A inflamação da superfície ocular prejudica os tecidos da superfície ocular e compromete as funções vitais do olho. O presente protocolo descreve um método para induzir inflamação ocular e coletar tecidos comprometidos em um modelo de camundongo de disfunção da glândula de Meibomian (MGD).
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Artigo de método
Indução da inflamação da superfície ocular e coleta de tecidos envolvidos
Neste artigo
Resumo
Resumo
As doenças da superfície ocular incluem uma série de distúrbios que perturbam as funções e estruturas da córnea, da conjuntiva e da rede de glândulas da superfície ocular associada. As glândulas meibomianas (MG) secretam lipídios que criam uma camada de cobertura que impede a evaporação da parte aquosa do filme lacrimal. Neutrófilos e armadilhas de DNA extracelular povoam MG e a superfície ocular em um modelo de rato de doença ocular alérgica. As armadilhas extracelulares de neutrófilos agregados (aggNETs) formulam uma matriz em forma de malha composta de cromatina extracelular que oclui as saídas de MG e condiciona a disfunção de MG. Aqui, um método para induzir inflamação da superfície ocular e disfunção da MG é apresentado. Os procedimentos para a coleta de órgãos relacionados à superfície ocular, como córnea, conjuntiva e pálpebras, são descritos em detalhes. Usando técnicas estabelecidas para o processamento de cada órgão, as principais características morfológicas e histopatológicas da disfunção da MG também são mostradas. Os exsudatos oculares oferecem a oportunidade de avaliar o estado inflamatório da superfície ocular. Esses procedimentos possibilitam a investigação de intervenções anti-inflamatórias tópicas e sistêmicas em nível pré-clínico.
Introdução
Cada piscar de olhos reabastece o filme lacrimal liso disperso sobre a córnea. Os epitélios da superfície ocular facilitam a distribuição e a orientação correta do filme lacrimal na superfície ocular. As mucinas são fornecidas pelas células epiteliais da córnea e da conjuntiva para ajudar a posicionar a parte aquosa do filme lacrimal proveniente das glândulas lacrimais na superfície dos olhos. Finalmente, a MG secreta lipídios que criam uma camada de cobertura que impede a evaporação da parte aquosa do filme lacrimal 1,2,3. Desta forma, as funções coordenadas de todos os órgã....
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Protocolo
Todos os procedimentos envolvendo animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais sobre bem-estar animal e aprovados pela comissão de bem-estar animal da Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nuremberg (FAU) (número de permissão: 55.2.2-2532-2-1217). Camundongos fêmeas C57Bl/6, com idades entre 7-9 semanas, foram utilizados para o presente estudo. Os camundongos foram obtidos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais) e mantidos em condições específicas livres de patógenos com ciclos de 12 h dia/noite.
1. Indução da inflamação da superfície ocular murina
- Realizar preparaç....
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Resultados
O presente protocolo descreve as etapas sequenciais para o estabelecimento de um modelo murino de inflamação da superfície ocular. Os protocolos visam mostrar como aplicar terapêutica localmente, obter exsudatos oculares e órgãos acessórios associados ao consumo como pálpebras saudáveis e inflamadas (Figura 2), córnea e conjuntiva. Deve-se ter atenção quando as pálpebras superiores são dissecadas para o isolamento da conjuntiva, e deve ser armazenada em 1x PBS durante a dissecção da córnea. .......
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Discussão
A secreção oleosa das glândulas meibomianas é de grande importância para um olho saudável22. No entanto, a obstrução dessas glândulas sebáceas por armadilhas extracelulares de neutrófilos agregados (aggNETs) que se alinham como filamentos paralelos localizados nas placas tarsais de ambas as pálpebras pode interromper o filme lacrimal23. Essa ruptura resulta em disfunção da glândula de Meibomian (MGD)1 e evaporação acelerada da lágrima e condiciona o .......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi parcialmente apoiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) 2886 PANDORA Project-No.B3; SCHA 2040/1-1; MU 4240/2-1; CRC1181(C03); TRR241(B04), Projeto H2020-FETOPEN-2018-2020 861878, e pela Volkswagen-Stiftung (Grant 97744) à MH.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1x PBS | Gibco | ||
| Alumínio Hidróxido | Imject alum Adjuvant | 77161 | 40 mg/ mL Concentração Final: in vivo: 1 mg/ 100 µ L |
| C57Bl/6 camundongos, 7 anos; 9 semanas | Charles River Laboratories | ||
| Cálcio | Carl roth | CN93.1 | 1 M Concentração final: 5 mM |
| Pinça curva | FST por Dumont SUÍÇA | 5/45 11251-35 | |
| Tesoura fina e afiada | FST Aço inoxidável, Alemanha | 15001-08 | |
| Gabinete de segurança laminar | Câmera de macrofotografia Herasafe | ||
| Câmera de | EOS6D | ||
| (sem filtro IR) | Nikon | D5300 | |
| Mnase | New England biolabs | M0247S | 2 x 106 gel U/mL |
| Kit de ensaio de fluxo multi-analito (painel de 13 plex de mouse personalizado) | Biolegend | CLPX-200421AM-UERLAN | |
| NaCl 0,9% (solução salina) | B.Braun | ||
| Ovalbumina (OVA) | Endofit, Invivogen | 9006-59-1 | 10 mg/200 µ L em solução salina |
| Toxina da coqueluche | ThermoFisher Scientific | PHZ1174 | 50 µ g/ 500 µ L em solução salina Concentração Final: in vivo: 100 µ g/ 100 µ L |
| Petridish | Greiner bio-one | 628160 | |
| Bisturi | descartável de penas | No. 21 | Concentração Final: in vivo: 300 ng/ 100 µ L |
| Estereomicroscópio | Zeiss | Stemi508 | |
| Seringa (lavagem da córnea/íris) | BD Microlane | 27 G x 3/4 - Nr.20 0,4 x 19 mm | |
| Seringa (imunização i.p) | BD Microlane | 24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm |
Referências
- Gilbard, J. P., Rossi, S. R., Heyda, K. G. Tear film and ocular surface changes after closure of the meibomian gland orifices in the rabbit. Ophthalmology. 96 (8), 1180-1186 (1989).
- Mishima, S., Maurice, D. M. The oily layer of the tea....
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Reimpressões e permissões
