Eletroporação do DNA plasmídeo no músculo esquelético do rato

A eletroporação de DNA plasmídeo no músculo esquelético in vivo é uma ferramenta importante para avaliar alterações na fisiologia muscular esquelética e na sinalização molecular, modulando a expressão genética em uma variedade de condições fisiológicas e fisiofisiológicas 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . A transferência genética experimental para o músculo esquelético foi demonstrada já em 1990 por Wolff et al., onde tanto o RNA quanto o DNA foram transferidos com sucesso sem eletroporação, e a expressão da luciferase foi mantida por pelo menos 2 meses^{e 10}. A eficiência relativamente baixa de transfecção com injeção é apenas problemática, e Aihara e Miyazaki demonstraram aumento da transferência genética com eletroporação em 1998, eletroporando uma construção pCAGGS-IL-5 no músculo tibialis anterior (TA) e medindo a expressão sérica IL-5¹¹. Desde então, muitos estudos têm investigado a eficácia de diferentes concentrações de DNA, volumes e parâmetros de eletroporação para garantir a eficiência máxima da transferência genética. Mir et al. testaram diferentes parâmetros de eletroporação, incluindo tensão, número de pulso, duração do pulso e frequência, bem como concentração de DNA, e determinaram que maior tensão, número de pulso e concentração de DNA contribuíram para o aumento da eficiência da eletroporação¹². Uma grande ressalva à alta tensão eletroporação é que, embora facilite o aumento da absorção de DNA em miofibers, também causa danos musculares, o que pode confundir resultados. Schertzer et al. mostraram que a eletroporação a 200 V causou danos em cerca de 50% dos myofibers 3 dias após a eletroporação, enquanto apenas 10% dos myofibers foram danificados em 50 V¹³. Levamos em consideração as variáveis que afetam a transferência eficiente de DNA versus dano muscular e descobrimos que uma tensão de 125 V por centímetro de largura de pinça é suficiente para realizar uma transferência genética eficaz.

A análise da área transversal da fibra muscular e da contralidade muscular inteira após a eletroporação são aspectos importantes do método para medir mudanças no tamanho e função muscular devido à modulação genética. Nós e outros já demonstramos anteriormente que a eletroporação de vetores de controle por si só não causa uma diminuição na área de miofibra. A construção da proteína fluorescente verde (EGFP) foi um indicador fluorescente útil da transfecção de DNA nestes estudos^13,14. Vários estudos investigaram a contração in situ do TA após a eletroporação e encontraram resultados variados. Um estudo mostrou que a eletroporação de 75 V/cm causou uma redução de cerca de 30% na força tetanica 3 dias após a eletroporação, e em 7 dias após a eletroporação, a força tetanica voltou ao nível de controle, enquanto a eletroporação de 50 V/cm não comprometeu a força^13,15. Outro estudo mostrou que houve uma perda de 30% da força tetanica 3h após a eletroporação de 180 V/cm, que se recuperou para os níveis de força falsa após 7 dias¹⁶.

No procedimento detalhado a seguir, demonstramos injeção e eletroporação de um plasmídeo pcDNA3-EGFP nos músculos TA e extensor digitorum longus (EDL) de camundongos. Também demonstramos que este método não afeta a contratude muscular total edl. O objetivo é demonstrar uma absorção plasmida eficiente em myofibers sem causar perda de função.

Todos os experimentos com animais foram realizados no Penn State College of Medicine, aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Penn State University, e realizados de acordo com os padrões éticos estabelecidos na Declaração de Helsinque de 1964 e suas alterações posteriores. Foram utilizados camundongos C57BL/6 fêmeas de 12 semanas de idade para este procedimento. Todas as ferramentas cirúrgicas foram autoclavadas para esterilidade antes da experimentação.

1. Preparação de injeção/eletroporação ta e EDL

NOTA: Estes passos são idênticos para a preparação de injeção/eletroporação TA e EDL.

1. Purificar construções plasmídeos de expressão a uma concentração de 1 μg/μL diluída em PBS estéril antes do experimento. Para este procedimento, foi utilizado um kit de purificação comercialmente disponível sem endotoxinas para purificar o vetor vazio pcDNA3-EGFP (GFP) ou o pcDNA3 vazio (controle).
2. Calcule a concentração plasmida para garantir o volume adequado de injeção (TA 50 μg de DNA em 50 μL de PBS estéril; EDL 10 μg de DNA em 10 μL de PBS estéril) e amostras de alíquota.
3. Programe as configurações do eletroporador utilizando a roda selecionada e deprimindo a roda para escolher os parâmetros da seguinte forma: Modo - LV, Tensão - 12,5 V/mm (a ser ajustado no momento da injeção), comprimento do pulso - 20 ms, número de pulsos - 5, intervalo - 200 ms, polaridade - unipolar.
4. Anestesiar os ratos usando gás isoflurane. Coloque os ratos em uma caixa de indução com 5% de isoflurane. Confirme o plano cirúrgico da anestesia pela ausência do reflexo do dedo do pé usando fórceps e reduza a isoflurane para 2% de dose de manutenção. Transfira os ratos para um cone de nariz apropriado descansando em uma placa de água circulante a 37 °C para o resto do procedimento.
5. Remova o cabelo de ambos os traseiros usando pequenos cortadores de cabelo. Esfregue os membros inferiores com 70% de etanol/betadina alternados para higienizar a área de injeção.

2. Injeção/eletroporação de TA

1. Com o rato em posição supina, localize o tendão ta visível através da pele no lado lateral da perna inferior. Utilizando uma microeringa de 50 μL com uma agulha destacável de 30 G, insira a agulha 1-2 mm superior à junção miotendinous em um ângulo raso de 5° até que a agulha atinja a extremidade superior do músculo.
   NOTA: A injeção no meio do músculo é o objetivo.
2. Deprimir lentamente o êmbolo enquanto retrai lentamente a agulha ao longo do caminho da injeção para fornecer 50 μL de solução plasmida. O músculo deve inchar.
3. Coloque o temporizador por 1 min e meça a espessura da perna no TA. Dependendo do tamanho do mouse, isso pode ser de 5 a 10 mm. Coloque os eletrodos de pinça na espessura medida e coloque a tensão eletroporante em 12,5 V/mm.
4. Depois de 1 min, coloque os eletrodos de pinça ao redor do membro inferior. Os eletrodos devem ser aconchegantes, mas não muito apertados. Entregue 5 pulsos de ondas quadradas, com 20 ms de duração e intervalos de 200 ms (o músculo deve se contrair com cada pulso).
5. Repita com o membro alternativo usando o vetor de controle.
6. Remova o mouse da anestesia e deixe que ele se recupere em uma almofada de aquecimento a 37 °C. Uma vez recuperado, devolva o rato para sua gaiola.

3. Injeção/eletroporação de EDL

1. Com o rato em uma posição supina, localize a crista anterior do osso da tíbia visualmente e através de uma palpação suave.
   1. Usando um bisturi, faça uma incisão rasa através da pele no lado lateral da crista anterior da tíbia 5 mm inferior ao joelho até 2 mm superior à junção miotendinous TA.
   2. Usando uma tesoura pequena, disseque a fáscia, expondo o músculo TA.
   3. Novamente, usando dissecção sem corte com tesoura, separe o músculo TA da tíbia suavemente puxando o músculo lateralmente, expondo o EDL. Fórceps pequenos e curvos podem ser usados para manter o TA afastado do EDL durante o procedimento.
2. Usando uma micro-seringa de 50 μL com uma agulha destacável de 30 G, insira a agulha no EDL longitudinalmente até que a agulha atinja a extremidade superior do músculo.
3. Deprimir lentamente o êmbolo enquanto retrai lentamente a agulha ao longo do caminho da injeção para injetar 10 μL da solução plasmida (o músculo deve inchar).
4. Defina um temporizador por 1 min e meça a espessura da perna no EDL. Dependendo do tamanho do mouse, isso pode ser de 5 a 10 mm. Coloque os eletrodos de pinça na espessura medida e coloque a tensão eletroporante em 12,5 V/mm.
5. Depois de 1 min, coloque os eletrodos de pinça ao redor do membro inferior. Os eletrodos devem ser aconchegantes, mas não muito apertados. Entregue 5 pulsos de ondas quadradas, com 20 ms de duração e intervalos de 200 ms (o músculo deve se contrair com cada pulso).
6. Feche a incisão usando suturas descartáveis de nylon 4/0 não absorvíveis.
7. Repita com o membro alternativo ou deixe o membro intocado como controle absoluto.
8. Remova o mouse da anestesia e deixe que ele se recupere em uma almofada de aquecimento a 37 °C. Administre um analgésico subcutâneo apropriado imediatamente após a cirurgia e 12-24 h após a cirurgia. Uma vez recuperado, devolva o rato para sua gaiola.
   NOTA: Estudos anteriores mostraram um déficit de contratilidade muscular no TS imediatamente após a eletroporação e que a recuperação contratil ocorre ao longo de 3 dias ^13,15. Por essa razão, a análise dos músculos TA e EDL para histologia, expressão proteica ou contralidade muscular é realizada de 3 a 10 dias após a eletroporação. A expressão prolongada de EGFP foi observada até 3 semanas após o procedimento¹³.

A eletroporação para facilitar a transferência genética no músculo esquelético é uma técnica útil usada para avaliar alterações na fisiologia muscular. Demonstramos um procedimento detalhado passo a passo para realizar uma transferência genética eficiente nos músculos TA e EDL. As diferenças na eficiência da transfecção ocorrem devido a uma série de variáveis. Entre essas variáveis estão parâmetros de eletroporação (pulsos, tensão, duração do pulso, etc.), tamanho da construção genética e concentração/volume de DNA injetado. Já mostramos anteriormente que os parâmetros de eletroporação de 5 pulsos a 125 V/cm, com duração de 20 ms separadas por intervalos de 200 ms, são suficientes para realizar uma transferência genética eficiente no TA14. Também demonstramos no presente estudo que a injeção/eletroporação do DNA não causa perda de contrailidade muscular no EDL 3 dias após a experimentação.

Para visualizar a transferência genética, uma construção pcDNA3-EGFP ou pcDNA3 (controle) foi eletroporada no músculo TA ou EDL do rato. 3 dias após o procedimento, o TA ou EDL foi cuidadosamente dissecado, colocado em mídia de temperatura de corte ideal (OTC) e snap-congelado em isopentano líquido resfriado com nitrogênio (2-metilbutano), como descrito anteriormente 14,17,18,19. 10 μm seções musculares foram obtidas utilizando-se um criostatado retirado da barriga média de cada músculo. As seções foram então incubadas em 1% de paraformaldeído por 5 min, seguidas por 3-5 min de lavagem em PBS. As seções foram então incubadas em aglutina de germe de trigo conjugado ao Texas Red diluído 1:100 na PBS por 90 minutos no escuro. As seções foram novamente lavadas na PBS 3 vezes por 5 minutos cada. As seções musculares foram então cobertas em meios de montagem aquosos e imagens no comprimento de onda de 594 nm (vermelho) para visualizar as fibras musculares individuais e em comprimento de onda de 480 nm para detectar GFP (Figura 1A). Os músculos de controle injetados com pcDNA3 foram visualizados em ambos os canais com as mesmas configurações de exposição para controlar a potencial autofluorescência. Os músculos injetados/eletroporados com EGFP apresentaram fibras verdes positivas, demonstrando a absorção do construto pcDNA3-EGFP, enquanto os músculos injetados/eletroporados com pcDNA3 (controle) não mostraram fibras positivas verdes. Nós e outros já mostramos anteriormente que a área transversal da miofibra não está comprometida pela expressão GFP, comparando fibras positivas de GFP (verde) com fibras não-GFP expressando fibras (pretas) dentro das mesmas seções musculares 4,6,19. Quando visualizada em uma ampliação mais baixa, a eficiência de transfecção muscular edl é visualizada através do aparecimento de fibras verdes (positivas) versus fibras pretas (negativas) (Figura 1B). A eficiência de transfecção com este procedimento foi de 56,6% ± 4,7%, medida em 3 músculos EDL. Esses dados mostram que a injeção e eletroporação do músculo TA é suficiente para uma transferência genética eficiente. Além disso, a injeção e a eletroporação do EDL provocam uma absorção eficiente de construções genéticas.

Uma ferramenta importante para a avaliação da fisiologia muscular esquelética é a medição da contralidade muscular. Investigadores anteriores mostraram que a contratibilidade do TA medido in situ pode ser comprometida mais cedo após a injeção e eletroporação do membroposterior 13. A fim de testar se a contrailidade edl está comprometida após a injeção e eletroporação, nós cirurgicamente expusemos o EDL, injetamos-o com pcDNA3-EGFP ou construmos, e eletroporamos o retroescavo. Como controle, o membro alternativo foi deixado intocado para comparação. Os camundongos foram eutanizados 3 dias depois, e a contralidade muscular total de EDL foi medida usando estimulação de campo em um banho fisiológico, como descrito anteriormente 14,19,20,21. Resumidamente, o EDL foi dissecado, e os tendões foram amarrados via sutura de seda 4/0 a ganchos de aço inoxidável e suspensos entre um transdutor de força e base estática. Os músculos foram banhados em tampão de Tyrode, que é uma solução fisiológica de banho (121 mM NaCl, 5,0 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, 0,4 mM NaH2PO4, 24 mM NaHCO3, 0,1 mM EDTA, 5,5 mM de glicose) e borbulhado com 100% de oxigênio durante todo o procedimento. A contração muscular foi estimulada usando eletrodos de platina para fornecer um estímulo supramaximal. O comprimento ideal muscular (Lo) foi ajustado para produzir a força máxima no início do procedimento. A relação de frequência de força foi determinada utilizando-se frequências de estimulação entre 1-150 Hz (pulsos de 0,5 ms na tensão supramaximal). O músculo foi autorizado a relaxar por 3 minutos entre cada estimulação. Após a conclusão do procedimento de estimulação, o peso e o comprimento do músculo foram medidos. A força específica foi calculada pela normalização da força absoluta para toda a área transversal muscular, que é calculada como o peso dividido pelo comprimento e utilizando a constante de densidade muscular previamente determinada (1,056 kg/m−3)21. Mostramos que os EDLs injetados e eletroporados representativos têm respostas tetanicas semelhantes a 100 Hz em comparação com o controle de músculos não injetados ou eletroporados (Figura 2A e Figura 2B). Encontramos força tetanica muscular, força tetanica específica, tempo para pico de tensão, e metade do tempo de relaxamento não foram comprometidos no EDL injetado e eletroporado em comparação com o controle intocado (Tabela 1). Nossos dados demonstram que a expressão proteica que afeta a contratude pode ser modulada usando eletroporação no EDL sem causar efeitos adversos.

Figura 1: A eletroporação do pcDNA3-EGFP é suficiente para a captação de DNA no músculo TA e EDL. A) Seções transversais representativas dos controles TA e EDL (injetadas com vetor de controle e eletroporada 125 V/cm) e GFP (injetadas com pcDNA3-EGFP e eletroporadas 125 V/cm). Barra de escala 50 μm. B) Seção transversal representativa do EDL demonstrando eficiência de transfecção. Barra de escala 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: A injeção e a eletroporação não comprometem a função muscular. Curvas de força tetanica representativa a 100 Hz de A) EDL não injetada/eletroporada (controle) e B) injetadas/eletroporadas EDL (GFP). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Contratidade muscular total do controle versus EDLs eletroporados. Tabela mostrando que diferentes parâmetros de força muscular não estão comprometidos em EDLs injetados/eletroporados (GFP) em comparação com controles não injetados/não eletroporados. F0 = força tetanica a 100 Hz, sF0 = força tetanica específica a 100 Hz, TTP = tempo para máxima tensão em 1 Hz, RT1/2 = tempo de relaxamento. Teste t do aluno; Significância em p = 0,05. n = 3.

B.A.H. e D.L.W alegam não haver conflitos de interesse.