Quantificando a Dinâmica do Citoesqueleto usando microscopia dinâmica diferencial

Summary

A microscopia dinâmica diferencial (DDM) combina características de dispersão dinâmica de luz e microscopia. Aqui, é apresentado o processo de utilização do DDM para caracterizar redes de citoesqueleto reconstituídas quantificando a dinâmica subdiffusiva e enjaulada de partículas em redes de vimentina e o movimento balístico de compostos ativos de actin-microtubulos movidos a miose.

Abstract

As células podem rastejar, auto-curar e sintonizar sua rigidez devido ao seu citoesqueleto notavelmente dinâmico. Como tal, a reconstituição de redes de biopolímeros citoesqueléticos pode levar a uma série de materiais ativos e adaptáveis. No entanto, a engenharia desses materiais com propriedades precisamente sintonizadas requer medir como a dinâmica depende da composição da rede e dos métodos de síntese. Quantificar tais dinâmicas é desafiado por variações ao longo do espaço de tempo, espaço e formulação de redes compostas. O protocolo aqui descreve como a técnica de análise Fourier, microscopia dinâmica diferencial (DDM), pode quantificar a dinâmica das redes de biopolímeros e é particularmente adequada para estudos de redes de citoesqueleto. O DDM trabalha em sequências temporais de imagens adquiridas usando uma série de modalidades de microscopia, incluindo confocal de varredura a laser, fluorescência de campo largo e imagens de campo brilhante. A partir dessas sequências de imagem, pode-se extrair tempos característicos de descorrelação de flutuações de densidade através de um período de vetores de onda. Um pacote Python de código aberto fácil de usar para realizar análises DDM também é desenvolvido. Com este pacote, pode-se medir a dinâmica dos componentes de citoesqueleto rotulados ou de partículas rastreadoras incorporadas, como demonstrado aqui com dados de redes de filamento intermediário (vimentin) e redes ativas de actin-microtúbulos. Usuários sem experiência prévia de programação ou processamento de imagens poderão executar DDM usando este pacote de software e documentação associada.

Introduction

O citoesqueleto é uma rede de filamentos proteicos que se estende pelo citoplasma das células eucarióticas, conectando a superfície celular ao núcleo. Possui propriedades materiais únicas, fornecendo proteção mecânica contra cargas mecânicas grandes e repetidas, mas também conduzindo mudanças dinâmicas de forma celular¹. Redes de citoesqueleto reconstituídas podem dar origem a uma série de comportamentos dinâmicos interessantes, desde o envelhecimento de partículas incorporadas até o movimento balístico impulsionado por motores moleculares 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Os métodos para analisar a dinâmica dessas redes incluem o rastreamento do movimento de microesferas rastreadoras incorporadas ^6,7,12,13,14, análise de imagem para rastrear o tamanho de aglomerados densos de proteínas ao longo do tempo⁸, dispersão de luz dinâmica¹⁵, velocimetria de imagem de partículas ^{4,16,17,18,19} , calculando a densidade espectral de energia das imagens ao longo do tempo¹⁹, e análise de kymógrafo²⁰. À medida que mais estudos sobre redes de citoesqueleto reconstituídas são realizados, seja para entender a mecânica celular ou a matéria ativa, métodos robustos, imparciales e reprodutíveis para caracterizar a dinâmica são cada vez mais necessários. A microscopia dinâmica diferencial (DDM)^21,22, uma técnica relativamente nova que tem sido usada para estudar a dinâmica do citoesqueleto, é uma dessas técnicas que quantifica eficientemente a dinâmica com poucos parâmetros definidos pelo usuário. Com o pacote de software descrito aqui, pesquisadores com pouca experiência em programação ou análise de imagens poderão aproveitar o DDM para seu próprio trabalho.

DDM é uma técnica de análise de imagem para extrair a dinâmica de uma amostra. Como o rastreamento de partículas ou a velocimetria de imagem de partículas, o DDM requer uma série de imagens temporizais (muitas vezes milhares de imagens), tipicamente gravadas com um microscópio. Ao contrário do rastreamento de partículas, características individuais ou contas rastreadoras não precisam ser localizadas (ou mesmo localizáveis) na imagem. Ao contrário do rastreamento de partículas e da velocimetria de imagem de partículas, recupera-se a dinâmica do conjunto com DDM com relativamente poucos parâmetros especificados pelo usuário. Com o DDM, as imagens são analisadas no espaço Fourier para determinar o tempo de decomposição das flutuações de densidade sobre uma faixa de números de ondas, q, onde q = 2πu, e u é a magnitude das frequências espaciais, . Um deles obtém informações semelhantes à dispersão, mas com imagens de espaço real adquiridas em um microscópio 21,22,23. Portanto, pode-se aproveitar os vários métodos geradores de contraste da microscopia, como fluorescência de campo largo^22,24, fluorescência confocal²⁵,^{polarizado 26}, campo escuro²⁷ ou fluorescência de folhas claras²⁸ microscopias. Além disso, imagens usadas para análise de DDM podem ser usadas para rastreamento de partículas ou velocimetria de imagem de partículas para fornecer informações complementares.

Essa combinação de características de dispersão dinâmica de luz e microscopia óptica faz do DDM uma técnica poderosa e versátil. Desde sua primeira descrição por Cerbino e Trappe em 2008²¹, onde o DDM foi demonstrado para medir a difusão de partículas coloidais de 73 nm, O DDM tem sido usado para medir coloides^{fluindo 29}, agregação coloidal ^30,31, a viscoelasticidade dos cristais líquidos nemáticos²⁶, a dinâmica dos géis coloidais³², espumas grosseiras³³, nanopartículas em ambientes confinados^34, 35,36,37, motilidade bacteriana 38,39,40,41, a difusão de aglomerados proteicos fracamente dispersantes⁴², ondas capilares nas interfaces fluidas⁴³, e outros sistemas. Aqueles que buscam uma listagem mais completa das publicações que empregam DDM podem consultar artigos de revisão minuciosas sobre o assunto 22,23,44,45.

A DDM também tem sido usada para investigar a dinâmica das redes biológicas. Drechsler et al. usaram DDM para medir a dinâmica da actina em oócitos de Drosophila ^{vivos 46}. Burla et al. quantificaram a dinâmica das partículas rastreadoras em redes de compostos hialuronan e hialuronan-colágeno⁴⁷. Vários usos do DDM para estudar a dinâmica das partículas rastreadoras em redes de citoesqueleto reconstituídas ^9,10, o transporte de moléculas de DNA nessas redes^48,49, e a dinâmica das redes ativas reconstituídas também foram documentados 11,50,51. Uma vantagem do DDM na medição da dinâmica em tais sistemas é que partículas individuais ou moléculas não precisam ser localizadas e rastreadas. Assim, por exemplo, a dinâmica das moléculas de DNA em ambientes lotados pode ser medida com DDM, apesar da dificuldade em rastrear moléculas tão pequenas e não esféricas. Além disso, com a microscopia de fluorescência, pode-se usar rotulagem multicolorida para medir seletivamente a dinâmica dos constituintes individuais em um composto complexo.

Para executar o DDM, uma sequência de imagens é tirada ao longo do tempo, eu (x,y,t). Para um determinado tempo de atraso, Δt, todos (ou um subconjunto de) pares de imagens separados por esse tempo de atraso são encontrados. A transformação de Fourier ao quadrado da diferença de cada par,

é computado e mediado juntos. Essa quantidade, é radialmente mediada, desde que a dinâmica seja isotrópica. Isso rende a matriz DDM (também referida como função da estrutura de imagem), . Este processo é mostrado graficamente na Figura 1. Para determinar a dinâmica da amostra a partir desta matriz DDM, a matriz DDM é assumida para tomar a forma

onde A é a amplitude, que depende dos detalhes do microscópio e da estrutura da amostra, B é o fundo, que depende do ruído nas imagens, e f (q, Δt) é a função de dispersão intermediária (ISF), que contém informações sobre a dinâmica^21,22. Em casos simples,

onde τ é um tempo característico de decadência ou descomprência. Tal ISF tem sido utilizado em diversos estudos que empregam DDM em sistemas ergodódicos como suspensões coloidais diluídas 21,24,27,37,40,52. No entanto, outras formas do ISF podem ser usadas para modelar vários tipos de dinâmica. Por exemplo, pode-se usar uma expansão cumulante para modelar o ISF para amostras de polidisperse como

onde μ é uma medida da polidispersidade^42,53; se as flutuações de densidade decairem por dois modos separados, pode-se usar um ISF como

^{26, 54, 55, 56, 57};

outros ISFs podem ser usados para microrganismos na natação ou outras partículas ativas 38,39,40,41,58,59.

Figura 1: Visão geral da análise do DDM. A partir da série temporal de imagens, a transformação fourier das diferenças de imagem é calculada para calcular a matriz DDM. A matriz DDM pode ser adequada a um modelo para determinar a escala de tempo das flutuações de densidade em uma faixa de valores q . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Aqui, o uso de um pacote de software de análise DDM desenvolvido em Python, PyDDM, é descrito. Este pacote de software baseia-se no trabalho feito por nossos laboratórios de pesquisa e outros estudos publicados ao longo dos últimos anos. Os principais motivadores para a criação deste pacote de software incluem a necessidade de (1) acompanhar e armazenar metadados e parâmetros utilizados na análise; (2) documentação completa com exemplos detalhados de análise do início ao fim; e (3) uma maneira fácil de empregar diferentes (ou criar novos) modelos matemáticos para a montagem dos dados (por exemplo, adicionar modelos ISF, como os recentemente desenvolvidos para filamentos ativos⁶⁰, seria simples). Outros pacotes de software para análise de DDM também existem, embora nem todos estejam bem documentados e escritos em uma linguagem de programação de código aberto. Por exemplo, há código C++ com computação em GPUs (https://github.com/peterlu/ConDDM)²⁵, código C++ que usa transformações fourier no tempo para acelerar cálculos (https://github.com/giovanni-cerchiari/diffmicro)⁶¹, versões MATLAB e Python (https://github.com/MathieuLeocmach/DDM)⁴⁰, código MATLAB (https://sites.engineering.ucsb.edu/~helgeson/ddm.html)²⁷ e código MATLAB com quantificação de incerteza ( quantificação de incerteza ( https://github.com/UncertaintyQuantification/DDM-UQ)⁶². Como este pacote PyDDM é bem documentado e fornece muita flexibilidade na forma como a matriz DDM é calculada e analisada, ela pode ser útil para pesquisadores que procuram implementar DDM, independentemente de seu histórico em programação ou análise de imagem.

O protocolo mostra como este pacote de software pode ser usado para quantificar a dinâmica de redes de citoesqueleto in vitro reconstituídas. Isso é feito usando dois conjuntos distintos de dados de imagem: (1) imagens de partículas rastreadoras de submicron incorporadas em uma rede de vimentina tomada com microscopia de campo brilhante e (2) imagens de filamentos de actina fluorescente e filamentos de microtúbulos em uma rede composta emaranhada com atividade movida a miosina tomada com microscopia confocal de varredura a laser. As análises desses dois conjuntos de dados destacam pontos fortes notáveis do DDM, incluindo sua capacidade de analisar imagens tiradas com uma variedade de modalidades de imagem (por exemplo, fluorescência de campo brilhante ou constrangida), extrair dinâmicas de rastreadores incorporados ou de filamentos rotulados, e quantificar uma variedade de dinâmicas (por exemplo, subdiffusivas e restritas ou balísticas).

Protocol

NOTA: Um arquivo Jupyter Notebook contendo o código para acompanhar cada passo no protocolo a seguir pode ser encontrado no seguinte repositório do GitHub, https://github.com/rmcgorty/PyDDM/tree/main/Examples. Um PDF desse arquivo está incluído no Arquivo Suplementar 1. Além disso, um passo a passo do código e documentação de cada função e classe pode ser encontrado no site, https://rmcgorty.github.io/PyDDM/.

1. Instalação de software

1. Para acompanhar os arquivos de análise de DDM de exemplo, instale o Jupyter Notebook para executar o código. Instale outros pacotes Python comuns necessários, incluindo NumPy e Matplotlib também. Todos esses pacotes vêm empacotados com a distribuição Anaconda (ver https://www.anaconda.com/products/individual).
2. Instale o pacote Python xarray⁶³. Este pacote é necessário para organizar e armazenar metadados e parâmetros de análise. Se estiver usando a distribuição Anaconda, instale xarray (juntamente com suas dependências recomendadas) usando o comando:
   conda instalar -c conda-forge xarray dask netCDF4 gargalo
3. Instale o pacote PyYAML usando o comando:
   conda instalar -c anaconda yaml
   Este pacote é necessário para ler metadados sobre as imagens para analisar e os parâmetros definidos pelo usuário para análise e montagem.
4. Instale o pacote PyDDM, baixando do repositório do GitHub ou usando o comando git:
   https://github.com/rmcgorty/PyDDM.git do clone git

2. Planejamento das sessões de imagem

1. Escolha a modalidade de imagem e as configurações ópticas disponíveis. Como mencionado, o DDM pode ser usado com uma série de métodos de microscopia.
2. Para auxiliar no planejamento da lente objetiva apropriada e tamanho da imagem a ser usada, determine a faixa de números de ondas, q, que serão sondadas com base no tamanho do pixel e tamanho total da imagem. Confirme que a escolha da ampliação e do campo de visão são ideais para o experimento, com base nesses cálculos. Para as imagens aqui analisadas, foram utilizados um objetivo 60x 1.4 NA e um tamanho de imagem de 256 x 256 pixels com um tamanho de pixel de 0,83 μm para a rede composta ativa actin-microtúbula. Para as imagens de contas embutidas em uma rede de vimentina, foram utilizados um objetivo 100x 1.4 NA e um tamanho de imagem de 512 x 512 pixels com um tamanho de pixel de 0,13 μm.
   NOTA: O q mínimo é definido por 2π/NΔx, onde o tamanho da imagem (supostamente quadrado) é N × N pixels com um tamanho de pixel de Δx. O q máximo é o mínimo de π/Δx e 2π NA/λ, onde NA é a abertura numérica do objetivo de imagem, e λ é o comprimento de onda da luz (para imagens de campo brilhante, pode-se substituir NA por (_{na objective} + na_condensador)/2).
3. Em seguida, considere a gama de escalas de tempo para investigar. Normalmente, a análise DDM é feita em sequências de pelo menos 1000 quadros.
   1. Para determinar a taxa de quadros adequada, considere o tempo esperado para que os recursos da amostra movam uma distância na ordem da escala de comprimento solucionável mínima (correspondente ao q máximo).
   2. Ao considerar o limite superior da faixa de escalas de tempo sondadas, reconheça que, tipicamente, o espectro de energia de centenas de diferenças de imagem de um determinado tempo de lag Δt são mediados em conjunto para fornecer estatísticas suficientes para reduzir o ruído. Assim, adquira sequências de imagem mais longas do que a escala de tempo máxima sondada.
      NOTA: Se um coeficiente de difusão esperado, D ou velocidade, v, é conhecido, então pode-se estimar tempos de decadência característico esperados usando τ = 1/Dq² ou τ = 1/vq juntamente com a faixa de q, que foi determinada com base no campo de visão e tamanho do pixel. A faixa de valores esperados sobre a faixa q acessível pode ajudar a orientar a escolha da taxa de quadros e o número de quadros a serem adquiridos.

3. Preparação de amostras e aquisição de imagens

NOTA: Para obter detalhes sobre a preparação da amostra e as configurações de imagem utilizadas para os dados apresentados na seção de resultados representativos, consulte publicações anteriores dos autores 11,51,64 e Arquivo Suplementar 2.

1. Com base na consideração das escalas de tempo e comprimento para sondar, adquira sequências de imagem de, idealmente, mais de 1000 quadros.
   NOTA: O código analisará imagens quadradas ou regiões quadradas de interesse dentro da imagem, então ajuste o tamanho do quadro de acordo.
2. Salve sequências de imagem como uma pilha TIFF tridimensional em escala de cinza. Alternativamente, o formato utilizado pelos sistemas Nikon Instruments, formato ND2, pode ser lido pelo pacote instalado. Se as imagens forem salvas em algum formato diferente, use ImageJ ou outro programa de processamento de imagens para converter as imagens em uma pilha TIFF.
   NOTA: Se usar arquivos ND2, o leitor do pacote nd2 de https://github.com/Open-Science-Tools/nd2reader deve ser instalado.

4. Configuração do parâmetro

1. Faça uma cópia do arquivo do parâmetro example_parameter_file.yml fornecido no repositório de código PyDDM sob a pasta exemplos. Abra este arquivo YAML com um editor de texto como NotePad++ ou o editor de texto no JupyterLab. Consulte o Arquivo Suplementar 2 para um arquivo de parâmetros YAML de exemplo utilizado na análise dos dados apresentados na seção de resultados representativos.
2. No arquivo YAML copiado, forneça o diretório de dados e o nome do arquivo correspondentes à sequência de imagem a ser analisada. Sob a seção metadados, forneça o tamanho do pixel e a taxa de quadros.
3. Na seção Analysis_parameters, forneça detalhes de como a matriz DDM deve ser calculada. Alguns parâmetros aqui são opcionais.
   1. No mínimo, forneça valores para os parâmetros number_lag_times e last_lag_time. Estes correspondem ao número de diferentes tempos de defasagem para que calcular a matriz DDM e o maior tempo de defasagem (em quadros) para uso, respectivamente. Para os dados de contas rastreadoras em redes vimentinas utilizadas aqui, os parâmetros number_lag_times e last_lag_time foram 60 e 1000, respectivamente. O código calculará a matriz DDM para tempos de atraso a partir de 1 quadro (ou algum outro tempo mínimo de atraso se o parâmetro opcional first_lag_time for especificado) para o last_lag_time com espaçamento logartímico.
      NOTA: Se os quadros M foram adquiridos, pode-se calcular a matriz DDM por um tempo de atraso tão grande quanto M-1. No entanto, com estatísticas ruins em um momento de atraso tão grande, é provável que os dados sejam barulhentos. O tempo de defasagem mais longo para calcular a matriz DDM dependerá dos detalhes dos dados, mas sugerimos tentar cerca de um terço da duração total da série de imagens.
4. Forneça detalhes de como a matriz DDM ou a função de dispersão intermediária (ISF) devem estar encaixadas na seção Fitting_parameters. Dê o nome do modelo sob o parâmetro modelo. Forneça o palpite inicial, o limite inferior e o limite superior para cada um dos parâmetros de montagem no modelo escolhido.
   NOTA: Para exibir uma lista dos possíveis modelos de encaixe, execute a função print_fitting_models. Os modelos também podem ser encontrados na documentação online no site da PyDDM.

5. Cálculo da matriz DDM

1. Inicialize uma instância da classe DDM_Analysis. Para isso, forneça os metadados e parâmetros de análise discutidos acima, passando o nome do arquivo, com o caminho completo do arquivo incluído, do arquivo YAML para DDM_Analysis. Alternativamente, passe os metadados e parâmetros como uma estrutura de dados do dicionário Python.
2. Execute a função calculate_DDM_matrix para calcular a matriz DDM. Este cálculo pode levar vários minutos ou mais, dependendo do tamanho do quadro e do número de tempos de atraso. Consulte a Figura 2 para obter horários típicos de execução.
3. Inspecione os dados retornados, que estarão em uma estrutura de dados do pacote xarray conhecido como Dataset. Essa estrutura de dados é armazenada sob o atributo ddm_dataset.
   NOTA: Não apenas a matriz DDM, mas também variáveis e metadados associados serão armazenados nesta estrutura de dados. Ele também será salvo em disco em um formato de Formulário de Dados Comuns de Rede (netCDF).
4. Inspecione os lotes e figuras, que serão gerados e exibidos. Esses números também são salvos como um arquivo PDF no diretório de dados.
   1. Veja que uma das parcelas geradas mostra o módulo quadrado médio das imagens transformadas em Fourier, em função de q. Por padrão, o código usa isso para estimar o parâmetro de fundo B. Estime o fundo assumindo que, no limite de q grande, ele se aproximará de B/2, onde B é o pano de fundo.
   2. Se não estiver atingindo um platô em geral q, então use outro método para estimar B. Para isso, defina o parâmetro background_method no arquivo YAML ou como um argumento de palavra-chave opcional para a função calculate_DDM_matrix. Mais detalhes sobre os métodos de estimativa B são apresentados na seção de resultados representativos.

Figura 2: Tempo de computação para cálculo da matriz DDM. Em (A) e (B) o tempo para calcular a matriz DDM, é mostrado. Os dados usados em todos os casos são um filme de 5000 quadros com um tamanho de imagem de 512 x 512 pixels. A matriz DDM foi calculada para 30 tempos de atraso, logaritmicamente espaçada entre 1 quadro (0,01 s) e 1000 quadros (10 s). O código foi executado em um computador desktop Intel i7-10700 de 2,90 GHz com 32 GB de RAM. Em (A), o efeito de variar quantas diferenças de imagem são usadas na computação da matriz DDM para cada tempo de atraso é mostrado. Para isso, as imagens são binadas para resultar em um tamanho de imagem de 256 x 256. Para cada tempo de lag Δt, imagens separadas por esse Δt são subtraídas e a matriz resultante é fourier transformada. Para um determinado Δt, todos os pares de imagens separados por esse Δt podem ser usados (mostrados em azul), apenas pares de imagens não sobrepostas podem ser usados (por exemplo, quadros 1 e 10, 10 e 19, etc.; mostrados em marrom), ou 300 pares de imagens ou menos podem ser usados para cada Δt. Em (B), mostra-se o efeito de alterar o tamanho da imagem no tempo de computação. As imagens foram binadas pelo agrupamento de 2 x 2, 4 x 4 ou 8 x 8 pixels, resultando em tamanhos de imagem de 256 x 256, 128 x 128, ou 64 x 64, respectivamente. Para cada um, cerca de 300 pares de imagens são usados na computação da matriz DDM para cada Δt. (C) A partir da matriz DDM, a função de dispersão intermediária (ISF) pode ser extraída. Isso é mostrado para os três casos em (A). Os pontos de dados azuis (sem compensação) correspondem ao ISF quando o número máximo de pares de imagens é usado para cada Δt; os pontos de dados marrons (com um deslocamento de 0,1) correspondem ao ISF quando pares de imagens não sobrepostos são usados para cada Δt; e os pontos de dados rosa (com um deslocamento de 0,2) correspondem ao ISF quando no máximo 300 pares de imagens são usados para cada Δt. O ISF encontrado usando pares de imagens não sobrepostos mostra barulhento em longos Δt. Para esse caso, poucos pares de imagens são usados em longos Δt (por exemplo, para Δt de 1000 quadros, apenas 4 pares de imagens são usados). (D) Ao encaixar o ISF em uma função exponencial, determina-se o tempo característico de decomposição, τ, para cada número de ondas, q. Em rosa, os resultados são mostrados após binning as imagens originais por 2 x 2, resultando em um tamanho de imagem de 256 x 256. Em cinza, os resultados são mostrados após binning por 8 x 8, resultando em um tamanho de imagem de 64 x 64. Ao binning os dados, as informações sobre a dinâmica em números de ondas mais altas são perdidas, mas calcular a matriz DDM para as imagens 64 x 64 é cerca de 16x mais rápido do que para as imagens 256 x 256. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Encaixar a matriz DDM ou o ISF

1. Inicialize uma instância da classe DDM_Fit. Para isso, passe para DDM_Fit o nome do arquivo do arquivo YAML contendo os metadados de imagem e parâmetros para a montagem.
2. Decida qual modelo para a matriz DDM ou o ISF usar para a montagem dos dados. Liste os modelos disponíveis executando a função print_fitting_models. Especifique o modelo a ser usado no arquivo do parâmetro YAML ou usando a função reload_fit_model_by_name.
3. Defina os palpites e limites iniciais para cada parâmetro no modelo escolhido no arquivo de parâmetro YAML fornecido. Para alterar o palpite inicial para qualquer parâmetro, use a função set_parameter_initial_guess. Defina limites para os parâmetros com a função set_parameter_bounds. Por exemplo, como visto no Arquivo Suplementar 2, para os dados de contas rastreadoras na rede vimentina, o palpite inicial para o tempo de decomposição foi de 1 s e os limites naquele parâmetro foram 0,01 s e 2000 s.
4. Execute o ajuste com o ajuste de função. Atribua uma variável à saída desta função para acessar facilmente os resultados.
   NOTA: Esta função pode ter muitos argumentos opcionais. Consulte a documentação do código e forneça exemplos para uma lista de tais argumentos e quando considerar defini-los para valores não padrão.

7. Interpretar os resultados de ajuste

1. Gerar parcelas para inspecionar os ajustes e a q-dependência dos parâmetros de ajuste com a função fit_report.
   NOTA: Esta função irá gerar uma série de parcelas, que também serão salvas como um PDF. Argumentos opcionais para esta função podem ser usados para modificar as parcelas produzidas.
2. Entre as parcelas geradas estará uma figura com subtramas de 2 x 2 mostrando a matriz DDM ou ISF (dependendo do modelo de ajuste escolhido) em quatro valores q (especificados como argumento opcional para fit_report), juntamente com a matriz DDM calculada ou ISF usando o modelo e os parâmetros de melhor ajuste. Para traçar a matriz DDM ou ISF juntamente com o melhor ajuste de forma interativa, use a classe Browse_DDM_Fits como mostrado nos exemplos fornecidos quando o ambiente Jupyter Notebook é usado.
3. A partir do enredo do tempo característico de decomposição τ vs. o número de ondas q, determinar se a dinâmica segue difusivo, subdiffusivo, balístico ou algum outro tipo de movimento. Isso pode ser feito procurando a relação de direito de poder entre τ e q.
   NOTA: No gráfico log-log de τ vs. q gerado pela função fit_report, três linhas serão mostradas, correspondendo à lei de energia que se encaixa sobre uma faixa especificada de valores q . A linha preta sólida corresponde ao encaixe τ vs. q a uma lei de potência, τ = 1 / Kq^β, onde K e β são parâmetros livres. A linha tracejada em laranja corresponde ao encaixe à difusão simples, τ = 1 / Dq², onde D é um coeficiente de difusão. A linha de ponto em azul corresponde ao encaixe para τ = 1 / vq, onde v é uma velocidade.

8. Salvando os resultados

1. Os resultados do ajuste serão salvos em um conjunto de dados xarray. Use a função xarray to_netcdf ou o módulo de picles embutido do Python para salvar essa estrutura de dados em disco. Use a função xarray open_dataset para carregar esses arquivos netCDF.
2. Use a função save_fit_results_to_excel para salvar os resultados de ajuste, juntamente com os dados, em um arquivo de planilha.

Results

Aqui, mostramos exemplos da análise feita com pyddm de dois conjuntos diferentes de experimentos. Em um conjunto de experimentos, as contas de rastreador submicrícle foram incorporadas em redes que consistem na vimentina de proteína de filamento intermediário e imagens usando uma lente objetiva de 100x no modo brightfield a 100 quadros/s (Figura 3A). A vimentina é expressa em células mesenquimais e é um determinante chave das propriedades mecânicas do citoplasma⁶⁵ e da estabilidade mecânica do núcleo em células que realizam migração confinada^66,67. Até agora, as redes de vimentina reconstituídas têm sido estudadas principalmente pela reologia macroscópica 64,68,69, enquanto a dinâmica recebeu relativamente pouca atenção 13,70,71. Detalhes adicionais desses experimentos podem ser encontrados no Arquivo Suplementar 2. No outro conjunto de experimentos, redes ativas de citoesqueleto foram preparadas com actina, microtúbulos e miosina. Rótulos fluorescentes espectralmente distintos permitiram que os filamentos de actina e microtúbulo fossem imagens com um microscópio confocal de varredura a laser de duas cores usando uma lente objetiva de 60x a 2,78 quadros/s (Figura 3B,C). Filamentos de actina e microtúbulos são ambos importantes condutores de mudanças dinâmicas de forma celular, com suas ações coordenadas por interações mecânicas e bioquímicas⁷². Detalhes adicionais desses experimentos podem ser encontrados em¹¹. Quadros individuais de sequências de imagem tiradas nesses experimentos são mostrados na Figura 3.

Figura 3: Imagens da série temporal analisadas. (A) Imagem brightfield de 0,6 μm contas em uma rede de vimentina. (B,C) Imagem dos microtúbulos (B) e (C) actin em um composto ativo actin-microtúbulo tomado com um objetivo de 60x em um microscópio confocal de varredura a laser, usando luz de excitação de 561 nm para a imagem microtúbula e luz de excitação de 488 nm para a imagem de actin. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para imagens de contas rastreadoras em redes de vimentina, foram gravados filmes de 5000 quadros com tamanho de 512 x 512 pixels a 100 quadros/s. A partir disso, a matriz DDM foi calculada em 60 tempos de lag logaritmicamente espaçados entre 1 e 1000 quadros, ou 0,01 s e 10 s. Para estimar o fundo, B, a média das imagens endiquadas transformadas por Fourier, foi calculada e fixada em ^55,73. Foi pressuposto de que, acima dos maiores 10% dos valores q, essa quantidade é igual a B/2 e que b é independente de q. Este é o método padrão do pacote para estimar B, mas outros métodos são possíveis definindo o parâmetro background_method para um valor diferente.

Com os parâmetros A(q) e B determinados a partir de , pode-se extrair a função de dispersão intermediária (ISF) da matriz DDM. Exemplos DE ISFs são mostrados na Figura 4. Na Figura 4A, mostra-se o ISF a partir de imagens de contas de 0,6 μm de diâmetro embutidas em uma rede com concentração de vimentina de 19 μM. Na Figura 4B, mostra-se o ISF para o mesmo tipo de contas em uma rede com concentração de vimentina de 34 μM. Curiosamente, em nenhum dos casos o ISF decaiu para zero. Em grandes momentos de atraso, o ISF deve se aproximar de zero para sistemas ergodicos. Ou seja, nesses sistemas, as flutuações de densidade devem descorretar completamente sobre grandes tempos de defasagem. O fato de que o ISF aqui não decaiu a zero poderia ter resultado de estimativas imprecisas de A(q) e B, que foram usadas para encontrar o ISF a partir da matriz de DDM computada. Notavelmente, o método aqui empregado pode superestimar B em certos cenários⁶². No entanto, é mais provável que a dinâmica das contas rastreadoras seja verdadeiramente nonergodica, pois as contas têm um tamanho comparável ao tamanho da malha de rede e podem, portanto, ficar enjauladas. Outros dados corroboraram a constatação da nonergodicidade. Ou seja, o tamanho da conta, 0,6 μm, foi maior do que o valor médio calculado para os tamanhos de malha de 0,4 μm para a concentração de 19 μM e 0,3 μm para a concentração de 34 μM. Além disso, os resultados do rastreamento de partículas únicas dessas contas rastreadoras, que são mostradas posteriormente, também mostraram movimento confinado.

Figura 4: Funções de dispersão intermediárias em vários números de ondas para redes vimentinas. O ISF é plotado em função do tempo de atraso para valores q de cerca de 1 a 9 ^μm-1. (A) O ISF a partir de imagens de contas de 0,6 μm em uma rede de vimentina com concentração de vimentina de 19 μM. (B) O ISF a partir de imagens de 0,6 μm contas em uma rede de vimentina com concentração de vimentin de 34 μM. O longo planto de tempo de atraso do ISF em um valor bem acima de zero indica nonergodicidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Dado que a dinâmica é provavelmente nonergodica, os ISFs são adequados à forma , onde C é o fator de nonergodicidade ³². Esta forma do ISF tem sido usada em estudos anteriores de dinâmica não eródica, como a dos géis coloidais^32,74 ou partículas rastreadoras nas redes actin-microtúbulas ¹⁰. As linhas pretas pontilhadas na Figura 4 mostram os ajustes junto com os dados. A partir desses ajustes, pode-se agora olhar para a q-dependência do tempo de decomposição, τ, e do parâmetro de nonergodicidade, C.

Figura 5: Tempo de decadência vs. número de ondas para vimentina redes. De ajustes ao ISF, o tempo de decomposição é determinado para uma faixa de valores q . Para clareza, não estamos mostrando o valor de τ para cada q, mas apenas um conjunto logaritmicamente espaçado. Em azul (tan) estão os dados de imagens de contas de 0,6 μm dentro de redes de vimentina com uma concentração de vimentina de 19 μM (34 μM). As barras de erro representam os desvios padrão em vários filmes (quatro filmes para os dados com a rede de 19 μM [azul] e cinco filmes para os dados com a rede de 34 μM [tan]). Linhas pontilhadas vermelhas marcam limites estimados para nossa resolução temporal e espacial, conforme descrito nos resultados. A linha preta sólida mostra escala, o que indicaria movimento difuso. Nenhum conjunto de dados segue esse dimensionamento. Em vez disso, contas na rede 19 μM mostram movimento subdiffusivo (com β > 2), e contas na rede de 34 μM mostram movimento confinado ou enjaulado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os tempos de decomposição mostraram grande quantidade de incerteza, tanto nos extremos q baixos e altos, como visto na Figura 5. As barras de erro nesta trama mostram o desvio padrão entre quatro vídeos analisados para o caso de concentração de vimentina inferior ou cinco vídeos analisados para maior concentração. Para entender a fonte da grande incerteza nesses extremos, considere tanto a resolução temporal quanto a espacial. Os limites aproximados da resolução são mostrados com três linhas pontilhadas de traço vermelho. As duas linhas horizontais correspondem aos tempos mínimos e máximos de defasagem sondados. Dada a taxa de quadros de 100 quadros/s e o tempo máximo de lag correspondente a 1000 quadros (20% da duração total do vídeo), a precisão foi perdida ao medir a dinâmica que ocorre mais rápido que 0,01 s ou mais lento que 10 s. Nos valores q mais baixos, os valores ajustados para τ foram maiores que 10 s. Portanto, grandes incertezas devem ser esperadas em tempos de decadência maiores do que o tempo máximo de defasagem. Na extremidade superior da faixa q, o tempo de decomposição se aproximou do tempo mínimo de defasagem de 0,01 s, mas permaneceu acima dele. Em vez de ser limitada pela resolução temporal, nesses valores q mais elevados, a resolução espacial pode ser o fator limitante. Dado o tamanho do pixel de 0,13 μm, o maior valor para q foi de cerca de 24 ^μm-1. No entanto, a resolução limitada à difração não permite necessariamente medições precisas da dinâmica nessas altas frequências espaciais. Aproximar-se da resolução óptica como leva a um limite de número de onda superior de cerca de 16 ^μm-1, dada a abertura numérica da lente objetiva, NA, de 1,4 e comprimento de onda de luz, . Isto é marcado pela linha vertical vermelha pontilhada na Figura 5. De fato, os dados eram barulhentos em grandes valores de q. Mesmo antes desse limite superior aproximado de q, o aumento da incerteza no τ foi visto, e isso poderia ser de superestimação q_max. Uma resolução óptica mais fraca do que o previsto pode ser porque uma lente de imersão de óleo foi usada para imagem além do deslizamento de tampa em uma amostra aquosa ou porque a lente do condensador estava imperfeitamente alinhada.

Para as contas de 0,6 μm incorporadas na rede menos concentrada (19 μM vimentin), pode ser observado a partir do gráfico log-log do tempo de decadência versus número de ondas que o tempo de decadência diminuiu com o número de ondas de uma forma consistente com uma lei de poder (Figura 5). No entanto, não parece seguir o que seria esperado para um movimento difusivo normal, onde . Em vez disso, τ diminuiu mais acentuadamente com o aumento q. Isso é um indicativo de movimento subdiffusivo, que muitas vezes ocorre para contas em ambientes lotados como estes. Montagem τ(q) sobre a faixa de 1,4 ^μm-1 a 12,3 ^μm-1 a uma lei de potência do formulário τ = 1/Kq^β rende os parâmetros de transporte K = 0,0953 μm^β / s e β = 2,2. Para aqueles mais acostumados a pensar em difusão normal vs. subdiffusão em termos do deslocamento quadrado médio (MSD) de partículas rastreadoras em função do tempo de lag (ou seja, MSD = K' Δt^α), é útil reconhecer que o expoente de escala subdiffusivo na equação de MSD, α, é equivalente a α = 2 / β. Em outras palavras, o valor de β = 2,2 é consistente com um expoente de escala subdiffusiva na equação msd de α = 0,9. Um deles definiria o PyDDM para caber τ(q) sobre esta faixa de valores q especificando os índices do array de q com o parâmetro Good_q_range no arquivo YAML ou passando o argumento opcional forced_qs para a função generate_fit_report. A faixa de q de 1,4 ^μm-1 a 12,3 ^μm-1 corresponderia, para os dados aqui, correspondentes aos índices do conjunto de q de 15 a 130.

Para as contas de 0,6 μm na rede mais concentrada (34 μM), o tempo de decomposição mostrou pouca dependência de q. Isso é provavelmente devido à nonergodicidade das contas em uma rede com um tamanho de malha menor. Para sondar a nonergodicidade neste sistema, o parâmetro de nonergodicidade, C, deve ser plotado em função de q, como na Figura 6. Para as contas de 0,6 μm na rede de vimentina de 19 μM, C ≈ 0,2 com pouca dependência de q (não mostrado). No entanto, para a rede com vimentina de 34 μM e para uma rede com concentração ainda maior de 49 μM vimentina, o registro de C foi proporcional ao q², conforme mostrado na Figura 6. Esta relação entre C e q é esperada para movimento confinado. Para contas presas dentro de bolsões da rede, espera-se que o MSD plane em tempos de atraso suficientes (ou seja, onde está o MSD e δ² é o MSD máximo). Uma vez que o ISF pode ser expresso em termos do MSD como , e uma vez que o ISF não orógodico vai para C em longos tempos de atraso (ou seja, a relação é obtida^32,75. Portanto, pode-se usar C(q) para encontrar δ², e isso rendeu δ² = 0,017 μm² e 0,0032 μm² para as redes de vimentina de 34 e 49 μM, respectivamente (correspondente a δ = 0,13 μm e 0,057 μm).

Figura 6: Parâmetro de nonergodicidade vs. número de ondas para redes de vimentina. De ajustes ao ISF, o parâmetro de nonergodicidade C é determinado para uma faixa de valores q . Em bronzeado (vermelho) estão os dados de imagens de contas de 0,6 μm dentro de redes de vimentina com uma concentração de vimentina de 34 μM (49 μM). As barras de erro representam os desvios padrão em vários filmes (cinco filmes para os dados com a rede de 34 μM [tan] e quatro filmes para os dados com a rede 49 μM [vermelho]). O eixo y tem escala logarítmica. Observa-se uma q-dependência de C que se segue , o que permite extrair o deslocamento médio máximo quadrado, δ². Ajustes para serem mostrados com as linhas sólidas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Pode-se usar outros métodos para extrair o tamanho do confinamento δ dos dados, bem como o expoente subdiffusivo encontrado a partir da análise de τ(q) para contas dentro da rede vimentina de 19 μM. Em primeiro lugar, pode-se usar o método descrito por Bayles et ^al.76 e Edera et ^al.77 para extrair o MSD da matriz DDM. Notavelmente, este método não requer nenhum encaixe da matriz DDM. Basta calcular a matriz DDM, D(q, Δt) e (a partir da qual A(q) e B podem ser determinados). Então, para encontrar o MSD, usa-se a relação . Observe que este método para encontrar o MSD pressupõe que a distribuição de deslocamentos de partículas é gaussiana, embora trabalhos anteriores tenham mostrado que, em certos casos, os MSDs derivados do DDM concordam com os MSDs do rastreamento de partículas, mesmo quando os deslocamentos não são gaussianos⁷³. Para este sistema, como esperado⁷⁸, não há gaussianidade na distribuição de grandes deslocamentos, como visto na Figura S1. No pacote PyDDM, a função extract_MSD deve ser executada, que retorna . Em segundo lugar, pode-se usar rastreamento de partículas únicas para encontrar o MSD. Embora o DDM possa ser usado para analisar imagens onde a alta densidade de partículas ou a resolução óptica limitada proíbe a localização precisa de partículas, para as imagens de contas de 0,6 μm em redes vimentinas, fomos capazes de localizar e rastrear contas usando o software trackpy (https://github.com/soft-matter/trackpy)⁷⁹. Este pacote de software de rastreamento de partículas usa os algoritmos descritos por Crocker e Grier⁸⁰.

Figura 7: Deslocamento médio ao quadrado versus tempo de atraso para redes vimentadas. O MSD foi determinado utilizando dois métodos. Primeiro, o MSD foi computado a partir da matriz DDM (mostrado com símbolos sólidos). Em seguida, o MSD foi determinado usando o rastreamento de partículas únicas (SPT) para encontrar trajetórias de partículas (símbolos abertos). As barras de erro são determinadas da mesma forma descritas nas duas legendas de figuras anteriores. (A) MsDs para contas de 0,6 μm na rede de vimentina de 19 μM indicam movimento subdiffusivo, com boa concordância entre os dois métodos de encontrar o MSD. (B) MsDs para contas de 0,6 μm na rede de vimentina de 49 μM indicam movimento enjaulado, com boa concordância entre os dois métodos de encontrar o MSD e com o máximo de MSD encontrado no parâmetro de nonergodicidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O tempo de defasagem MSDs vs. lag para contas de 0,6 μm na rede vimentina de 19 μM e na rede vimentina de 49 μM são mostrados na Figura 7. Em ambos os casos, o MSD determinou da DDM um bom acordo com o MSD encontrado através do rastreamento de partículas únicas (SPT). Além disso, para a rede menos concentrada, o expoente de escala subdiffusiva (α em ) foi de cerca de 0,9. Isso é consistente com o dimensionamento τ(q) encontrado por montagem do ISF para determinar τ(q) (ou seja, 2/2,2 = 0,9). Para a rede mais concentrada, o MSD planalto em tempos de atraso mais longos. O DMM máximo encontrado analisando a q-dependência do parâmetro de nonergodicidade (mostrado na Figura 7B com a linha horizontal em δ² = 0,0032 μm²) foi aproximadamente o mesmo valor que os MSDs tanto do SPT quanto do DDM pareciam estar em patamar. Há uma discrepância entre os MSDs de tempo de atraso mais longos determinados a partir de DDM e SPT na Figura 7A. Embora isso possa ser devido a um número limitado de trajetórias de tempo de atraso longo, também pode ser o caso de que otimizar ainda mais a gama de valores q para os quais a matriz DDM é usada para estimar cada tempo de atraso (como feito por Bayles et al.76 e Edera et ^al.77) melhoraria nossos resultados, e essa otimização será o foco do trabalho futuro.

Esses experimentos em que foram registradas sequências de imagens de contas rastreadoras embutidas em uma rede de filamentos intermediários vimentin permitiram análises independentes: DDM (usando o pacote descrito aqui) e SPT (usando trackpy). Ambas as análises podem revelar o grau de subdiffusão e comprimento de confinamento, permitindo que se use duas técnicas independentes de análise de imagem para fornecer métricas complementares. Existem quantidades adicionais que se pode comparar de SPT e DDM. Por exemplo, a heterogeneidade na dinâmica da amostra pode revelar-se como não-gaussianidade na distribuição de deslocamentos de partículas (ou seja, a distribuição van Hove) determinada a partir de SPT, bem como em um ISF determinado a partir de DDM que se encaixa em um exponencial^{esticado 34,35}. A Figura S1 mostra a distribuição van Hove para as partículas de 0,6 μm em redes vimentinas e discute o expoente de alongamento encontrado a partir da montagem dos ISFs — métricas usadas em conjunto em estudos anteriores para demonstrar a dinâmica heterogênea de partículas dentro de sistemas biomiméticos ^9,10,47 ou outros ambientes lotados ³⁴ . Como outro exemplo, o ISF pode ser calculado a partir de trajetórias de partículas medidas com SPT e comparadas com os ISFs adquiridos pelo DDM. Embora os deslocamentos médios e distribuições de deslocamento sejam as métricas mais frequentemente retiradas da análise SPT, pode-se também calcular o ISF a partir de trajetórias de partículas, usando (ver Figura S2). Este ISF pode ser comparado com ISFs gerados pelo DDM e usado para revelar dinâmicas não aparentes no MSD⁵⁹.

Embora a aquisição de imagens de partículas rastreadoras dentro de uma rede possa permitir que se use os métodos de análise complementar do SPT e DDM, é importante notar que uma vantagem do DDM sobre o SPT é que ele não requer imagens de contas (ou outras características) que podem ser facilmente localizadas e rastreadas. Para demonstrar este ponto, destacamos em seguida a análise de redes ativas de filamentos de actina e microtúbulos, onde a rotulagem fluorescente de actina e tubulina permite a imagem de ambos os tipos de filamento, distinguidos uns dos outros através de diferentes fluoroforos, com um microscópio confocal de varredura a laser multicolorida.

As imagens foram adquiridas com um microscópio confocal de escaneamento a laser de redes actin-microtúbulos com atividade impulsionada pela minosina (myosina do músculo esquelético do coelho II; #MY02 do citoesqueleto). Detalhes dos experimentos e resultados foram descritos anteriormente¹¹, e os resultados representativos aqui mostrados são da análise de dois filmes fornecidos nos materiais suplementares (filmes S1 e S4) para¹¹. Ambas as sequências de imagem foram gravadas em 2,78 quadros/s para 1000 quadros.

Para analisar essas imagens, a matriz DDM foi calculada para 50 tempos de atraso que variam de 0,4 s a 252 s (1 quadro a 700 quadros). A matriz DDM foi então adequada ao modelo , sendo a função de dispersão intermediária . Há, portanto, quatro parâmetros de ajuste: A, τ, s e B. Os resultados desses ajustes são mostrados na Figura 8. Observou-se que a matriz DDM para um determinado q-valor tinha um platô em tempos de baixa defasagem, aumentado com o tempo de defasagem, e depois planado (ou mostrou sinais de início ao planalto) em grandes momentos de defasagem. A matriz DDM para os valores mais baixos de q não atingiu um patamar em longos tempos de defasagem. Deve-se, portanto, esperar baixa precisão na medição do tempo de decomposição para essas dinâmicas de baixo q (grande extensão).

Os tempos característicos de decomposição, τ, dos ajustes à matriz DDM são mostrados na Figura 9. Os resultados são apresentados para uma rede composta ativa actin-microtúbula (semelhante ao filme^S111) e para uma rede ativa de actin (semelhante ao filme S4¹¹). Ambas as redes foram preparadas com as mesmas concentrações de actina e minoína, mas a rede somente actin foi criada sem tubulina, como descrito em¹¹. Para esses dois tipos de redes ativas, a relação de direito de poder observada foi . Este escalonamento indica movimento balístico e que a contração e o fluxo movidos a miosina dominam o movimento térmico dos filamentos. A partir de τ = (vq)^-1, foi encontrada uma velocidade característica, v, de cerca de 10 nm/s para a rede ativa actin-microtúbula e 75 nm/s para a rede ativa actin. Esses valores são consistentes com a análise de velocimetria da imagem de partículas dos mesmos vídeos mostrados em¹¹. O dimensionamento não se mantém nos valores q mais baixos para a rede composta actin-microtubule ativa. Isso é provável porque os verdadeiros tempos de decadência para esta rede composta actin-microtúbula nos valores q mais baixos são mais longos do que o tempo máximo de defasagem da matriz DDM computada. O tempo máximo de defasagem é indicado com a linha vermelha horizontal na Figura 9, e os tempos de decomposição desviados do escalonamento esperado perto desses tempos mais longos.

Figura 8: Matriz DDM vs. tempo de defasagem para uma rede composta ativa actin-microtúbula. A matriz DDM para vários valores de q é plotada em função do tempo de atraso de um filme de uma rede composta composta de monômeros de actina de 2,9 μM, 2,9 μM de dimers de tubulina e 0,24 μM de micosina. Esses dados mostram a análise apenas do canal microtúbulo de uma série de imagens temporizais multicoloridas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: Tempo de decomposição versus número de ondas para redes ativas de actin-microtúbulos. A partir da montagem da matriz DDM, o tempo de decomposição, τ, em função do número de ondas, q, é encontrado. Plotado é τ vs q para imagens de uma rede ativa actin-microtúbula (analisando apenas o canal microtúbulo) em marrom e para imagens de uma rede ativa de actin em verde. Ambas as redes possuem as mesmas concentrações de actina e miosina (2,9 μM e 0,24 μM, respectivamente); o composto actin-microtúbulo tem 2,9 μM de dimers de tubulina. Os tempos de decadência para a rede de actina ativa são muito menores do que os tempos de decomposição para a rede ativa actin-microtúbula, o que indica um movimento mais rápido da rede ativa actin. Em ambos os casos, a dinâmica é balística, pois os dados seguem uma tendência. Inset: o enredo dos ISFs vs. o tempo de atraso escalado pelo número de ondas (Δt × q) mostra um colapso dos ISFs sobre uma faixa de valores q . Isso também indica movimento balístico. Os ISFs mostrados neste início são da rede ativa actin. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para esses dados de redes ativas, optamos por se encaixar na matriz DDM, . Isso contrasta com o que foi feito para os dados das contas na rede vimentina, onde A (q) e B foram estimados sem qualquer encaixe para isolar o ISF, f (q, Δt). Neste caso, para os dados ativos da rede, A e B foram deixados como parâmetros adequados porque os métodos utilizados para estimar B não resultaram em bons ajustes. O método padrão para estimar B é calcular e assumir que, em geral q, isso vai para B/2. No entanto, esse método superestimou B para esses dados, o que foi visto no fato de que, ao calcular os ISFs de B estimados desta forma (não mostrados), os ISFs foram maiores que 1 em tempos de atraso precoce (enquanto eles devem passar de um máximo de 1 para zero ou algum parâmetro de nonergodicidade com tempo de atraso crescente). Pode-se selecionar outros métodos para estimar B usando o parâmetro background_method. Um desses outros métodos é estimar B como o mínimo da matriz DDM em tempos de atraso precoce (definido com background_method=1). Um método semelhante foi utilizado por Bayles et ^al.76, embora não assumissem que B era constante com q. Outra opção é estimar B como o valor médio sobre todos os tempos de defasagem da matriz DDM no máximo q (definido com background_method=2). Estes diferentes métodos para estimar o fundo, bem como os resultados para permitir que B seja um parâmetro de montagem livre, são mostrados na Figura 10. A partir dessas parcelas, pode-se ver que a amplitude, A, não atingiu zero nos maiores valores q sondados, uma vez que não platô em grande q (Figura 10B), e desde D(q_max, Δt) passou de um planto de lag mais baixo para algum planalto de tempo de lag mais alto (ou seja, no _{q max}, não havia um A não-zero; Figura 10D). Portanto, nem estimar B como nem como seria apropriado. Deve-se inspecionar vs. q e D(q_max, Δt) vs. Δt antes de decidir como (ou se) estimar B.

Figura 10: Número de antecedentes vs. ondas para redes ativas de actin-microtúbulos. A partir da montagem da matriz DDM, pode-se encontrar o fundo, B, em função do número de ondas, q. Mostrado é B vs. q para imagens de uma rede ativa actin-microtúbula (analisando apenas o canal microtúbulo) determinado a partir desses ajustes com os símbolos roxos. As três linhas sólidas em (A) mostram estimativas do fundo encontrado sem qualquer encaixe. A linha superior, mais escura em (A) mostra o fundo estimado usando , o que pode ser apropriado se planaltos a um valor constante em geral q. A partir (B), nota que ainda não atingiu um valor constante no maior q sondado. Portanto, o uso deste método superestima o fundo. A linha de fundo em (A) mostra o fundo estimado usando . Se a matriz DDM mostrar um platô de tempo de atraso baixo como mostrado em (C) com a linha vermelha, então este método pode ser apropriado para estimar o fundo. A linha média e mais clara em (A) mostra o fundo estimado de . Este método pode ser apropriado se, no _{q max}, a amplitude, A, atingiu zero. A partir de (D), vê-se que a amplitude não é zero e, portanto, este método superestima o fundo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar S1: Distribuições de probabilidades de deslocamentos de partículas. As distribuições de probabilidades de deslocamentos de partículas mostram não gaussianidade para concentrações de vimentina de 34 μM e 49 μM. O rastreamento de partículas únicas de 0,6 μm de diâmetro foi realizado em redes de vimentinas de diferentes concentrações. Diferentes tempos de atraso são mostrados nas distribuições de deslocamento para as três condições. (A) A distribuição de deslocamentos de partículas em uma rede de vimentina de 19 μM está adequada a uma função gaussiana. A largura do gaussiano aumenta com o aumento do tempo de atraso. (B) A distribuição de deslocamentos de partículas em uma rede de vimentina de 34 μM mostra mais não gaussianidade, especialmente em grandes deslocamentos, do que no caso de 19 μM. (C) A distribuição de deslocamentos de partículas em uma rede de vimentina de 49 μM também mostra não gaussianity. Além disso, as larguras das distribuições não aumentam com o tempo de defasagem tão significativamente quanto nas amostras com concentrações de vimentina mais baixas, indicando movimento confinado. As distribuições não gaussianas van Hove (vistas para todas as amostras de vimentina, mas mais aparentes nas concentrações mais altas) estão associadas à dinâmica heterogênea, como frequentemente visto no transporte de partículas em ambientes lotados e confinados. Outro indicador de transporte heterogêneo que é determinado a partir da análise DDM é o expoente de alongamento usado para se encaixar na função de dispersão intermediária (o parâmetro s na equação para o ISF utilizado aqui: + ). Os expoentes médios de alongamento ao longo da faixa q de 0,4 ^μm-1 a 9,4 ^μm-1 são, da maior concentração vimentina para menor, 0,53 ± 0,07, 0,64 ± 0,02 e 0,86 ± 0,04 (média ± desvio padrão). Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar S2: As funções de dispersão intermediárias da DDM e da SPT. As funções de dispersão intermediária (ISF) para cinco diferentes números de ondas são mostradas. O tempo de isf versus lag encontrado através do DDM é plotado com marcadores circulares, e o ISF computado a partir de trajetórias de partículas únicas com quadrados abertos. Linhas pretas pontilhadas mostram os ajustes nos ISFs adquiridos pelo DDM. O ISF é calculado a partir de trajetórias de partículas únicas, utilizando . Em (A), o ISF é mostrado para partículas de 0,6 μm nas redes de vimentina de 19 μM. Em (B), o ISF é mostrado para partículas de 0,6 μm nas redes de vimentina de 34 μM. As discrepâncias no ISF encontradas no DDM e no SPT são provavelmente devido a um número limitado de trajetórias de tempo de atraso longo. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo Complementar 1: Protocolo para o uso de DDM. A entrada e saída das etapas mostradas no protocolo são apresentadas. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo complementar 2: Detalhes da preparação da amostra e arquivos de parâmetros de exemplo para redes vimentinas. São fornecidas etapas detalhadas para preparação de amostras e aquisição de imagens em redes vimentinas. Além disso, também é fornecido um arquivo de parâmetros de exemplo para a análise dos dados apresentados na seção de resultados representativos em redes vimentin. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Discussion

O pacote de software descrito aqui usa DDM para analisar flutuações de densidade observadas em imagens adquiridas usando um microscópio óptico. Os resultados representativos dos dados de partículas rastreadoras incorporadas nas redes de vimentina foram mostrados pela primeira vez. A análise desses dados pode ser usada para caracterizar o tamanho e rigidez da malha da rede de forma semelhante à forma como o rastreamento de partículas únicas tem sido usado em muitos estudos anteriores de redes de citoesqueleto ^6,12,13. Uma vantagem de usar DDM sobre o rastreamento de partículas únicas é que o DDM não exige que as partículas sejam localizadas. Portanto, mesmo em imagens onde a densidade de partículas é muito alta ou as partículas muito pequenas para localizar e rastrear, o DDM ainda pode determinar a dinâmica. Onde o rastreamento de partículas únicas seria vantajoso é ao inspecionar a variabilidade partícula-partícula. Com o DDM, encontra-se a dinâmica média do conjunto, enquanto que, com o rastreamento de partículas únicas, pode-se calcular tanto o MSD de uma única partícula quanto o MSD médio do conjunto. No entanto, o DDM pode ser usado para investigar dinâmicas heterogêneas analisando várias regiões de interesse dentro de um grande campo de visão.

Em seguida, foram apresentados^resultados representativos de dados de filamentos rotulados fluorescentemente em uma rede ativa composta por dois tipos de filamento citoesqueléticos diferentes. Com esses dados, o movimento balístico foi caracterizado sem precisar de características localizáveis dentro da imagem. Uma vez que o DDM extrai a dinâmica média do conjunto com poucas entradas de usuário, torna a comparação de séries de imagens adquiridas com diferentes condições simples (por exemplo, comparando amostras com diferentes proporções de actina com microtúbulos ou amostras com diferentes concentrações de mosina, como feito em⁵⁰). Além disso, usando imagens fluorescentes, podemos investigar a dinâmica de diferentes componentes de uma rede usando rotulagem multicolorida. Isso foi feito em ^11,50, onde a dinâmica da actina e dos microtúbulos foram analisadas separadamente em uma rede composta ativa actin-microtúbula utilizando imagens multicoloridas. Na seção de resultados representativos aqui, apenas os resultados do canal microtúbulo foram mostrados, mas em trabalhos anteriores, comparamos a dinâmica dos filamentos microtúbulo e actin¹¹.

Notamos que esses resultados representativos mostram subdiffusão passiva ou movimento balístico ativo. É importante ressaltar que o DDM pode ser usado para analisar sistemas onde há um crossover no tipo de dinâmica em escalas intermediárias de tempo ou comprimento. Como exemplos, Kurzthaler et al. usaram DDM com um sistema de coloides Janus ativos para explorar o movimento direcionado ativo em escalas de curto prazo e randomização da orientação em escalas de tempo mais longas⁵⁹; Giavazzi et al. usaram DDM com espuma grosseira e encontraram um crossover na dinâmica correspondente à escala de comprimento de uma bolha³³; e Cho et al. usaram DDM com géis coloidais e encontraram três regimes distintos em diferentes escalas de comprimento que abrangem desde os aglomerados fractais até toda a rede³².

Os dados incluídos na seção de resultados representativos foram adquiridos com microscopia de campo brilhante e microscopia confocal de varredura a laser. No entanto, como observado anteriormente, o DDM pode ser usado com muitas modalidades de imagem. Com qualquer modalidade de imagem, os usuários devem considerar configurações ópticas, como o grau de seção óptica ou a profundidade de campo. Um alto grau de seção óptica pode reduzir o sinal de objetos fora de foco, mas não será capaz de medir com precisão a dinâmica sobre escalas de tempo maiores do que a escala de tempo para os objetos saírem da profundidade do campo^25,28. Uma discussão mais aprofundada sobre como a profundidade de campo dependente de Q afeta a análise de DDM pode ser encontrada em²². Para imagens de brightfield, os usuários também podem precisar considerar a espessura da amostra. Enquanto para amostras de dispersão fraca, amostras mais grossas podem fornecer mais sinal⁴², amostras turvas podem exigir a modificação da análise para explicar a dispersão múltipla⁸¹. Finalmente, para métodos de imagem que não são invariantes de espaço linear (ou seja, onde a intensidade registrada pela câmera de um objeto depende de onde esse objeto está no plano de amostra x-y), pode-se precisar explicar a variância do espaço linear, como demonstrado com ddm de campo escuro²⁷.

Para quem começa com dDM, queremos enfatizar a importância de considerar a resolução espacial e temporal. Ao inspecionar os tempos de decadência determinados em função do número de ondas, é importante marcar os limites de sua resolução (ou seja, os tempos máximos e mínimos de defasagem e o número máximo de ondas, como feito na Figura 5). Deve-se pensar cuidadosamente sobre esses limites antes de coletar dados para que a lente objetiva ideal, tamanho da imagem, taxa de quadro e duração do filme possam ser selecionadas. A outra consideração importante é como estimar o parâmetro de fundo B. Múltiplos métodos para estimar o fundo têm sido utilizados na literatura, e os efeitos do excesso ou subestimação B foram descritos em publicações anteriores^62,77. Como mostrado na Figura 10, o PyDDM permite que os usuários implementem diferentes métodos para estimar B, e sugerimos que novos usuários experimentem esses métodos e avaliem quais são apropriados para usar.

Uma força deste pacote é sua documentação completa e passo a passo com dados de exemplo, o armazenamento e a organização de metadados para acompanhar como as análises foram realizadas e a flexibilidade em como analisar a matriz DDM (vários modelos de montagem, múltiplos métodos para estimar o parâmetro de fundo B, a capacidade de encontrar o MSD). No entanto, existem vários aspectos neste código que poderiam ser melhorados. Atualmente, o código não foi otimizado para velocidade de computação rápida. Foram relatados métodos para acelerar o cálculo^{em 61,62}, e estes serão implementados em versões futuras. Além disso, planejamos implementar métodos recentemente relatados para melhor estimar incertezas e empregar simulações para orientar os usuários ao modelo^{ISF 62} apropriado. Para outras melhorias, esperamos que os usuários entrem em contato conosco com sugestões.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Câmera CMOS, Orca-Flash 4.0	Hamatsu
F-127 Pluronic	Sigma Aldrich
Jupyter Notebook
Nanodrop	Thermo Fisher
Nikon Microscópio Ti-Eclipse	Nikon
PLL-PEG-bio	SuSos AG, Dü bendorf, Suíça
Grânulos de poliestireno	Sigma Aldrich
Mini-de diálise de proteína	Thermo Fisher
PyDDM	Universidade de San Diego	N/A	Software de código aberto disponível na https://github.com/rmcgorty/PyDDM