Artigo de método

Preparação amostral para análise rápida lipídica no cérebro de Drosophila usando desorção a laser assistida por matriz/imagem de espectrometria de massa

DOI:

10.3791/63930

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14 de julho de 2022

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1Advanced Science Research Center, Neuroscience Initiative, the City University of New York, Graduate Center New York, 2Advanced Science Research Center, Structural Biology Initiative, the City University of New York, Graduate Center, 3National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 4The City College of New York, CUNY, 5Macaulay Honors College, CUNY, 6Graduate School of Public Health and Health Policy, The City University of New York, 7Princeton University, 8Ardrey Kell High School, 9The Borough of Manhattan Community College, CUNY, 10Gallatin School of Individualized Study, New York University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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O objetivo deste protocolo é fornecer orientação detalhada sobre a preparação adequada da amostra para análise lipídica e metabólito em pequenos tecidos, como o cérebro de Drosophila , utilizando imagens de espectrometria de massa a laser assistida por matriz(MALDI).

Resumo

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O perfil lipídida, ou lipidomics, é uma técnica bem estabelecida usada para estudar todo o conteúdo lipídudo de uma célula ou tecido. As informações adquiridas a partir da lipidemia são valiosas no estudo das vias envolvidas no desenvolvimento, doença e metabolismo celular. Muitas ferramentas e instrumentações têm auxiliado projetos lipidômicos, mais notavelmente várias combinações de espectrometria de massa e técnicas de cromatografia líquida. A desorção/ionização de massa de desorção/ionização de massa assistida por matriz (MALDI MSI) emergiu recentemente como uma poderosa técnica de imagem que complementa abordagens convencionais. Esta nova técnica fornece informações únicas sobre a distribuição espacial de lipídios dentro de compartimentos teciduais, que antes eram inatingíveis sem o uso de modificações excessivas. A preparação amostral da abordagem MALDI MSI é crítica e, portanto, é o foco deste artigo. Este artigo apresenta uma rápida análise lipídica de um grande número de cérebros de Drosophila embutidos no composto de temperatura de corte ideal (OCT) para fornecer um protocolo detalhado para a preparação de pequenos tecidos para análise lipídica ou metabólito e análise de moléculas pequenas através do MALDI MSI.

Introdução

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Os lipídios estão envolvidos em uma ampla gama de processos biológicos e podem ser amplamente classificados em cinco categorias com base em sua diversidade estrutural: ácidos graxos, triaciglicerols (TAGs), fosfolipídios, lipídios de esterol e sphingolipids1. As funções fundamentais dos lipídios são fornecer fontes de energia para processos biológicos (ou seja, TAGs) e formar membranas celulares (ou seja, fosfolipídios e colesterol). No entanto, funções adicionais de lipídios têm sido observados no desenvolvimento e nas doenças, e têm sido extensivamente estudados no campo biomédico. Por exemplo, relatórios mostraram que ácidos graxos de difere....

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Protocolo

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1. Incorporação de cabeça de mosca

NOTA: Todo o procedimento leva ~45-60 min.

  1. Prepare o estágio ideal de composto de temperatura de corte (composto OCT) com uma superfície plana.
    1. Adicione OCT em uma criomolda plástica (15 mm x 15 mm x 5 mm) à metade da profundidade do criomold e evite a formação de bolhas. Deixe o molde em uma superfície plana por vários minutos e, em seguida, transfira-o para o gelo seco.
    2. Mantenha o criomold plano no gelo seco e permita que o OCT forme uma superfície plana e uniforme. Espere até que o OCT esteja totalmente solidificado no molde. Use imediatamente as etapas OCT c....

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Resultados

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A perda do receptor neuronal LpR1 da lipocalina glialina glialida do astrócito Glial Lazarillo (GLaz), um homólogo drosophila do Ípofilo humano, foi hipótese de ser capaz de causar uma diminuição no conteúdo lipídico global no cérebro de Drosophila. Para testar isso, o MALDI MSI foi usado para traçar o perfil dos lipídios em cérebros drosophila mutantes e selvagens, que é elaborado abaixo.

O experimento foi realizado de acordo com o fluxo de traba.......

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Discussão

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Como demonstrado no estudo sobre as variações na composição lipídica em cérebros drosophila mutantes e selvagens, o MALDI MSI pode ser uma valiosa técnica de imagem livre de rótulos para análise in situ de padrões de distribuição molecular dentro de órgãos de pequenos insetos. De fato, como os lipídios são distribuídos tanto no tecido cerebral quanto nos corpos de gordura das cabeças de Drosophila, abordagens lipidômicas convencionais baseadas na cromatografia líquida e espectrometria de massa .......

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Agradecimentos

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Yuki X. Chen, Kelly Veerasammy e Mayan Hein são apoiados pelo Programa de Pesquisa de Verão cuny da Sloan Foundation (CSURP). Jun Yin é apoiado pelo programa de pesquisa intramuros do Projeto Nacional de Saúde Número 1ZIANS003137. O apoio a este projeto foi fornecido por um Prêmio PSC-CUNY para Ye He e Rinat Abzalimov, financiado em conjunto pelo The Professional Staff Congress e the City University of New York.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ácido 2,5-Dihidroxibenzóico (DHB)Millipore Sigma Aldrich85707-1G-F
Andwin Scientific  CRYOMOLD 15X15X5Fisher ScientificNC9464347
Andwin Scientific  Composto CRYO-OCT Tissue-Tek FisherScientific14-373-65
Pincel de artista MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLEFisher Scientific50-111-2302
autoflex speed MALDI-TOF MS systemBruker Daltonics IncMALDI-TOF MS instrument
BD  Seringa com Pontas Luer-Lok FisherScientific14-823-16E
BD  Agulhas de Seringa de Uso Geral VacutainerFisher Scientific23-021-020
Bruker Daltonics  LÂMINAS DE VIDRO MALDI IMAGNGFisher ScientificNC0380464
Drierite, com indicador, 8 mesh, ACROS OrganicsAC219095000
Scanner de Fotos Epson Perfection V600AmazonPerfection V600
Fisherbrand  Envelope de Slide de 5 LugaresFisher ScientificHS15986
Fisherbrand  Multímetro Digital Auto-RangeFisher Scientific01-241-1
FlexImaging v3.0Bruker Daltonics IncBruker MS software de análise de imagem
HPLC Grau MetanolFisher ScientificMMX04751
Água de Grau HPLCFisher ScientificW5-1
HTX M5 PulverizadorHTX Technologies, LLCMatriz aquecida automática pulverizador
Kimberly-Clark Professional  Kimtech Science Kimwipes Limpadores de Tarefas DelicadasFisher Scientific06-666A
MSC  Saco de Freezer ZiplocFisher Scientific50-111-3769
SCiLS Lab (2015b)SCiLS LabAdvanced MALDI MSI data analysis software
Thermo Scientific  CryoStar NX50 CryostatFisher Thermo Scientific95-713-0
Thermo Scientific  Dessecador de Policarbonato Transparente Nalgene Design ClássicoFisher Scientific08-642-7

Referências

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  1. Park, J., et al. Bioactive lipids and their derivatives in biomedical applications. Biomolecules & Therapeutics. 29 (5), 465-482 (2021).
  2. Augustin, K., et al. Mechanisms of action for the medium-chain trig....

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An lise Lipid micaEspectrometria de Massa MALDIPerfil Lip dicoCrioseccionamentoDeposi o de MatrizInclus o em OCTHomeostase Lip dica Cerebral

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