Este protocolo descreve a cromatografia de exclusão de tamanho, uma técnica fácil e reprodutível para enriquecer as vesículas extracelulares mycobacterium tuberculosis de supernascedores culturais.
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Artigo de método
Mycobacterium tuberculosis Enriquecimento de vesícula extracelular através da cromatografia de exclusão de tamanho
Neste artigo
Resumo
Resumo
O papel das vesículas extracelulares (EVs) no contexto da infecção bacteriana surgiu como um novo caminho para a compreensão da fisiologia microbiana. Especificamente, os EVs Mycobacterium tuberculosis (Mtb) desempenham um papel na interação hospedeiro-patógeno e na resposta ao estresse ambiental. Os EVs Mtb também são altamente antigênicos e mostram potencial como componentes de vacinas. O método mais comum para purificar EVs Mtb é a ultracentrifugação gradiente de densidade. Esse processo tem várias limitações, incluindo baixo rendimento, baixo rendimento, dependência de equipamentos caros, desafios técnicos, podendo impactar negativamente a preparação resultante. A cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) é um método alternativo mais suave que combate muitas das limitações da ultracentrifugação. Este protocolo demonstra que a SEC é eficaz para o enriquecimento de EV Mtb e produz preparações de EV Mtb de alta qualidade de maior rendimento de forma rápida e escalável. Além disso, uma comparação com a ultracentrifugação de gradiente de densidade por procedimentos de quantificação e qualificação demonstra os benefícios da SEC. Enquanto a avaliação da quantidade de EV (análise de rastreamento de nanopartículas), fenótipo (microscopia eletrônica de transmissão) e conteúdo (mancha ocidental) é adaptado para EVs Mtb, o fluxo de trabalho fornecido pode ser aplicado a outras micobactérias.
Introdução
A liberação de vesícula extracelular (EV) por patógenos pode ser a chave para desbloquear novas tecnologias para controlar doenças infecciosas1. A micobacterium tuberculosis (Mtb) é um patógeno de alta consequência, infectando aproximadamente um terço da população mundial e reivindicando a vida de milhões de pessoas a cada ano2. A produção de EV por Mtb é bem documentada, mas evasiva nos papéis biogêneses e variados (ou seja, imunoestimulatório, imunossupressor, aquisição de ferro e nutrientes) desses EVs no contexto da infecção 3,4,5
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Protocolo
O Comitê de Biossegurança Institucional da Universidade estadual do Colorado aprovou o presente estudo (19-046B). O cultivo de Mycobacterium tuberculosis e a colheita de supernacantes culturais ricos em EV foram realizados por pessoal treinado em um laboratório de alta contenção. Os materiais foram retirados da área de alta contenção após a realização de um método de inativação válido, confirmado e aprovado por políticas institucionais de biossegurança. Ao replicar o protocolo, se a inativação validada ou o método de filtragem estéril não forem viáveis, os seguintes procedimentos precisam ser realizados em laboratório de alta contenção.
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Resultados
A proteína filtrada de cultura (PCC) de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) foi concentrada, quantificada e, em seguida, 3 mg de material foi aplicado a uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). As concentrações de proteínas e partículas foram enumeradas por BCA e NTA, respectivamente. As faixas esperadas para recuperação de proteínas e partículas mais os valores exatos obtidos para esses resultados são relatados na Tabela 1. Valores muito superiores a essas faixas podem indicar pro.......
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Discussão
As vesículas extracelulares de micobacterium tuberculosis são reservatórios altamente antigênicos, que os apresentam como um caminho atraente para o desenvolvimento de ferramentas de diagnóstico e vacinas futuras 4,19,20. Historicamente, a ultracentrifugação de gradiente de densidade tem sido usada para separar EVs Mtb de outros materiais solúveis e secretos8. Embora esse processo seja eficaz, ta.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Gostaríamos de reconhecer o apoio do Prêmio Experiencial de Medicina Veterinária e Ciências Biomédicas e do Conselho de Pesquisa Universitária ao NKG e financiamento da ATCC (prêmio nº 2016-0550-0002) ao KMD. Também gostaríamos de reconhecer Anne Simpson por suporte técnico e recursos BEI, NIAID, NIH para os seguintes reagentes: Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763), IT-54 (produzido in vitro), NR-13792, Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (produzido in vitro), NR-49223, e Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 (produzido in vitro), NR-13811.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 20x MES SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientific | NP0002 | |
| Placa de 96 poços | Corning | 15705-066 | |
| Coletor Automático de Frações | IZON Science | AFC-V1-USD | |
| BenchMark Escada de Proteína Pré-corada | Invitrogen | 10748010 | |
| Centrífuga de Bancada | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Centricon Plus - Filtro centrífugo de 70, corte de 100 kDa | Millipore Sigma | UFC710008 | usado na etapa 1.1 |
| Sistema de Eletrotransferência | ThermoFisher Scientific | 09-528-135 | |
| Microscopia Eletrônica | de Paraformaldeído de Grau EM | Ciências 15714-S | |
| Formvar/Carbono 200 mesh Grids | Microscopia Eletrônica Sciences | FCF200H--TA | |
| Cabra Anti-Rato IgG H & L (Fosfatase Alcalina), molécula inteira, 1 mL | AbCam | ab6790 | Anticorpo secundário |
| JEM-1400 Microscópio Eletrônico de Transmissão | JOEL | ||
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Leitor de microplacas | BIOTEK | Epoch | |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c) | Recursos BEI | NR-49223 | Anticorpo primário |
| Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763) | Recursos BEI | NR-13792 | Anticorpo primário |
| Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 | Recursos BEI | NR-13811 | Anticorpo primário |
| NanoClean 1070 | Instrumentos | de fisquionaPara limpeza de plasma da grade TEM | |
| Nanosight equipado com bomba de seringa e computador com software NanoSight NTA | Malvern Panalytical | NS300 | |
| Membrana de nitrocelulose, Rolo, 0,2 μ m | BioRad | 1620112 | |
| NuPAGE 4-12% Géis de Proteína Bis-Tris | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| Solução salina tamponada com fosfato, 1X sem cálcio e magnésio | Corning | 21-040-CV | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| PowerPac | BioRad | 1645050 | |
| qEV Original 35 nm 5/pk | IZON Science | SP5-USD | SEC coluna |
| tampão de amostra SDS | Boster | AR1112 | Receita interna usada neste procedimento, no entanto, este produto é equivalente |
| à câmara de gel SDS-PAGE | ThermoFisher Scientific | EI0001 | |
| Sigmafast BCIP/NBT | Millipore Sigma | B5655 | |
| Silver Stain Plus Kit | BioRad | 1610449 | Protocolo interno usado neste procedimento, no entanto, este kit é equivalente |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
Referências
- Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond. FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).
- World Health Organization. GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021. World Health Organization. , (2021).
- Prados-R....
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Reimpressões e permissões
