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Artigo de método

Preparação amostral para análise rápida lipídica no cérebro de Drosophila usando desorção a laser assistida por matriz/imagem de espectrometria de massa

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DOI:

10.3791/63930

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14 de julho de 2022

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1Advanced Science Research Center, Neuroscience Initiative, the City University of New York, Graduate Center New York, 2Advanced Science Research Center, Structural Biology Initiative, the City University of New York, Graduate Center, 3National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 4The City College of New York, CUNY, 5Macaulay Honors College, CUNY, 6Graduate School of Public Health and Health Policy, The City University of New York, 7Princeton University, 8Ardrey Kell High School, 9The Borough of Manhattan Community College, CUNY, 10Gallatin School of Individualized Study, New York University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

O objetivo deste protocolo é fornecer orientação detalhada sobre a preparação adequada da amostra para análise lipídica e metabólito em pequenos tecidos, como o cérebro de Drosophila , utilizando imagens de espectrometria de massa a laser assistida por matriz(MALDI).

Resumo

O perfil lipídida, ou lipidomics, é uma técnica bem estabelecida usada para estudar todo o conteúdo lipídudo de uma célula ou tecido. As informações adquiridas a partir da lipidemia são valiosas no estudo das vias envolvidas no desenvolvimento, doença e metabolismo celular. Muitas ferramentas e instrumentações têm auxiliado projetos lipidômicos, mais notavelmente várias combinações de espectrometria de massa e técnicas de cromatografia líquida. A desorção/ionização de massa de desorção/ionização de massa assistida por matriz (MALDI MSI) emergiu recentemente como uma poderosa técnica de imagem que complementa abordagens convencionais. Esta nova técnica fornece informações únicas sobre a distribuição espacial de lipídios dentro de compartimentos teciduais, que antes eram inatingíveis sem o uso de modificações excessivas. A preparação amostral da abordagem MALDI MSI é crítica e, portanto, é o foco deste artigo. Este artigo apresenta uma rápida análise lipídica de um grande número de cérebros de Drosophila embutidos no composto de temperatura de corte ideal (OCT) para fornecer um protocolo detalhado para a preparação de pequenos tecidos para análise lipídica ou metabólito e análise de moléculas pequenas através do MALDI MSI.

Introdução

Os lipídios estão envolvidos em uma ampla gama de processos biológicos e podem ser amplamente classificados em cinco categorias com base em sua diversidade estrutural: ácidos graxos, triaciglicerols (TAGs), fosfolipídios, lipídios de esterol e sphingolipids1. As funções fundamentais dos lipídios são fornecer fontes de energia para processos biológicos (ou seja, TAGs) e formar membranas celulares (ou seja, fosfolipídios e colesterol). No entanto, funções adicionais de lipídios têm sido observados no desenvolvimento e nas doenças, e têm sido extensivamente estudados no campo biomédico. Por exemplo, relatórios mostraram que ácidos graxos de diferentes comprimentos podem ter papéis terapêuticos únicos. Cadeias de ácidos graxos curtos podem estar envolvidas em mecanismos de defesa contra doenças autoimunes, cadeias de ácidos graxos de médio comprimento produzem metabólitos que podem mitigar convulsões, e longas cadeias de ácidos graxos geram metabólitos que podem ser usados para tratar distúrbios metabólicos2. No sistema nervoso, o colesterol derivado da glia e os fosfolipídios têm se mostrado vitais para a sinálogogênese 3,4. Outros tipos de lipídios têm se mostrado promissores em aplicações médicas, incluindo sphingolipids utilizados em sistemas de entrega de medicamentos e sacarolipidos usados para suportar o sistema imunológico 5,6. Os numerosos papéis e potenciais aplicações terapêuticas de lipídios no campo biomédico tornaram a lipidomia — o estudo das vias e interações dos lipídios celulares — um campo crítico e cada vez mais importante.

Lipidomics faz uso de química analítica para estudar o lipidome em grande escala. Os principais métodos experimentais utilizados na lipidomics baseiam-se na espectrometria de massa (MS), juntamente com várias técnicas de cromatografia e mobilidadede íons 7,8. O uso de ESM na área é vantajoso devido à sua alta especificidade e sensibilidade, velocidade de aquisição e capacidades únicas para (1) detectar lipídios e metabólitos lipídes que ocorrem mesmo em níveis baixos e transitórios, (2) detectar centenas de compostos lipídes de lipídios diferentes em um único experimento, (3) identificar lipídios até então desconhecidos e (4) distinguir entre isômeros lipídes. Entre os desenvolvimentos em MS, incluindo a ionização de eletrospray de desorção (DESI), MALDI e espectrometria de massa de íons secundários (SIMS), o MALDI MSI emergiu como uma poderosa técnica de imagem que complementa abordagens convencionais baseadas em MS, fornecendo informações únicas sobre a distribuição espacial de lipídios dentro dos compartimentosteciduais 9,10.

O fluxo de trabalho típico de lipidomics consiste na preparação da amostra, aquisição de dados utilizando tecnologia de espectrometria de massa e análise de dados11. O estudo de lipídios e metabólitos em amostras levou ao surgimento de técnicas para compreender as condições fisiológicas e patológicas dos processos metabólicos em organismos. Embora a compreensão das interações biológicas seja importante, a sensibilidade dos lipídios e metabólitos torna-os difíceis de imagem e identificação sem corantes ou outras modificações. Alterações nos níveis de metabólito ou distribuição podem levar a alterações fenotípicas. Uma ferramenta usada para o perfil metabolômico é o MALDI MSI, uma técnica de imagem in situ livre de rótulos capaz de detectar centenas de moléculas simultaneamente. A imagem MALDI permite a visualização de metabólitos e lipídios em amostras, preservando sua integridade e distribuição espacial. A tecnologia anterior para o perfil lipídicos envolvia o uso de produtos químicos radioativos para mapear individualmente lipídios, enquanto a imagem MALDI deixa isso e permite a detecção de uma série de lipídios simultaneamente.

O metabolismo lipídico e a homeostase desempenham funções importantes na fisiologia celular, como a manutenção e o desenvolvimento do sistema nervoso. Um aspecto essencial do metabolismo lipídico do sistema nervoso é o fechamento lipídico entre neurônios e células gliais, que é mediado por lipoproteínas portadoras moleculares, incluindo lipoproteína de baixa densidade (VLDL), lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e lipoproteínas de alta densidade (HDL)12). As lipoproteínas contêm apolipoproteínas (Apo), como ApoB e ApoD, que funcionam como blocos estruturais de carga lipídica e como ligantes para receptores de lipoproteína. O crosstalk neuron-glia de lipídios envolve múltiplos jogadores como ApoD derivado da glia, ApoE e ApoJ, e seus receptores LDL neuronais (LDLRs)13,14. Em Drosophila, apolipophorina, um membro da família ApoB, é um grande portador lipídfo hemoglifo15. A apolipophorina possui dois receptores de lipophorina intimamente relacionados (LpRs), LpR1 e LpR2, que são homólogos do mamífero LDLR15,16. Em estudos anteriores, a lipocalina-arócito Glial Lazarillo (GLaz), um homólogo de Dpophila do ApoD humano, e seu receptor neuronal LpR1 foram descobertos para mediar cooperativamente o fechamento lipídico neuron-glia, regulando assim a morfogênesedendrite 17. Portanto, especula-se que a perda de LpR1 causaria uma diminuição no conteúdo lipídudo global no cérebro de Drosophila. Maldi MSI seria uma ferramenta adequada para traçar o perfil do conteúdo lipídico em pequenos tecidos de cérebros Drosophila mutantes e selvagens, como demonstrado neste estudo.

Apesar da crescente popularidade do MALDI MSI, o alto custo e a complexidade experimental do instrumento muitas vezes impedem sua implementação em laboratórios individuais. Assim, a maioria dos estudos maldi MSI são realizados utilizando instalações de núcleo compartilhado. Como acontece com outras aplicações do MALDI MSI, um cuidadoso processo de preparação de amostras para lipidomics é fundamental para alcançar resultados confiáveis. No entanto, como a preparação de slides de amostras é tipicamente realizada em laboratórios de pesquisa individuais, há possibilidade de variação na aquisição do MALDI MSI. Para combater isso, este artigo tem como objetivo fornecer um protocolo detalhado para a preparação amostral de pequenas amostras biológicas antes da medição do MALDI MSI utilizando a análise lipídica de um grande grupo de cérebros adultos de Drosophila em modo de íon positivo como exemplo11,17. No entanto, algumas classes fosfolipítidas e a maioria dos pequenos metabólitos são favoravelmente detectadas por imagens MALDI no modo íon negativo, que foi descrito anteriormente11. Portanto, com esses dois estudos de exemplo, esperamos fornecer protocolos detalhados de preparação de amostras de várias combinações: tecido grande autônomo versus tecido pequeno incorporado, montagem de degelo versus montagem de lâmina quente e modo íon positivo versus modo íon negativo.

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Protocolo

1. Incorporação de cabeça de mosca

NOTA: Todo o procedimento leva ~45-60 min.

  1. Prepare o estágio ideal de composto de temperatura de corte (composto OCT) com uma superfície plana.
    1. Adicione OCT em uma criomolda plástica (15 mm x 15 mm x 5 mm) à metade da profundidade do criomold e evite a formação de bolhas. Deixe o molde em uma superfície plana por vários minutos e, em seguida, transfira-o para o gelo seco.
    2. Mantenha o criomold plano no gelo seco e permita que o OCT forme uma superfície plana e uniforme. Espere até que o OCT esteja totalmente solidificado no molde. Use imediatamente as etapas OCT congeladas ou armazene-as a −80 °C.
  2. Anesthetize moscas adultas usando CO2 (ou seja, uma almofada de CO2 ).
    1. Prepare uma placa de Petri contendo um pedaço de lenço de laboratório. Use água para umedecer parte da limpeza para reduzir a eletricidade estática. Mantenha o lenço meio molhado e meio seco.
    2. Sob o escopo dissecando 1, use fórceps para cortar a cabeça de mosca. Colete 4-5 cabeças cada vez e coloque-as na área seca do lenço de laboratório.
      NOTA: A coleção de 4-5 cabeças leva ~ 2 minutos.
  3. Transfira a etapa oct do gelo seco para o escopo de dissecação.
    1. Pegue o estágio OCT do gelo seco para o microscópio 2, transfira imediatamente as cabeças para o estágio DE OUTUBRO e organize-as rapidamente, o que leva ~30 s para evitar o derretimento do OCT. Deixe ~1 mm de espaço em branco em torno de cada cérebro de mosca para garantir suporte adequado a partir do OCT e 4-5 mm de espaço em branco a partir da borda do bloco para fornecer espaço adequado para lidar com a seção. Se o proboscis for muito longo, remova a ponta; se não for muito tempo, mantenha-o intacto. Coloque o palco OCT de volta no gelo seco e deixe-o ficar por ~3 minutos para garantir que o estágio OCT permaneça congelado e sólido.
    2. Quando o palco oct está de volta no gelo seco e esperando por solidificação, colete outra rodada de cabeças. Repita as etapas 1.2 e 1.3 para transferir amostras adicionais para o espaço restante do palco.
      NOTA: Oito cabeças geralmente são preparadas para cada genótipo, e quatro genótipos são usados em uma etapa de OCT neste laboratório.
    3. Use dois microscópios de dissecção, lado a lado, para evitar mudar o foco e aumentar o tempo de transferência e organizar as cabeças no palco de OUTUBRO e diminuir o risco de fusão do estágio OCT.
  4. Depois que todas as cabeças de mosca estiverem alinhadas, deixe o palco OCT sentar no gelo seco por mais 5-10 minutos.
  5. Retire o estágio oct do gelo seco, coloque-o em uma superfície plana (banco), e então, rapidamente, adicione uma grande quantidade de composto OCT para cobrir todas as amostras e encher todo o criomold, que leva ~3 s.
  6. Transfira imediatamente o criomold de volta para gelo seco e congele todo o bloco OCT contendo os tecidos incorporados. Deixe o palco oct sentar-se no gelo seco por mais 5-10 minutos. Rotule as amostras na margem do criomold.
  7. Armazene as amostras congeladas a −80 °C até ficar pronto para a secção.

2. Criosectioning o tecido

NOTA: Ao manusear os slides de óxido de lata de índio (ITO), use luvas o tempo todo para evitar a contaminação dos tecidos. O uso de uma máscara também é recomendado para evitar respirar diretamente na lâmina.

  1. Confirme o lado revestido de ITO testando a condutividade dos slides ITO usando um conjunto de voltímetros para resistência. Marque o lado com uma medida de resistência como o lado para aderir o tecido. Rotule-o e coloque sempre uma limpeza de laboratório na parte inferior do slide para evitar contaminação por lâminas.
  2. Deixe os tecidos se equilibrarem na câmara criostat por 30-45 min.
    1. Para evitar o derretimento do OCT, coloque todas as ferramentas necessárias, como fórceps e um pincel de artista de ponta fina na câmara criostat antes do tempo para pré-cobrá-los.
  3. Limpe o criostat, de preferência com 70% de etanol. Limpe a placa de rolo e o estágio e remova as lâminas usadas. Use lenços limpos adicionais para garantir que o etanol tenha evaporado e que todas as superfícies estejam secas antes do início da secção.
  4. Ajuste a temperatura da câmara criostat e da cabeça da amostra de acordo com o tipo do tecido (por exemplo, −14 °C para fígado, −20 °C para músculo e −25 °C para pele10; −18 °C para cabeças de mosca neste protocolo).
  5. Monte o tecido sobre o suporte da amostra usando OCT. Tenha cuidado para usar OCT suficiente para cobrir a base do bloco OCT e montar o bloco o mais plano possível.
  6. Coloque uma lâmina limpa no palco e bloqueie-a. Posicione a cabeça do espécime em direção ao estágio conforme necessário para alcançar o ângulo de corte desejado.
    1. Coloque o bloco da amostra em uma orientação onde todos os genótipos/grupos de tratamento estão posicionados verticalmente para a lâmina.
      NOTA: Isso garante um plano de corte consistente e evita a contaminação cruzada de diferentes grupos. Se cortar um bloco diferente de tecido, mude para uma nova lâmina entre as amostras para evitar a contaminação cruzada.
  7. Comece a cortar em seções grossas (50-100 μm) até que a região de interesse (por exemplo, a região desejada do cérebro) seja encontrada.
    1. Revise constantemente peças extras com um pincel de artista pré-cozido para manter o palco limpo.
  8. Altere a espessura das seções para 10-12 μm uma vez que a região desejada seja atingida.
    1. Ajuste ligeiramente a temperatura da câmara conforme necessário. Por exemplo, estabeleça uma temperatura mais alta se a seção tende a se desfazer ou desmoronar facilmente.
      NOTA: A temperatura recomendada para blocos OCT é de −18 °C.
  9. Colecione cuidadosamente a seção desejada e adere-a ao slide ITO. Faça esta operação na câmara criostat.
    1. Pegue um slide de ITO de temperatura ambiente e posicione-o sobre a seção, aproxime-se da seção suavemente e rapidamente para que a seção adere ao slide sem deixar rastros no estágio criostat.
      NOTA: O OCT derreterá e se apegará ao slide.
  10. Coloque o slide de lado em um rack ou limpeza de laboratório fora do criosta entre as coleções de várias seções.
  11. Se a comparação entre diferentes amostras da mesma coorte for desejada, coloque as seções de várias amostras em um único slide para análise simultânea e variação mínima. Se necessário, separe a dois slides, pois o suporte de destino MALDI pode acomodar dois slides em uma única corrida.
  12. Transporte os slides em uma caixa de vácuo para um dessecante com dessecante como a camada inferior. Seque as lâminas sob um vácuo por 30-60 min.
    NOTA: Alternativamente, se o laboratório não estiver equipado com um dessecador a vácuo, os slides devem ser mantidos a −20 °C durante todo o processo até o armazenamento a −80 °C dentro de 24 h ou envio em gelo seco para evitar a deterioração de lipídios ou metabólitos.
  13. Prossiga para o depoimento matricial. Use 2,5-dihydroxybenómico ácido (DHB) em metanol/água (70/30, v/v) como matriz.
  14. Se os slides não forem executados imediatamente, ou armazene os slides a −80 °C (até 1 mês para seções cerebrais de moscas e 6 meses para seções cerebrais de roedores), ou envie imediatamente a amostra para instalações centrais MALDI com gelo seco adequado. Para um armazenamento e envio ideais, coloque os slides em um transportador de slides e sele firmemente a abertura com filme de cera. Sele com um saco zip, coloque-o em outro saco zip contendo dessecante e rotule o lado de fora.
    NOTA: Consulte os trabalhos anteriores para as etapas seguidas de varredura de slides, deposição matricial e procedimentos de imagem MALDI11.
  15. Realize a deposição matricial utilizando o pulverizador automático de matriz HTX M5 e uma solução de 40 mg/mL de DHB em metanol/água (70/30, v/v). Pulverize a matriz a uma vazão personalizada de 0,12 mL/min e uma temperatura no bocal de 85 °C para 10 passes. Use uma pressão de gás N2 de 10 psi.
    NOTA: Se a pressão do gás N2 no pulverizador for reduzida abaixo de 5 psi, um mecanismo de segurança no pulverizador desligará o aquecedor imediatamente para evitar qualquer dano ao pulverizador com uma velocidade de pulverização de 1.300 mm/min, espaçamento de 2 mm de pista, taxa de fluxo de 3 L/min e altura do bocal de 40 mm.
  16. Use um instrumento MALDI time of flight (TOF) MS (ver a Tabela de Materiais) no modo íon positivo para adquirir um espectro de massa dentro da massa varia de m/z 50-1.000.
    1. Para calibrar o instrumento, local 0,5 μL de emulsão de fósforo vermelho em acetonitrilo nos slides do ITO e use seu espectro para calibrar o instrumento na faixa de massa de 50-1.000 m/z, aplicando uma curva de calibração quadrática2.
    2. Defina os diâmetros da mancha de laser para Médio, pois é o perfil de feixe modulado para largura de raster de 40 μm, e reúna dados de imagem somando 500 tiros em uma taxa de repetição de laser de 1.000 Hz por posição de matriz.
    3. Use software (veja a Tabela de Materiais) para registrar e processar os dados espectrais. Realize a análise de dados de imagem usando a normalização do quadrado da raiz (RMS) para gerar imagens de íons em uma largura de caixa de ±0.10 Da. Alinhe o espectro tanto do OCT quanto do tecido cerebral do mesmo experimento usando o software para avaliar os picos sobrepostos e a interferência de supressão de íons do OCT (Figura Suplementar S1). Após o experimento, processe as lâminas MALDI contendo as amostras de tecido por hematoxilina e eosina (H&E), como descrito anteriormente11.

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Resultados

A perda do receptor neuronal LpR1 da lipocalina glialina glialida do astrócito Glial Lazarillo (GLaz), um homólogo drosophila do Ípofilo humano, foi hipótese de ser capaz de causar uma diminuição no conteúdo lipídico global no cérebro de Drosophila. Para testar isso, o MALDI MSI foi usado para traçar o perfil dos lipídios em cérebros drosophila mutantes e selvagens, que é elaborado abaixo.

O experimento foi realizado de acordo com o fluxo de traba...

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Discussão

Como demonstrado no estudo sobre as variações na composição lipídica em cérebros drosophila mutantes e selvagens, o MALDI MSI pode ser uma valiosa técnica de imagem livre de rótulos para análise in situ de padrões de distribuição molecular dentro de órgãos de pequenos insetos. De fato, como os lipídios são distribuídos tanto no tecido cerebral quanto nos corpos de gordura das cabeças de Drosophila, abordagens lipidômicas convencionais baseadas na cromatografia líquida e espectrometria de massa ...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Agradecimentos

Yuki X. Chen, Kelly Veerasammy e Mayan Hein são apoiados pelo Programa de Pesquisa de Verão cuny da Sloan Foundation (CSURP). Jun Yin é apoiado pelo programa de pesquisa intramuros do Projeto Nacional de Saúde Número 1ZIANS003137. O apoio a este projeto foi fornecido por um Prêmio PSC-CUNY para Ye He e Rinat Abzalimov, financiado em conjunto pelo The Professional Staff Congress e the City University of New York.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ácido 2,5-Dihidroxibenzóico (DHB)Millipore Sigma Aldrich85707-1G-F
Andwin Scientific  CRYOMOLD 15X15X5Fisher ScientificNC9464347
Andwin Scientific  Composto CRYO-OCT Tissue-Tek FisherScientific14-373-65
Pincel de artista MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLEFisher Scientific50-111-2302
autoflex speed MALDI-TOF MS systemBruker Daltonics IncMALDI-TOF MS instrument
BD  Seringa com Pontas Luer-Lok FisherScientific14-823-16E
BD  Agulhas de Seringa de Uso Geral VacutainerFisher Scientific23-021-020
Bruker Daltonics  LÂMINAS DE VIDRO MALDI IMAGNGFisher ScientificNC0380464
Drierite, com indicador, 8 mesh, ACROS OrganicsAC219095000
Scanner de Fotos Epson Perfection V600AmazonPerfection V600
Fisherbrand  Envelope de Slide de 5 LugaresFisher ScientificHS15986
Fisherbrand  Multímetro Digital Auto-RangeFisher Scientific01-241-1
FlexImaging v3.0Bruker Daltonics IncBruker MS software de análise de imagem
HPLC Grau MetanolFisher ScientificMMX04751
Água de Grau HPLCFisher ScientificW5-1
HTX M5 PulverizadorHTX Technologies, LLCMatriz aquecida automática pulverizador
Kimberly-Clark Professional  Kimtech Science Kimwipes Limpadores de Tarefas DelicadasFisher Scientific06-666A
MSC  Saco de Freezer ZiplocFisher Scientific50-111-3769
SCiLS Lab (2015b)SCiLS LabAdvanced MALDI MSI data analysis software
Thermo Scientific  CryoStar NX50 CryostatFisher Thermo Scientific95-713-0
Thermo Scientific  Dessecador de Policarbonato Transparente Nalgene Design ClássicoFisher Scientific08-642-7

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Reimpressões e permissões

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