Caracterizando modificações de RNA em neurônios únicos usando espectrometria de massa

Summary

As modificações pós-transcrição do RNA representam uma camada subestudada de regulação de tradução que recentemente foi ligada à plasticidade do sistema nervoso central. Aqui, a preparação da amostra e a abordagem de espectrometria de massa cromatografia líquida-tandem é descrita para caracterização simultânea de numerosas modificações de RNA em neurônios únicos.

Abstract

As modificações pós-transcrição (PTMs) do RNA representam um mecanismo subestudado envolvido na regulação da tradução no sistema nervoso central (SNC). Evidências recentes associaram modificações específicas do RNA neuronal aos paradigmas de aprendizagem e memória. Infelizmente, os métodos convencionais para a detecção dessas características epitransomicas só são capazes de caracterizar modificações de RNA altamente abundantes em tecidos a granel, impedindo a avaliação de perfis únicos de PTM que podem existir para neurônios individuais dentro dos circuitos comportamentais ativados. Neste protocolo, uma abordagem é descrita — análise de modificação de RNA de um neurônio único por espectrometria de massa (SNRMA-MS) — para detectar e quantificar simultaneamente numerosos ribonucleosídeos modificados em neurônios únicos. A abordagem é validada utilizando neurônios individuais do molusco marinho, Aplysia californica, começando com isolamento cirúrgico e tratamento enzimático de gânglios principais cns para expor corpos celulares neurônios, seguido pelo isolamento manual de um único neurônio usando agulhas afiadas e uma micropipette. Em seguida, o tratamento mecânico e térmico da amostra em um pequeno volume de tampão é feito para liberar o RNA de uma célula individual para digestão subsequente de RNA. Os nucleosídeos modificados são então identificados e quantificados usando um método otimizado de espectrometria de massa de cromatografia líquida. O SNRMA-MS é empregado para estabelecer padrões de modificação de RNA para neurônios únicos e identificados de A. californica que tenham conhecido morfologias e funções. Exemplos de SNRMA-MS qualitativos e quantitativos são apresentados que destacam a distribuição heterogênea das modificações de RNA entre neurônios individuais em redes neuronais.

Introduction

Modificações nos nucleosídeos canônicos do RNA têm sido cada vez mais reconhecidas por seus inúmeros papéis na regulação da tradução de proteínas. Mais de 150 modificações únicas de RNA foram relatadas até o momento que variam em complexidade desde a metilação, adição de heteroatoma, até a conjugação com metabólitos^{celulares 1,2}. Este alfabeto RNA expandido, também conhecido como epitranscripto, é gerado por escritores enzimáticos e é responsável por alterar a estabilidade³, dobrando⁴ e eficiência de tradução ^5,6 de RNAs celulares. Modificações de RNA selecionadas também podem ser revertidas através de borrachas enzimáticas ^7,8, enquanto outras são anexadas às RNAs substoquiemetricamente ^9,10, tornando uma paisagem complexa de sequências de RNA modificadas e não modificadas em sistemas biológicos.

A importância das modificações do RNA na função biológica é indicada pela distribuição desigual de modificações entre diferentes órgãos e tecidos, incluindo sub-regiões do sistema nervoso central (CNS)¹¹. Essa heterogeneidade química tem sido ligada ao desenvolvimento do CNS¹², à resposta ao estresse¹³ e à plasticidade dependente da atividade¹⁴. As sub-regiões do CNS compreendem ainda populações heterogêneas de células nas quais as células individuais apresentam perfis químicos distintos 15,16,17,18. Mesmo células únicas do mesmo tipo podem exibir transcrições únicas, em parte devido aos microambientes teciduais¹⁹ e à expressão genética estocástica²⁰. No entanto, embora a caracterização do transcriptome unicelular seja um pouco rotineira, não há métodos análogos para estabelecer epitranscriptomes de célula única para múltiplas modificações de RNA. Novas abordagens capazes de traçar o perfil da distribuição de modificações de RNA em células individuais são necessárias para análise abrangente da heterogeneidade celular e influência regulatória de modificações pós-transcricionais (PTMs) no CNS e em outros sistemas biológicos.

A medição simultânea de numerosas modificações de RNA em células/tecidos a granel é prontamente realizada usando técnicas de espectrometria de massa cromatografia líquida-tandem tandem (LC-MS/MS). Para a análise LC-MS/MS de ribonucleosídeos modificados, o RNA é extraído de células (tipicamente 10^{3-10 6} células), purificado por precipitação e resuspensão, e posteriormente digerido em nucleosídeos. A mistura de amostras composta por nucleosídeos canônicos e modificados é então injetada no sistema LC-MS para separação e detecção de analitos, levando à determinação do complemento completo das modificações de RNA em um organismo 21,22,23. O LC-MS/MS foi recentemente utilizado para determinar 26 modificações de RNA no CNS do modelo neurobiológico, Aplysia californica (A. californica). As abundâncias de algumas dessas marcas epitransomicas apresentaram dinâmicas dependentes do tempo e da região que se correlacionaram com mudanças comportamentais no animal²⁴. No entanto, só foi possível detectar modificações de RNA em amostras a granel contendo células > 10³ devido à sensibilidade limitada do método. Essas amostras maiores provavelmente ocultaram perfis únicos e funcionalmente importantes de modificação do RNA de células individuais com médias populacionais. Embora o controle cuidadoso das condições de preparação da amostra tenha melhorado os limites de detecção de modificações de RNA em amostras de pequeno volume 25,26,27,28, ainda há necessidade de métodos analíticos que possam detectar e quantificar múltiplas ribonucleosídeos modificados em células únicas.

Este protocolo introduz a análise de modificação de RNA de um neurônio único por espectrometria de massa (SNRMA-MS), que permite a detecção de mais de uma dúzia de modificações de RNA em neurônios únicos do CNS de A. californica²⁹. A abordagem consiste no isolamento cirúrgico de células únicas e identificadas das principais gânglios do CNS seguido de um fluxo de trabalho de preparação de amostra otimizado envolvendo lise celular mecânica, denaturação de RNA e hidrólise enzimática em um tampão compatível com MS. A identificação e quantificação de nucleosídeos pós-transcrição modificadas é então realizada usando LC-MS/MS. O SNRMA-MS preenche uma necessidade não atendida no campo da análise de modificação do RNA, facilitando a aquisição de perfis de modificação de RNA pós-transcricional para neurônios únicos e tem potencial para aplicação futura a outros tipos de células.

Protocol

1. Preparação de materiais e soluções

1. Prepare a água do mar artificial (ASW) com 460 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM CaCl₂, 22 mM MgCl₂, 26 mM MgSO₄ e 10 mM HEPES na água obtida de um rigoroso sistema de purificação. Ajuste o pH para 7,8 usando 1 M NaOH ou HCl. Normalmente, prepare 1 L de ASW e armazene a 14 °C até usar.
2. Prepare uma solução ASW-antibióticos com 10.000 U/mL de penicilina G, 10 μg/μL de estreptomicina e 10 μg/μL de gentamicina e armazenar a -20 °C. Imediatamente antes do experimento, descongele e dilua a solução de estoque de antibióticos congelados 1:100 em 20-40 mL de ASW. A concentração final de antibióticos na solução ASW de trabalho é de 100 U/mL de penicilina G, 100 μg/mL de estreptomicina e 100 μg/mL de gentamicina.
3. Prepare um tampão de digestão RNA combinando 1 μL de 10 μg/μL de gêmeu bovino, 0,5 μL de 0,5 μg/μL pentostatina, 0,495 μL de 2 U/μL fosfatase alcalina, 1 μL de 0,1 U fosfodiesterase I (em 10 mM MgCl₂) e 0,38 μL de endonuclease de Serratia marcescens (25 U) por amostra. Se analisar várias amostras, prepare uma mistura mestra em um tubo separado contendo o volume de cada reagente multiplicado pelo número de amostras a serem analisadas, mais uma para explicar a perda de reagente incidental das etapas de transferência de tubulação.
4. Prepare várias agulhas afiadas (vidro ou metal) para o isolamento manual dos neurônios. Faça agulhas de metal em casa por gravura eletroquímica de fio de tungstênio como em³⁰ ou compre-as. Prepare agulhas de vidro de capilares de vidro borossilicato de parede grossa ou padrão (1 mm de diâmetro externo) usando um puxador de micropipette. Para o presente método, mantenha o diâmetro da ponta da agulha entre 1-5 μm, com um comprimento do pescoço de 100-150 μm.
   NOTA: A fabricação de agulhas metálicas e de vidro pode ser otimizada para produzir ferramentas que atendam às necessidades individuais do pesquisador e ao modelo biológico específico que está sendo investigado.

2. Isolamento do neurônio único

1. Esfrie uma solução de 0,33 M MgCl₂ a 14 °C. Utilizando uma seringa de 50 mL, anestesia A. californica (150-250 g) injetando a solução MgCl₂ na cavidade corporal do animal. Os melhores resultados são obtidos com proporção de 1:3 do volume da solução (mL) para a massa corporal animal (g). Espere aproximadamente 3 minutos para que o animal fique relaxado, garantindo que ele não exiba contrações corporais em resposta à estimulação tátil.
2. Coloque o lado ventral do animal (lado do pé) em uma bandeja de dissecação. Disseque o animal usando uma tesoura cirúrgica com uma ponta cega posicionada em direção ao animal, fazendo cuidadosamente um corte longitudinal através do pé.
3. Fixar os lados rostral, caudal e lateral do corpo animal para expor os órgãos internos e os gânglios do CNS localizados na cavidade corporal. Isole os gânglios principais da CNS do animal cortando cirurgicamente nervos e alguns conectivos originários dos gânglios.
4. Mergulhe o gânglio em uma solução do tipo protease XIV de Streptomyces griseus (10 mg/mL em solução de antibióticos ASW) e incubar a 34 °C por 30 min ou 1 h (para gânglio cerebral).
   NOTA: A duração da incubação depende da estação, tamanho e condição dos animais, bem como dos neurônios-alvo. O isolamento de alguns neurônios requer maior incubação do que outros e deve ser determinado experimentalmente.
5. Enxágüe o gânglio 6x com solução asw-antibióticos e transfira todos os gânglios em um prato revestido de polímero de silicone cheio de solução asw-antibióticos usando uma tubulação de transferência de polipropileno que foi cortada para uma abertura de ~5 mm. Trate a pipeta com 1 mg/mL de albumina de soro bovino em ASW para minimizar a aderência do gânglio à pipeta (opcional). Mantenha o gânglio submerso no ASW o tempo todo.
   NOTA: O tratamento enzimático reduz a estabilidade mecânica dos neurônios e do tecido conjuntivo circundante e, como resultado, as membranas neuronais podem ser danificadas devido à exposição ao ar durante a transferência de gânglios.
6. Fixar os gânglios e usar micro tesouras e fórceps finos para remover bainhas de gânglios. Com tratamento enzimático suficientemente forte, use agulhas de vidro ou metal para dessheathing.
7. Identificar visualmente neurônios de interesse de A. californica . Neste trabalho, foram estudadas as seguintes células: R2 no gânglio abdominal, LPl1 no gânglio pleural, células metacerebrais (MCCs) no gânglio cerebral, e células B2 no gânglio bucal. Faça imagens ópticas de todas as preparações neurais e gangliônicas usando um microscópio calibrado a 20x de ampliação total para determinar os tamanhos e volumes de cada tipo de célula.
8. Usando um capilar de vidro puxado ou agulhas de tungstênio afiadas, isole cuidadosamente a célula identificada do gânglio a granel.
9. Desenhe uma pequena quantidade (1 μL) de ASW em uma micropipette de plástico e, em seguida, transfira a célula isolada para um tubo de amostra PCR contendo 4 μL de acetato de amônio de 0,365 M (pH 9.2). Para medições em branco, colete 5 alíquotas μL da solução ASW-antibióticos do prato contendo o gânglio e misture com o tampão de digestão (descrito abaixo).

3. Lise celular e digestão de RNA para SNRMA-MS

1. Lise os neurônios isolados por aspiração repetida e dispensando uma micropipette (~100 μm de diâmetro interno) em acetato de amônio de 0,365 M. Algumas células menores podem não se romper imediatamente; para lise-los, aplique pressão através do diâmetro da célula com um capilar de vidro puxado.
2. Use um cicloviário térmico para aquecer as amostras com o seguinte programa de temperatura: 95 °C para 3 min, 10 °C por 3 min, mantenha a 10 °C. Remova o tubo de amostra do ciclor térmico.
3. Adicione 3.375 μL de tampão de digestão de RNA para cada amostra e misture a solução usando uma micropipette retirando e distribuindo a solução várias vezes. Use uma centrífuga de bancada em miniatura a 2700 x g por 30 s para girar qualquer gotícula líquida agarrada às paredes do tubo PCR.
4. Incubar as amostras no ciclofaixador térmico a 37 °C por 3 h, seguido por um porão de 10 °C (tampa aquecida definida para ON). Imediatamente após a amostra ter esfriado para 10 °C, transfira 7 μL da solução para um frasco de autosampler equipado com uma inserção de 250 μL, tomando cuidado para evitar a formação de bolhas no tubo de autosampler.

4. Espectrometria de massa cromatografia líquida-tandem

NOTA: Analise os digestores de um neurônio único e os padrões autênticos de nucleosídeos modificados usando um sistema LC-MS/MS equipado com uma fonte de ionização de eletrospray e válvula de desvio de seis portas.

1. Para preparar o sistema LC para separação de nucleosídeos canônicos e modificados, equilibre uma coluna C18 (150 mm x 2,1 mm, 2,2 μm de tamanho de partículas, 120 Å de diâmetro de poros) com 99% de fase móvel A (acetato de amônio de 5 mM, pH 5,6) e 1% de fase móvel B (60/40 fase móvel A/acetonitrila (ACN)) a uma vazão de 0,2 mL/min por 12 min a 36 °C. Use solventes de grau LC-MS para preparação de fases móveis.
2. Enquanto a LC equilibra, calibra o espectrômetro de massa introduzindo uma solução de 1 mM de acetato de sódio em 50/50 ACN/água ao espectrômetro de massa via bomba de seringa com uma taxa de fluxo de 5 μL/min. Após a calibração, reconecte o fluxo de LC ao espectrômetro de massa.
3. Programe os seguintes parâmetros de gradiente linear: 1% B para 0-5 min, 5% B a 9 min, 7% B a 11 min, 10% B a 13 min, 15% B a 32 min, 40% B a 38 min, 50% B a 43 min, 100% B a 50 min, 100% B a 60 min, 1% B a 61 min, e uma ree equilíbrio de 12 min a 1% B antes da próxima injeção.
4. Opere o instrumento MS no modo positivo com os seguintes parâmetros: tensão capilar a 4.500 V, temperatura de secagem de 275 °C, N₂ secando gás 5 L/min e gás nebulizador 1 barra. Defina a válvula de desvio para resíduos durante os primeiros 2 minutos de análise e para a fonte para o restante da corrida.
5. Colete espectros de massa sobre uma faixa m/z de 110-600. Selecione íons para dissociação induzido por colisão a 35-40 eV durante um período de ciclo de 3 s usando uma lista de massa preferencial construída usando o banco de dados² e uma janela de isolamento de ± 0,5. Use exclusão ativa para excluir íons da fragmentação após três espectros.
6. Defina a aquisição dinâmica de espectros MS/MS para íons com intensidades acima e abaixo de 50.000 contagens em 4 Hz e 1 Hz, respectivamente, e um limite mínimo para seleção de íons em 1.990 contagens.
7. Para as curvas quantitativas de calibração de ion cromatógrama (EIC) obtidas para padrões nucleosídeos modificados em um mínimo de cinco concentrações para permitir a interpolação de concentrações endógenas endógenas e endógenas.
   NOTA: Os neurônios obtidos de animais com massas corporais de 150-250 g normalmente exigem curvas de calibração para nucleosídeos modificados que variam de 0,02 pmol a 2 pmol, mas esses valores podem variar dependendo da sensibilidade do instrumento.

5. Análise de dados

1. Gerar EICs para nucleosídeos modificados (m/z a partir de valores de banco de dados²). Verifique as identidades dos nucleosídeos modificados putativos comparando suas características de espectro MS2 e retenção de LC aos valores de banco de dados². Consulte a Tabela 1 para obter uma lista de modificações típicas de RNA detectadas em neurônios únicos de A. californica.
2. Integrar manualmente picos que correspondem a nucleosídeos modificados e canônicos e registrar esses valores em uma planilha. Normalize a área de pico para cada nucleosídeo modificado com a soma das áreas de pico para cítidina canônica, uridina e guanosina detectadas na amostra.
   NOTA: A adenosina não está incluída na normalização devido ao seu papel no CNS como neuromodulador dinâmico³¹.
3. Construa uma matriz de dados composta por cada amostra de um único neurônio e as áreas de pico normalizadas correspondentes para nucleosídeos modificados que apresentaram relações sinal-ruído >10. Execute a análise dos componentes principais (PCA) e exiba os dois primeiros componentes principais do gráfico de pontuação. Construa curvas de calibração linear a partir das áreas de pico do EIC obtidas a partir da diluição serial das normas nucleosídeos e calcule as concentrações de analitos detectados.

Results

O SNRMA-MS envolve o isolamento manual dos neurônios identificados em pequenos volumes amostrais para alise, digestão e análise LC-MS/MS (Figura 1A). Este fluxo de trabalho detectou rotineiramente mais de uma dúzia de modificações de RNA em neurônios únicos do CNS de A. californica (Figura 1B), representando uma cobertura de quase metade do epitranscrito conhecido deste animal²⁴ em uma única célula. Por exemplo, submeter o neurônio LPl1 (~500 μm de diâmetro) ao SNRMA-MS resultou na detecção de 15 ± 1 modificações de RNA (n = 3). Os nucleosídeos modificados foram identificados positivamente com base em três atributos: propriedades de retenção de LC, perfis exatos de fragmentação de massa e MS2 em comparação com os valores fornecidos no banco de dados². A Tabela 1 mostra uma lista de todas as modificações de RNA detectadas no neurônio LPl1. O espectrômetro de massa quadrúpole de alta resolução usado para esses experimentos permitiu uma precisão em massa de 4 ppm, bem como a detecção do íon de fragmento MS2 característico em m/z 164 para o nucleosídeo modificado N6,6-dimetiladenosina (m⁶⁶A, Figura 1B). Combinada com os dados de separação da LC, que concordam com os achados depositados no banco de dados (m⁶⁶A elutes após N6-metiladenosine (m⁶A)), a abordagem SNRMA-MS demonstrou a atribuição correta de identidades nucleosídeos modificadas.

A plataforma SNRMA-MS pode ser aproveitada para estabelecer perfis de modificação de RNA de neurônios únicos e investigar sua relação com tecidos a granel. Os neurônios R2 são grandes (~500 μm de diâmetro) células colinérgicas que residem no gânglio abdominal. O SNRMA-MS foi utilizado para analisar modificações de RNA em neurônios R2, bem como o gânglio abdominal a granel circundante (Figura 2A). Áreas de pico normalizadas para modificações de RNA em cada amostra de neurônio/gânglio (n = 7) foram utilizadas como insumos para PCA, revelando que os neurônios R2 apresentam perfis distintos de modificação de RNA em comparação com os gânglios em que residem (Figura 2B). Isso é evidenciado por pontos de dados para neurônios R2 e gânglios abdominais ocupando diferentes regiões do gráfico de pontuação pca. Mais apoio para padrões nucleosídeos modificados únicos foi obtido a partir de uma coorte separada de animais (n = 7) em que foram realizadas comparações pareadas para 13 modificações de RNA que foram comumente detectadas tanto nos neurônios únicos quanto no tecido a granel (Figura 2C). Dois nucleosídeos modificados, pseudouridina (Φ) e 2'-O-metilguanosina (Gm), estavam em abundância significativamente maior na gúlia abdominal em comparação com os neurônios R2. Ao visualizar um subconjunto das modificações de RNA com pares de neurônio-gânglio R2 indicados, todos os gânglios abdominais apresentaram níveis mais elevados de Φ e Gm, e todos, exceto um dos neurônios R2, apresentaram maiores abundâncias de 2'-O-metiladenosina (Am) do que seu gânion correspondente (Figura 2D). No geral, os resultados do SNRMA-MS revelam pela primeira vez que os perfis de modificação do RNA de células únicas podem divergir das células a granel no mesmo tecido.

O uso do SNRMA-MS para investigar o modelo animal A. californica oferece uma oportunidade única para caracterizar perfis de modificação de RNA em neurônios identificados e funcionalmente distintos. As modificações do RNA foram avaliadas pelo SNRMA-MS em quatro células identificadas: R2 e LPl1 (células homologos e colinérgicas envolvidas na liberação da mucosa defensiva)³², MCCs (neurônios modulatórios serotonérgicos envolvidos na alimentação)³³, e células B2 (neurônios peptidergic envolvidos na motilidade intestinal)³⁴. PcA de seis modificações de RNA nesses neurônios identificados, isolados imediatamente após o tratamento enzimático ou cultivados em uma preparação de gânglio para 48 h, demonstraram a estabilidade e a dinâmica dos epitranscriptos de células únicas. Modificações de RNA em células funcionalmente diferentes formaram clusters únicos no gráfico de pontuação enquanto neurônios R2/LPl1 homólogos co-agrupados (Figura 3A). O enredo de carregamento mostra que as diferenças foram impulsionadas principalmente pela abundância de isômeros posicionais de metiladenosina, incluindo 2'-O-metiladenosine (Am) e N1-metiladenosine (^m1A) (Figura 3B). Na mesma análise, foi realizada uma comparação de células e células recém-isoladas cultivadas in situ (ou seja, em seus respectivos gânglios) por 48 h. Como mostrado no gráfico de pontuação do PCA, células funcionalmente diferentes permaneceram distinguíveis por seus perfis de modificação de RNA.

O SNRMA-MS quantitativo pode ser usado para determinar quantidades absolutas de modificações selecionadas de RNA para as quais existem padrões autênticos. Curvas de calibração externa foram geradas para m¹A, Φ, 2'-O-metilcytidine (Cm), Am e m⁶A, e a quantidade de cada nucleosídeo modificado nos pares de células MCC e R2/LPl1 foi determinada por interpolação (Figura 4A-E). As quantidades intracelulares de m¹A e Φ em dois pares de MCCs simétricos pareciam ser semelhantes, enquanto diferenças maiores nas quantidades dessas modificações foram observadas em três pares de células R2/LPl1. Para explicar as diferenças devido ao tamanho físico das células estudadas, as quantidades de modificação do RNA foram normalizadas por volumes celulares calculados a partir da medição óptica dos diâmetros celulares para produzir concentrações intracelulares de nucleosídeos modificados. Foram observadas diferenças significativas nas concentrações intracelulares de Cm e Am entre os neurônios MCCs e R2/LPl1. No geral, o SNRMA-MS permite o perfil qualitativo e quantitativo das modificações do RNA em neurônios únicos.

Figura 1: Fluxo de trabalho SNRMA-MS e detecção de múltiplas modificações de RNA em neurônios únicos por LC-MS/MS. (A) Fotografias de gânglio bucal dessheathed e isolamento de neurônio único em um tubo de amostra. Barra de escala = 200 μm, setas indicam célula B1 identificada. Um diagrama do procedimento de preparação da amostra para análise de LC-MS/MS também é mostrado. (B) EICs sobrepostos para modificações de RNA em um único neurônio LPl1, com inset mostrando espectros MS1 e MS2 para N6, N6-dimetiladenosine (m⁶⁶A). Consulte tabela 1 para valores m/z usados para gerar EICs para nucleosídeos modificados. Este número foi modificado de²⁹. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: SNRMA-MS distingue perfis de modificação do RNA de neurônios únicos e tecido a granel. (A) Esquemático de A. californica CNS e fluxo de trabalho para análise de neurônios R2 e o gânglio abdominal circundante. A fotografia mostra o gânglio abdominal e o neurônio R2 (injetado com corante Verde Rápido para visibilidade). (B) Foram utilizadas áreas de pico relativas de 13 modificações de RNA para gerar as parcelas de pontuação PCA (superior) e de carregamento (inferior). (C) Comparação pariácizante das modificações de RNA no gânglio abdominal e neurônio R2. As barras de erro representam ±1 desvio padrão (SD), *p < 0,05, ***p < 5 x 10⁻⁴, teste t emparelhado com correção Bonferroni-Holm. (D) Comparação de modificações selecionadas de RNA do painel C em que pares de gânglios R2-abdominais para cada animal são mostrados com linhas de gota. Este número foi modificado de²⁹. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Traçar o perfil das modificações do RNA na identificação, neurônios funcionalmente diferentes do gráfico de pontuação A. californica CNS. (A) para MCCs, e células B2, R2 e LPl1 que foram recém-isoladas ou isoladas seguindo na cultura in situ por 48 h (denotada por cMCC, cB2, cR2, cLPl1) e (B) parcelas de carregamento para seis modificações de RNA comumente detectadas nessas células. Este número foi modificado de²⁹. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: SNRMA-MS quantitativo em neurônios A. californica . O Quantitativo SNRMA-MS fornece quantidades absolutas e concentrações intracelulares para vários nucleosídeos modificados em neurônios A. californica identificados. Fotografias de (A) MCCs esquerdo e direito (LMCC e RMCC, respectivamente) no gânglio cerebral e (B) R2 no gânglio abdominal e LPl1 no gânglio pleural. As células são circuladas para aumentar a visibilidade. Gráficos de calibração linear para (C) m¹A e (D) Φ (triângulos) usados para interpolação de quantidades nucleosídeos modificadas em células únicas (pontos coloridos). Os pares celulares de cada animal são rotulados de 1-3. (E) Concentrações intracelulares de cinco nucleosídeos modificados em pares de células MCC e R2/LPl1. Linhas grossas conectam pares de células. *p < 0,05, **p < 0,005, teste t emparelhado com correção de Bonferroni-Holm, n = 2 animais (quatro células no total) para MCCs e n = 3 animais (seis células no total) para R2/LPl1. Este número foi modificado de²⁹. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Modificação de RNA	Abreviação	Ordem de eluição (C18)	m/z para EIC	m/z para MS2
dihidrouridina	D	1	247.09	115
pseudouridina	Y	2	245.08	209/179/155
3-metilcytidina	m3C	3	258.11	126
N1-metiladenosina	m1A	4	282.12	150
5-metilcytidina	m5C	5	258.11	126
N7-metilguanosina	m7G	6	298.12	166
2'-O-metilcytidina	Centímetro	7	258.11	112
Inosina	I6A	8	269.09	137
2'-O-metilguanosina	Grão-mestre	9	298.12	152
N2-metilguanosina	m2G	10	298.12	166
N2,N2, N7-trimethylguanosine	m227G	11	326.15	194
N2,N2,-dimetilguanosina	m22G	12	312.13	180
2'-O-metiladenosina	Sou	13	282.12	136
N6-metiladenosina	m6A	14	282.12	150
N6,N6-dimetiladenosina	m66A	15	296.14	164
N6-isopentenyladenosine	i6A	16	336.17	204/136/148

Tabela 1: Modificações de RNA detectadas em neurônios únicos de A. californica. Os atributos para caracterização de nucleosídeos modificados são fornecidos, incluindo a ordem de retenção de LC, m/z para geração de EICs e fragmentos de CID correspondentes.

Discussion

O SNRMA-MS aproveita uma abordagem otimizada de preparação de amostras, resultando em um pequeno volume de amostra compatível com MS que pode ser entregue à plataforma LC-MS. O pré-tratamento enzimático inicial do gânglios cns dita tanto a facilidade com que eles podem ser desemsheathed quanto a durabilidade de neurônios únicos durante o isolamento. O gânglio cerebral muitas vezes requer tratamento enzimático prolongado devido à sua baáma relativamente espessa em comparação com os gânglios buccal, pleural e abdominal. Pesquisadores individuais que realizam os isolamentos de neurônios únicos podem ter preferências diferentes para o quão durável deve ser a bainha ao usar microscisores e fórceps finos. No entanto, é importante que os gânglios não sejam super digeridos, pois isso pode levar a uma perda em sua integridade estrutural, perda de informações posicionais que são fundamentais para a identificação de células-alvo e/ou lise celular. Após o isolamento do gânglio, é importante garantir que um volume mínimo de meio de isolamento seja aspirado ao transferir o neurônio para o tubo amostral. O meio ASW contém uma alta concentração de sais que podem interferir com enzimas digestivas durante a hidrólise de RNA e também diluirá a amostra.

Durante a etapa de lise mecânica, é comum que neurônios grandes (> 250 μm de diâmetro) se rompam ao passar repetidamente por uma micropipette. Neurônios menores podem exigir atenção adicional para garantir a lise celular, que normalmente envolve pressionar um capilar de vidro na célula. Neste caso, é possível que um volume parcial do tampão amostral seja atraído para o capilar por causa das forças capilares. Este volume pode ser entregue de volta no tubo de amostra, aplicando pressão na extremidade do capilar de vidro para garantir que nenhuma amostra seja perdida.

Os melhores resultados são obtidos por meio da inclusão de uma etapa de aquecimento antes da adição de enzimas para digestão de RNA. Isso é provável porque o aquecimento a 95 °C denatura estruturas secundárias de RNA que podem impedir a atividade de RNases³⁵ e diminuir a quantidade de nucleosídeos liberados de biopolímeros de RNA. Experimentos de controle usando amostras cravadas com metionina estável com isótopo foram previamente realizados para investigar se artefatos de modificação de RNA induzidos pelo calor foram a causa do aumento das áreas de pico observadas para modificações de RNA em relação a um protocolo SNRMA-MS^{sem calor 29}. Não foi observada tal rotulagem, indicando que os sinais melhorados para modificações de RNA utilizando o método otimizado SNRMA-MS foram devido à digestão superior do RNA.

Os métodos convencionais para isolar o RNA total das células envolvem extração líquido-líquido (LLE) com fenol-clorofórmio e subsequente precipitação de RNA, lavagem e resuspensão. Essas abordagens têm se mostrado úteis para experimentos de reação em cadeia de transcrição reversa onde a expressão de genes selecionados pode ser facilmente monitorada em neurônios A. californica identificados ^36,37. No entanto, os métodos LLE não podem recuperar RNA suficiente para a detecção de ribonucleosídeos modificados por LC-MS, enquanto o método SNRMA-MS descrito aqui permite a detecção de numerosas modificações^{de RNA 29}. Para avaliar os perfis de modificação de tipos específicos de RNA (por exemplo, rRNA, tRNA, mRNA) em amostras de tecido/célula a granel, extração de fase sólida de troca de^{íons 24}, enriquecimento baseado em sonda de hibridização³⁸ e fracionamento cromatográfico³⁹ abordagens foram aplicadas, mas métodos semelhantes ainda não estão disponíveis para purificação de RNA unicelular. O desenvolvimento de abordagens de fracionamento de RNA capazes de isolar tipos específicos de RNA de células únicas forneceria insights adicionais para a função das modificações de RNA.

O SNRMA-MS revelou anteriormente heterogeneidade não caracterizada na paisagem de modificação do RNA de neurônios únicos em A. californica e é concebível que perfis de PTM similarmente distintos existam entre células de mamíferos. Como as células mamíferas são relativamente pequenas em comparação com os grandes neurônios A. californica analisados neste protocolo, melhorias no manuseio de pequenos volumes amostrais são necessárias para facilitar limites de detecção mais baixos. Embora atualmente o SNRMA-MS esteja limitado a volumes de ~5 μL, espera-se que melhorias substanciais possam ser alcançadas incorporando dispositivos de manuseio líquido microfluido no fluxo de trabalho. Além disso, a implementação de isolamentos celulares automatizados ou semi-automatizados aumentaria o rendimento da amostra e permitiria a análise de modificação de RNA unicelular de populações celulares maiores. Ao interagir com as separações de LC de nanofluxo²⁷, a caracterização de marcas epitranscriptômicas em células ainda menores será alcançável.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animais
Aplysia californica	National Resource for Aplysia (Miami, FL)		150– 250 g (adulto)
Equipamento de bancada
Extrator capilar de vidro	Sutter	P-97
Milli-Q	Millipore
para tubos de PCR	LW Microscópio	científico ZS-1
	Zeiss	Stemi 2000C
Termociclador	Techne	EW-93945-01
HPLC coluna e consumíveis
Acclaim RSLC 120 C18	Thermo Scientific	71399
Frascos de amostrador automático	Thermo Scientific	C4011-13
LC e MS Instrumentation and Software
Software de análise de dados 4,4	Bruker
Dionex Ultimate 3000 nanoLC	Thermo Scientific		Equipado com o desgaseificador em linha, o amostrador automático, e o compartimento termostatizado da coluna
Espectrómetro de massa do impacto HD UHR QqTOF	Bruker		Equipado com a fonte de ESI
RStudio	RStudio
Ferramentas de microdissecação
Microtesoura vannas extra finas 3,5"	Roboz	RS-5640
Agulhas de tungstênio	Roboz	RS-6065
Reagentes/Materiais
4- (2-hidroxietil)-1-piperazineetano-ácido sulfônico (HEPES)	Fisher Scientific	H3375
Fosfatase alcalina	Worthington Biochemical Corp.
Acetato de amônio	Honeywell	17836
Benzonase (endonuclease de S. marcescens)	EMD Millipore	70746-4
Albumina de soro bovino	Sigma-Aldrich	A2153
Cloreto de cálcio	Sigma-Aldrich	C4901
Sulfato de gentamicina	Fisher Scientific	G1264
Cloreto	de magnésio Sigma-Aldrich	M9272
Sulfato	de magnésio Sigma-Aldrich	208094
Nucleosídeos mistura de teste	Sigma-Aldrich	47310-U
Penicilina G	Sigma-Aldrich	P7794
Pentostatina	Sigma-Aldrich	SML0508
Fosfodiesterase I	Worthington Bioquímica Corp.
Protease tipo XIV de Streptomyces griseus	Sigma-Aldrich	P5147
Cloreto de sódio	Sigma-Aldrich	S9888
Capilares de vidro padrão	A-M Systems	626000	1 mm o.d., 0,5 mm i.d., 4 in
Sulfato de estreptomicina	Sigma-Aldrich	S9137