) | Cell Signaling | 3074 | |
| KitV558Δ/+ Genotyping | Transnetyx | ||
| Microcentrifuge tubes (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm | Rio-Rad | 1620145 | |
| Nonfat Dry Milk | Thermo Fisher Scientific | NC9121673 | |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma Aldrich | 74385 | |
| p-AKT antibody (S473) | Cell Signaling | 4060 | |
| p-ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9101 | |
| p-KIT antibody (Y719) | Cell Signaling | 3391 | |
| PMSF Protease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 36978 | |
| Proeinase K | Thermo Fisher Scientific | BP170050 | |
| Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes | Falcon/Thermo Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| RPMI | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | S6508 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34076 | |
| TBS buffer (10x) | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Tissue culture dish (100mm2) | Thermo Fisher Scientific/Falcon | 08-772E | |
| TrisHCL | Thermo Fisher Scientific | BP1757500 | |
| Tween 20 | Rio-Rad | 1706531 | |
| vivaCT 80 platform | Scanco medical |
References
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