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Artigo de método

Mycobacterium tuberculosis Enriquecimento de vesícula extracelular através da cromatografia de exclusão de tamanho

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DOI:

10.3791/63895

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19 de maio de 2022

 ,  , 
1Mycobacteria Research Laboratories, Department of Microbiology Immunology & Pathology, Colorado State University, 2BioMARC, Infectious Disease Research Center, Colorado State University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve a cromatografia de exclusão de tamanho, uma técnica fácil e reprodutível para enriquecer as vesículas extracelulares mycobacterium tuberculosis de supernascedores culturais.

Resumo

O papel das vesículas extracelulares (EVs) no contexto da infecção bacteriana surgiu como um novo caminho para a compreensão da fisiologia microbiana. Especificamente, os EVs Mycobacterium tuberculosis (Mtb) desempenham um papel na interação hospedeiro-patógeno e na resposta ao estresse ambiental. Os EVs Mtb também são altamente antigênicos e mostram potencial como componentes de vacinas. O método mais comum para purificar EVs Mtb é a ultracentrifugação gradiente de densidade. Esse processo tem várias limitações, incluindo baixo rendimento, baixo rendimento, dependência de equipamentos caros, desafios técnicos, podendo impactar negativamente a preparação resultante. A cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) é um método alternativo mais suave que combate muitas das limitações da ultracentrifugação. Este protocolo demonstra que a SEC é eficaz para o enriquecimento de EV Mtb e produz preparações de EV Mtb de alta qualidade de maior rendimento de forma rápida e escalável. Além disso, uma comparação com a ultracentrifugação de gradiente de densidade por procedimentos de quantificação e qualificação demonstra os benefícios da SEC. Enquanto a avaliação da quantidade de EV (análise de rastreamento de nanopartículas), fenótipo (microscopia eletrônica de transmissão) e conteúdo (mancha ocidental) é adaptado para EVs Mtb, o fluxo de trabalho fornecido pode ser aplicado a outras micobactérias.

Introdução

A liberação de vesícula extracelular (EV) por patógenos pode ser a chave para desbloquear novas tecnologias para controlar doenças infecciosas1. A micobacterium tuberculosis (Mtb) é um patógeno de alta consequência, infectando aproximadamente um terço da população mundial e reivindicando a vida de milhões de pessoas a cada ano2. A produção de EV por Mtb é bem documentada, mas evasiva nos papéis biogêneses e variados (ou seja, imunoestimulatório, imunossupressor, aquisição de ferro e nutrientes) desses EVs no contexto da infecção 3,4,5. Os esforços para entender a composição dos EVs Mtb revelaram esferas lipídicas de 50-150 nm de membrana lipídica derivadas da membrana plasmática contendo lipídios e proteínas de significância imunológica 3,6. A investigação do papel dos EVs de Mtb na fisiologia bacteriana revelou a importância da modulação bacteriana de EV em resposta ao estresse ambiental para a sobrevivência5. Estudos de interação hospedeiro-patógeno têm sido mais complicados de interpretar, mas evidências indicam que os EVs Mtb podem influenciar a resposta imune do hospedeiro e podem potencialmente servir como um componente de vacinação eficaz 3,4,7.

A maioria dos estudos de EVs Mtb até agora tem se apoiado na ultracentrifugação gradiente de densidade para o enriquecimento vesícula8. Isso tem sido eficaz para estudos de pequena escala; no entanto, essa técnica tem diversos desafios técnicos e logísticos. Fluxos de trabalho alternativos casam centrifugação multistep, para a remoção de células inteiras e detritos grandes, com um passo final de ultracentrifugação para eVs de pelotização. Essa metodologia pode variar em eficiência, e muitas vezes resulta em baixo rendimento e co-purificação de biomoléculas não vesículas solúveis associadas, ao mesmo tempo em que impacta a integridade vesícula9. Além disso, esse processo é demorado, manualmente intensivo e muito limitado em rendimento devido a restrições de equipamentos.

O presente protocolo descreve uma técnica alternativa à ultracentrifugação gradiente de densidade: cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). Este método tem sido demonstrado para micobactérias ambientais, e no trabalho atual, foi extrapolado para Mtb10. Uma coluna comercialmente disponível e coletor de frações automática pode melhorar a consistência na preparação vesical e reduzir a necessidade de equipamentos específicos e caros. Também é possível completar este protocolo em uma fração do tempo em comparação com a ultracentrifugação gradiente de densidade, aumentando o throughput. Esta técnica é menos tecnicamente desafiadora, facilitando o domínio, e pode aumentar a reprodutibilidade inter/intra-laboratorial. Finalmente, a SEC tem alta eficiência de separação e é gentil, preservando a integridade das vesículas.

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Protocolo

O Comitê de Biossegurança Institucional da Universidade estadual do Colorado aprovou o presente estudo (19-046B). O cultivo de Mycobacterium tuberculosis e a colheita de supernacantes culturais ricos em EV foram realizados por pessoal treinado em um laboratório de alta contenção. Os materiais foram retirados da área de alta contenção após a realização de um método de inativação válido, confirmado e aprovado por políticas institucionais de biossegurança. Ao replicar o protocolo, se a inativação validada ou o método de filtragem estéril não forem viáveis, os seguintes procedimentos precisam ser realizados em laboratório de alta contenção.

1. Preparação do concentrado de EV de Mtb bruto

NOTA: Para procedimentos detalhados sobre o cultivo de Mtb e preparação da proteína filtrada de cultura (PCC), consulte Referências11,12. Recomenda-se que a mídia de cultura bacteriana esteja livre de suplementos de crescimento com componentes contendo EV ou proteináceos, como o Oleic Albumin Dextrose Catalase (OADC), e detergentes como o Tween. Recomenda-se também que a qualidade da cultura bacteriana e o PCP colhido sejam rastreados para garantir a morte celular limitada ea lise 13,14.

  1. Prepare um filtro centrífugo de corte de peso molecular de 100 kDa (MWCO) (ver Tabela de Materiais) adicionando a capacidade total de volume de soro fisiológico tamponado com fosfato (1x PBS). Centrifugar por 5 min a 2.800 x g a 4 °C.
    NOTA: Se usar um filtro sem volume de dead stop, deve-se tomar cuidado para garantir que o volume da amostra não reduza abaixo do nível do filtro, resultando em secagem completa do filtro durante a centrifugação.
  2. Descarte o fluxo e qualquer PBS restante antes de encher a câmara de amostra com CFP de Mtb à sua capacidade máxima. Centrifugar a 2.800 x g a 4 °C até que o volume seja reduzido ao volume mínimo do dispositivo de ultrafiltração. Repita conforme necessário, adicionando mais CFP à unidade até que toda a amostra tenha sido reduzida o suficiente.
    NOTA: Retenha uma parte do material de fluxo de 100 kDa (100F) para qualificação a jusante, se desejar. Armazenar a 4 °C.
  3. Adicione 1x PBS à unidade do filtro que contenha o concentrado até a capacidade total do dispositivo. Reduza o volume conforme descrito em 1.2. Repita esta etapa cinco vezes para garantir a lavagem completa e a troca de buffer.
  4. Recupere o retentato CFP concentrado de 100 kDa (100R) de acordo com as especificações do dispositivo de ultrafiltração (ver Tabela de Materiais). Uma vez recuperado o 100R, lave o filtro com um volume mínimo de 1x PBS pelo menos três vezes e acumule a lavagem com o 100R para maximizar a recuperação.
  5. Quantita o material 100R com um ensaio bicinchonínico (BCA) seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais). Para realizar o ensaio, utilize várias diluições das amostras 1:2, 1:5 e 1:10 em PBS. Teste a amostra em triplicado.
    NOTA: Retenha uma parte do material 100R para qualificação a jusante, se desejar. Armazenar a 4 °C.

2. Cromatografia de exclusão de tamanho para o enriquecimento de EVs de Mtb de CFP

NOTA: O procedimento a seguir é específico para o uso de 3 mg de CFP de 100R Mtb com coluna SEC e coletor automático de frações (AFC, ver Tabela de Materiais). Pode ser adaptado para outras concentrações iniciais e tipos de colunas seguindo as especificações do fabricante. Além disso, recomenda-se que os usuários leiam e entendam o manual automático do usuário coletor de frações.

  1. Permita que a coluna SEC se equilibre à temperatura ambiente.
  2. Ligue a AFC usando o interruptor de alimentação na parte de trás da unidade da torre e ajuste as configurações para a célula de carga, se necessário, pressionando A CONFIGURAÇÃO na tela sensível ao toque do menu principal. A célula de carga só deve ser calibrada após o primeiro uso, após cada atualização de software, e se a inconsistência nos volumes de coleta de frações for notada.
  3. Na tela SETUP , alinhe o carrossel selecionando carrossel > CALIBRATE. Insira o carrossel com os 13 pequenos orifícios voltados para a torre AFC e ajuste o carrossel para que o bocal de fluido esteja diretamente acima da posição de descarga pressionando os botões - e/ou + .
  4. Remova as tampas da coluna SEC equilibrada. Deslize a coluna SEC para o suporte de coluna apropriado e instale-a cuidadosamente na torre AFC. Certifique-se de que a etiqueta de identificação de radiofrequência (RFID) na coluna está em frente à AFC e verifique se a conexão entre a coluna e a válvula está segura. Coloque a tubulação de saída de resíduos em um recipiente de coleta.
  5. Na tela SETUP , selecione O Cronograma de Coleta e defina a contagem para 13 e o tamanho para 0,5 mL pressionando os botões - e/ou + . Deixe a configuração "Volume de buffer" como padrão de 2,7 mL e, em seguida, feche a janela "Agenda de coleta" pressionando X.
  6. Selecione START COLLECTION na tela inicial e confirme os parâmetros de coleta selecionando SIM. Carga 13 rotulados tubos de microcentrifuus de 1,7 mL com as tampas abertas e apontando para o centro do carrossel.
  7. Avance a AFC selecionando OK, em seguida, monte o reservatório da coluna e avance novamente pressionando OK. Selecione a opção de lavar a coluna pressionando SIM e adicione um volume de coluna de PBS filtrado de 0,2 μm para remover qualquer buffer de armazenamento. Uma vez que a descarga esteja completa, avance a AFC pressionando OK.
  8. Coloque a tampa do carrossel sobre a AFC e pressione OK. Prepare um volume de coluna de PBS filtrado de 0,2 μm. Use uma pipeta para remover qualquer excesso de buffer da coluna.
  9. Leve 3 mg de amostra de 100R quantificada na etapa 1,5 a 500 μL com 1x PBS. Adicione a amostra de 3 mgs à parte superior da coluna. Avance a AFC e deixe a amostra correr para o frit. Uma vez que a amostra tenha entrado totalmente na coluna, adicione o PBS preparado na etapa 2.6 ao reservatório.
  10. Monitore a execução da AFC enquanto ela coleta primeiro o volume vazio e, em seguida, as frações especificadas. Após a execução completa e o carrossel retorna à posição de resíduo, remova a tampa e remova os tubos de fração do carrossel. Armazene as frações a 4 °C antes da quantificação (etapa 3) e qualificação (etapa 4).
  11. Se a coluna for reutilizada, selecione a opção de limpar a coluna pressionando SIM; caso contrário, pressione NÃO. Siga as instruções da AFC.
    NOTA: Uma vez que a coluna é lavada e o buffer de armazenamento é executado, ele pode ser removido, tampado e armazenado a 4 °C.

3. Quantificação dos EVs Mtb

  1. Meça a concentração proteica para cada fração utilizando BCA e micro BCA12.
    1. Para frações de 0,5 mL coletadas de 3 mg de CFP de 100R Mtb, utilize o micro BCA com diluição de 1:3 para frações numeradas de 1 a 7 de cada amostra em triplicado.
    2. Para frações de 0,5 mL numeradas 5-13, use o BCA sem diluição para cada amostra em triplicado.
      NOTA: Sobrepor os ensaios para frações 5-7 ajudará a garantir que todas as frações tenham uma saída legível.
  2. Quantita a concentração de partículas para cada fração usando análise de rastreamento de nanopartículas (NTA).
    1. Diluir as amostras em 1 mL de 1x PBS utilizando as seguintes razões de partida sugeridas; para frações 1-3, use 1:100 e, em seguida, para as frações restantes, use uma diluição de 1:10.
    2. Vortex as soluções diluídas e, em seguida, desenhe a amostra em uma seringa descartável de 1 mL. Coloque a seringa em uma bomba de seringa automática se estiver disponível.
    3. Defina a bomba de seringa para 30 μL/min e use as configurações de captura de vídeo com um ganho de tela de 10-12 e um nível de câmera de 10-12. Ajuste o foco para cada amostra.
    4. Colete um mínimo de três vídeos a 30 s cada usando um fluxo constante.
    5. Realize a análise com o limiar de detecção de software definido para cinco.
      NOTA: Pode não ser possível obter dados NTA para as frações mais recentes (>7) sem sacrificar um volume amostral significativo.

4. Qualificação de EVs Mtb

  1. Visualize o perfil geral de proteína de cada fração usando um gel de proteína manchado de prata.
    NOTA: Procedimentos detalhados para SDS-PAGE e mancha de prata podem ser encontrados na Referência15.
    1. Adicione o buffer de amostra SDS a 10 μL de cada fração e 5 μg de CFP, 100R e 100F. Ferva por 5 min a 100 °C, depois carregue em um Gel Bis-Tris de 4%-12% com uma escada de peso molecular para eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE) (ver Tabela de Materiais).
    2. Execute o gel usando 1x 2-[N-morpholino]ácido esulfônico (MES) que executa o buffer (ver Tabela de Materiais) e uma corrente de 200 V por 35 min.
    3. Retire o gel do e prossiga com a coloração de prata15.
  2. Avalie a presença ou ausência de marcadores EV em cada fração por mancha ocidental.
    NOTA: Procedimentos detalhados para manchas ocidentais podem ser encontrados na Referência15.
    1. Execute um gel SDS-PAGE descrito nas etapas 4.1.1-4.1.2.
    2. Remova o gel do e transfira as proteínas resolvidas para uma membrana de nitrocelulose de 0,2 μm (ver Tabela de Materiais) aplicando uma corrente de 50 V por um mínimo de 1h.
    3. Realize a análise de manchas ocidentais para avaliar proteínas de interesse. Anticorpos primários contra LpqH, lipoarabinomannan (LAM) e GroES (ver Tabela de Materiais) são recomendados.
    4. Frações de pool com base na presença ou ausência de marcadores, conforme aplicável para a aplicação a jusante.
  3. Confirme a presença de vesículas intactas por microscopia eletrônica de transmissão (TEM).
    1. Fixar 15 μL da amostra de vesícula adicionando 15 μL de paraformaldeído de grau EM de 4% e armazenar a 4 °C durante a noite.
    2. Prepare uma grade TEM de cobre revestida de 200 malhas formvar-carbono limpando a superfície e fazendo um substrato hidrofílico.
      NOTA: Recomenda-se a limpeza plasmática com 95% de argônio, 5% de oxigênio e 30% de plasma por 1 min.
    3. Solte 10 μL da amostra fixa na rede e deixe a amostra aderir por 10 minutos, depois limpe o excesso de líquido com papel filtro.
    4. Flutue a rede em uma gota de água ultrauso por 30 s, em seguida, limpe o excesso de líquido.
    5. Flutue a rede em uma queda de acetato de urânl de grau D% EM por 2 minutos, depois limpe o excesso de líquido.
    6. Deixe a rede secar completamente.
    7. Imagem usando um TEM (ver Tabela de Materiais) a 100 kV ou similar.
      NOTA: Outros métodos de quantitação e caracterização do EV devem ser usados com base em aplicações a jusante. As Informações Mínimas para Estudos de VesículasExtracelulares 18 devem ser consultadas para orientações para garantir o rigor e a reprodutibilidade de todos os estudos de EV.

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Resultados

A proteína filtrada de cultura (PCC) de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) foi concentrada, quantificada e, em seguida, 3 mg de material foi aplicado a uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). As concentrações de proteínas e partículas foram enumeradas por BCA e NTA, respectivamente. As faixas esperadas para recuperação de proteínas e partículas mais os valores exatos obtidos para esses resultados são relatados na Tabela 1. Valores muito superiores a essas faixas podem indicar pro...

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Discussão

As vesículas extracelulares de micobacterium tuberculosis são reservatórios altamente antigênicos, que os apresentam como um caminho atraente para o desenvolvimento de ferramentas de diagnóstico e vacinas futuras 4,19,20. Historicamente, a ultracentrifugação de gradiente de densidade tem sido usada para separar EVs Mtb de outros materiais solúveis e secretos8. Embora esse processo seja eficaz, ta...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Gostaríamos de reconhecer o apoio do Prêmio Experiencial de Medicina Veterinária e Ciências Biomédicas e do Conselho de Pesquisa Universitária ao NKG e financiamento da ATCC (prêmio nº 2016-0550-0002) ao KMD. Também gostaríamos de reconhecer Anne Simpson por suporte técnico e recursos BEI, NIAID, NIH para os seguintes reagentes: Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763), IT-54 (produzido in vitro), NR-13792, Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (produzido in vitro), NR-49223, e Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 (produzido in vitro), NR-13811.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
20x MES SDS Running BufferThermoFisher ScientificNP0002
Placa de 96 poçosCorning15705-066
Coletor Automático de FraçõesIZON ScienceAFC-V1-USD
BenchMark Escada de Proteína Pré-coradaInvitrogen10748010
Centrífuga de BancadaBeckman CoulterAllegra 6R
Centricon Plus - Filtro centrífugo de 70, corte de 100 kDaMillipore SigmaUFC710008usado na etapa 1.1
Sistema de EletrotransferênciaThermoFisher Scientific09-528-135
Microscopia Eletrônicade Paraformaldeído de Grau EMCiências 15714-S
Formvar/Carbono 200 mesh GridsMicroscopia Eletrônica SciencesFCF200H--TA
Cabra Anti-Rato IgG H & L (Fosfatase Alcalina), molécula inteira, 1 mLAbCamab6790Anticorpo secundário
JEM-1400 Microscópio Eletrônico de TransmissãoJOEL
Micro BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23235
Leitor de microplacasBIOTEKEpoch
Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c)Recursos BEINR-49223Anticorpo primário
Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763)Recursos BEINR-13792Anticorpo primário
Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35Recursos BEINR-13811Anticorpo primário
NanoClean 1070Instrumentosde fisquionaPara limpeza de plasma da grade TEM
Nanosight equipado com bomba de seringa e computador com software NanoSight NTAMalvern PanalyticalNS300
Membrana de nitrocelulose, Rolo, 0,2 μ mBioRad1620112
NuPAGE 4-12% Géis de Proteína Bis-TrisThermoFisher ScientificNP0323BOX
Solução salina tamponada com fosfato, 1X sem cálcio e magnésioCorning21-040-CV
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23225
PowerPacBioRad1645050
qEV Original 35 nm 5/pkIZON ScienceSP5-USDSEC coluna
tampão de amostra SDSBosterAR1112Receita interna usada neste procedimento, no entanto, este produto é equivalente
à câmara de gel SDS-PAGEThermoFisher ScientificEI0001
Sigmafast BCIP/NBTMillipore SigmaB5655
Silver Stain Plus KitBioRad1610449Protocolo interno usado neste procedimento, no entanto, este kit é equivalente
Uranyl AcetateElectron Microscopy Sciences22400
Dispositivo de ultrafiltração Fonte de Alimentação Básica

Referências

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