A eletroporação do DNA plasmídeo no músculo esquelético é um método viável para modular a expressão genética sem comprometer a contratilidade muscular em camundongos.
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Artigo de método
Eletroporação do DNA plasmídeo no músculo esquelético do rato
Neste artigo
Resumo
Resumo
A modulação da expressão genética transitória no músculo esquelético murino por eletroporação plasmida é uma ferramenta útil para avaliar a fisiologia normal e patológica. A superexpressão ou derrubada de genes-alvo permite aos pesquisadores manipular eventos moleculares individuais e, assim, entender melhor os mecanismos que afetam a massa muscular, o metabolismo muscular e a contralidade. Além disso, a eletroporação de plasmídeos de DNA que codificam etiquetas fluorescentes permite aos pesquisadores medir mudanças na localização subcelular de proteínas no músculo esquelético in vivo. Uma avaliação funcional chave do músculo esquelético inclui a medição da contralução muscular. Neste protocolo, demonstramos que estudos de contratude muscular ainda são possíveis após injeção de DNA plasmid, eletroporação e modulação da expressão genética. O objetivo deste procedimento instrucional é demonstrar o método passo-a-passo da eletroporação plasmóide de DNA no músculo esquelético do camundongo para facilitar a absorção e a expressão nos miofibers dos músculos tibialis anterior e extensor digitorum longus, bem como demonstrar que a contratilação muscular esquelética não está comprometida pela injeção e eletroporação.
Introdução
A eletroporação de DNA plasmídeo no músculo esquelético in vivo é uma ferramenta importante para avaliar alterações na fisiologia muscular esquelética e na sinalização molecular, modulando a expressão genética em uma variedade de condições fisiológicas e fisiofisiológicas 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . A transferência genética experimental para o músculo esquelético foi ....
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Protocolo
Todos os experimentos com animais foram realizados no Penn State College of Medicine, aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Penn State University, e realizados de acordo com os padrões éticos estabelecidos na Declaração de Helsinque de 1964 e suas alterações posteriores. Foram utilizados camundongos C57BL/6 fêmeas de 12 semanas de idade para este procedimento. Todas as ferramentas cirúrgicas foram autoclavadas para esterilidade antes da experimentação.
1. Preparação de injeção/eletroporação ta e EDL
NOTA: Estes passos são idênticos para a preparação de injeção/eletropor....
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Resultados
A eletroporação para facilitar a transferência genética no músculo esquelético é uma técnica útil usada para avaliar alterações na fisiologia muscular. Demonstramos um procedimento detalhado passo a passo para realizar uma transferência genética eficiente nos músculos TA e EDL. As diferenças na eficiência da transfecção ocorrem devido a uma série de variáveis. Entre essas variáveis estão parâmetros de eletroporação (pulsos, tensão, duração do pulso, etc.), tamanho da construção genética e concentração/volume de DNA injet.......
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Discussão
A transferência genética in vivo no músculo esquelético reforçada pela eletroporação é uma ferramenta útil e relativamente simples para modular a expressão proteica no músculo. Mostramos as etapas necessárias para alcançar uma transferência genética eficiente nos músculos EDL e TA e demonstramos que a medição da contratilidade do EDL é viável após o procedimento. Esta técnica não requer vetores virais mais complicados e permite a comparação de fibras transfeinadas e não transfectadas transfectadas de fibras tran.......
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Divulgações
B.A.H. e D.L.W alegam não haver conflitos de interesse.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sutura de nylon 4-0 (não absorvível) | Sutura Ethicon | 662G | para fechar a incisão na pele |
| 50µ l Seringa Hamilton | Microsseringa | Hamilton | 80501 |
| C57BLl/6NHsd camundongos | Envigo | 044 | Camundongos fêmeas de 12 semanas usados para experimentação |
| Eletrodo de paquímetro | BTX | 45-0102 | 1,0 cm x 1,0 cm de aço inoxidável |
| Muscular Dinâmico Aquisição/análise de dados | Aurora Scientific | 605A | Software usado para medição e análise da contratilidade muscular |
| ECM 830 Sistema de Eletroporação | BTX | 45-0662 | eletroporador |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Kit de purificação de plasmídeo |
| Tesoura extra estreita | Ferramentas de ciência fina | 14088-10 | Tesoura para dissecção romba |
| Transdutor de força | Aurora Scientific | 407A | Para medir a força de |
| EDL Micro-Masquito Hemastats | Ferramentas de Belas Ciências | 13010-12 | Hemastatos para suturtura |
| do vetor de expressão de mamíferos pcDNA3.1 | Fisher Scientific | V79020 | Vetor de controle |
| plasmídeo de expressão pcDNA3-EGFP | Addgene | 13031 | Plasmídeo para expressão de GFP |
| Pinça curva Semken | Ferramentas de Belas Ciências | 11009-13 | Pinça para cirurgia |
| Lâminas cirúrgicas de aço inoxidável nº 10 | Becton Dickinson | 37 1210 | Lâminas de bisturi |
| Tissue-Tek O.C.T. mídia | VWR | 25608-930 | Mídia de congelamento para histologia |
| Aglutinina de Gérmen de Trigo- Texas Red | Thermo-Fisher Scientific | W21405 | Coloração de membrana para seção transversal muscular |
Referências
- Dodd, S., Hain, B., Judge, A. Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats. Biogerontology. 10, 605-611 (2009).
- Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse. Muscle and Nerve.
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Reimpressões e permissões
