Uma abordagem fotodinâmica no estudo da função da ruptura de vesículas intracelulares

Resumo

A inativação a laser assistida por cromóforos (CALI) mediada por AlPcS_2a é uma ferramenta poderosa para estudar danos espaço-temporais de vesículas intracelulares (IVs) em células vivas.

Resumo

As vesículas intracelulares (IVs) são formadas através da endocitose das vesículas no citoplasma. A formação IV está envolvida na ativação de várias vias de sinal através da permeabilização das membranas IV e da formação de endossomos e lisossomos. Um método denominado inativação a laser assistida por cromóforos (CALI) é aplicado para estudar a formação de IVs e os materiais no controle da regulação de IV. CALI é uma metodologia fotodinâmica baseada em imagens para estudar a via de sinalização induzida pela permeabilização da membrana. O método permite a manipulação espaço-temporal da organela selecionada para ser permeabilizada em uma célula. O método CALI tem sido aplicado para observar e monitorar moléculas específicas através da permeabilização de endossomos e lisossomos. Sabe-se que a ruptura da membrana dos IVs recruta seletivamente proteínas ligadoras de glicanos, como a galectina-3. Aqui, o protocolo descreve a indução de ruptura IV por AlPcS_2a e o uso de galectina-3 como marcador para marcar lisossomos comprometidos, o que é útil no estudo dos efeitos a jusante da ruptura da membrana IV e seus efeitos a jusante em várias situações.

Introdução

Os endossomos, um tipo de vesícula intracelular (IV), são formados pela endocitose e depois amadurecem em lisossomos. Várias vias de sinal intracelular estão envolvidas na formação de IVs; além disso, diferentes estímulos intrínsecos e extrínsecos podem danificar IVs (por exemplo, patógenos podem escapar da membrana limitada durante a infecção e entrar no citoplasma¹). Geralmente é acompanhada de ruptura de vesículas endocitóticas². Portanto, as técnicas de direcionamento e lesão de IVs podem ser utilizadas em estudos^{relacionados3}.

A terapia fotodinâmica (TFD) é uma terapia fotodependente para combater doenças matando tumores ou patógenos⁴. Na TFD, as células-alvo são marcadas com cromóforos atóxicos, denominados fotossensibilizadores, que podem ser ativados localmente pela iluminação luminosa ^5,6. Os fotossensibilizadores absorvem a energia da luz e se transformam em um estado singlete excitado, levando ao estado trigêmeo excitado de longa duração. Os fotossensibilizadores do estado triplete podem sofrer transferência eletrônica ou de energia e formar espécies reativas de oxigênio (EROs) na presença de oxigênio, podendo destruir espacialmente células marcadas dentro da região de iluminação⁷. A consequência varia de acordo com a potência da luz⁸. Controlando a concentração de fotossensibilizadores e a intensidade da iluminação luminosa, biomoléculas alvo podem ser seletivamente inativadas sem lise celular, denominada inativação luminosa assistida por cromóforos (CALI)⁹. Com o significativo desenvolvimento de fotossensibilizadores que podem marcar seletivamente vários alvos subcelulares, o CALI tornou-se uma ferramenta valiosa para controlar a inativação mediada pela luz de biomoléculas para pequenas biomoléculas, como nucleotídeos e proteínas, bem como organelas, como mitocôndrias e endolisossomos3,10,11,12,13.

Comparado ao CALI, métodos químicos ou físicos também são utilizados para prejudicar as membranas, como a toxina bacteriana ^14,15 e o tratamento com Leu-Leu-OMe¹⁶ para danos lisossômicos. No entanto, esses métodos mostram comprometimento em massa de IVs dentro das células. Fotossensibilizadores robustos (i.e., ácido dissulfônico de cloreto de ftalocianina Al(III) (AlPcS_2a)) são usados em CALI; O AlPcS_2a, que tem como alvo os lisossomos através da endocitose, é usado para romper endossomos ou lisossomos em uma região controlada¹⁷. AlPcS_2a é um cromóforo à base de ftalocianina impermeável à membrana celular que se liga a lipídios na membrana plasmática e é internalizado através de endocitose e eventualmente se acumula dentro do lisossomo através da via endocítica¹⁸. Ele absorve luz dentro de uma região espectral no infravermelho próximo e gera oxigênio singlete, uma das principais ROS geradas pelo AlPcS_2a¹⁸ excitado. O decaimento do oxigênio singlete limita rapidamente sua difusão e distância de reação dentro de uma minúscula região das células (aproximadamente 10-20 nm)¹⁹. Ao ajustar a duração da incubação do AlPcS_2a e a iluminação da luz, é permitido o controle espaço-temporal do dano de IVs dentro de uma área subcelular. O CALI torna-se, portanto, uma ferramenta poderosa para examinar as consequências dos danos IV, e a formação e regulação dos IVs.

Neste estudo, um protocolo específico de CALI usando AlPcS_2a como fotossensibilizador é abordado. Este protocolo pode ser aplicado a vários tipos de IVs, incluindo endossomos e lisossomos, e usado para examinar as respostas de seguimento após a ruptura da membrana. Células HeLa expressando galectina-3 conjugada com fluoróforo^16,20 reveladas após ruptura do lisossomo são utilizadas para demonstrar este protocolo.

Protocolo

1. Preparação de estoque AlPcS_2a

1. Dissolver 10 mg de AlPcS_2a em 400 μL de NaOH 0,1 M. Para melhorar a solubilidade, aqueça a solução a 50 °C e vórtice.
2. Misturar a solução com 4 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em seguida, filtrar a solução com um filtro de 0,22 μm para remover os precipitados insolúveis.
3. Medir a concentração da solução através de um espectrofotômetro UV-Vis. O coeficiente de extinção de AlPcS_2a a 672 nm é de 4 x 10⁴ cm-1 ^M-1. Diluir a solução de AlPcS_2a com PBS para fazer uma solução de 1 mM. Fazer alíquotas de 1 ml e conservar a -20 °C.

2. Transfecção

NOTA: Gal3-GFP é aplicado como um indicador para imagens de células vivas de ruptura lisossômica.

1. Manter cultura de células HeLa em DMEM suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (SFB). Depois de lavar as células com PBS, tripsinize as células e, em seguida, ressuspenda as células em DMEM suplementado com FBS a 10%.
   Observação : O método é aplicável para a maioria das linhas de célula anexadas, incluindo linhas de célula HeLa e A549. Em princípio, apesar de não testar células de suspensão, ensaios de CALI poderiam ser realizados com elas.
2. Diluir 300 ng do plasmídeo Gal3-GFP em 25 μL de meio sérico reduzido e, em seguida, adicionar 0,6 μL do reagente P3000. Misture delicadamente. Diluir 0,45 μL do reagente Lipofectamina 3000 em 25 μL de meio sérico reduzido. Misture delicadamente.
3. Incubar durante 5 minutos à temperatura ambiente. Misturar o ADN diluído e a Lipofectamina 3000 diluída e, em seguida, incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.
4. Misture a mistura DNA-Lipofectamina, 3 x 10⁵ células HeLa suspensas e 200 μL de DMEM+10% FBS e, em seguida, semeie as células na região central de vidro de uma placa de botão de vidro de 35 mm.

3. Coloração de AlPcS2a

1. Para permitir a fixação celular, incubar as células a 37 °C na incubadora fornecida com 5% de CO₂ durante pelo menos 4 horas.
2. Diluir AlPcS 2a em DMEM suplementado com 10% FBS para fazer uma solução de AlPcS_2a de 1 μM. Pré-aqueça o meio contendo AlPcS_2a em banho-maria a 37 °C. Substitua o meio de cultura pelo meio contendo AlPcS_2a.
3. Incubar as células a 37 °C na incubadora abastecida com 5% de CO₂ durante a noite (16-18 h).
4. No dia seguinte, lave as células duas vezes com PBS para remover AlPcS2a extracelular. Substitua o meio por meio fresco e, em seguida, incube a 37 °C durante 4 h para permitir que o corante residual ao longo da via endocítica se acumule nos lisossomas.
   NOTA: Para corar endossomos, incubar as células em 1 μM de AlPcS_2a em DMEM contendo 10% de SFB por 15 min a 37 °C. Em seguida, lave as células duas vezes com PBS e incube-as em meio pré-aquecido antes da obtenção de imagens.

Gráfico 1. Figura esquemática representando o dano IV seletivo com AlPcS_2a. A figura mostra os esquemas de dano IV seletivo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Gráfico 2. Coloração lisossômica com AlPcS2a. Lisossomos marcados durante a noite com 1 μM de AlPcS_2a em células HeLa são positivamente corados com corante fluorescente verde 50 nM. Barra de escala: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Imagem da amostra e iluminação da luz

NOTA: Danos IV dentro de uma região subcelular de uma única célula ou todas as células marcadas com AlPcS_2a em uma placa de cultura podem ser realizados. A iluminação em massa de toda a placa de cultura permite o estudo quantitativo deste dano, incluindo estudos bioquímicos.

1. Manipular células únicas, danificando lisossomos dentro de uma única célula, conforme descrito abaixo.
   1. Coloque a placa de cultura no palco de um microscópio confocal. Use os lasers de 488 nm e 561 nm para excitar GFP e AlPcS2a, respectivamente.
   2. Circule uma região de interesse (ROI) de 5 x 5 μm² nas vesículas marcadas com AlPcS_2a selecionadas para serem danificadas.
   3. Pulso iluminar a ROI com um laser de 633 nm de 0,21 mW para 70 repetições. Monitorar a formação de pontos de Gal3 como um indicador de permeabilização da membrana lisossomal.
2. Danificar todas as células marcadas em uma placa de cultura, conforme descrito abaixo.
   1. Coloque o prato da cultura em uma plataforma. Ilumine o prato com 660 nm de luz LED colimada (a luz infravermelha próxima é a base ideal no espectro de excitação de AlPcS2a).
   2. Colocar a placa de cultura no microscópio e monitorar os indicadores de permeabilização da membrana, conforme mencionado no passo 4.1.3.
3. Avalie a lesão de IVs usando os seguintes indicadores.
   1. O conteúdo do endossomo ou lisossomo é mais altamente glicosilado, que são expostos ao citosol após a ruptura IV. Rotulá-los rapidamente usando galectinas citosólicas ligantes de glicanos, incluindo galectina-1, galectina-3, galectina-8 e galectina-9^16,20.
   2. O tamanho da ferida pode ser determinado pela liberação de corante impermeável à membrana, conforme descrito em²¹.
   3. A diferença entre endossomos e lisossomos é o seu valor de pH luminal. A ruptura lisossômica perturba o pH luminal, que pode ser medido usando corante sensível ao pH, como o FITC-dextran³.

Gráfico 3. O CALI mediado por AlPcS_2a induz o recrutamento local de TagRFP-galectina-3 (Gal3) para os lisossomos dentro da região de iluminação. Os lisossomos em células HeLa expressas por TagRFP-galectina-3 foram corados durante a noite com 1 μM de AlPcS_2a, seguido de iluminação focalizada com luz infravermelha próxima (633 nm) dentro do quadrado amarelo. O sinal de AlPcS_2a dentro do quadrado amarelo é fotobranqueado, acompanhado pela formação de puncta de TagRFP-galectina-3. Barra de escala: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

Uma figura esquemática representando o dano IV induzido por AlPcS_2a, incluindo endossomo e lisossomo, foi mostrada (Figura 1).

Marcadores disponíveis comercialmente podem ser usados para determinar as condições de coloração de AlPcS_2a . Por exemplo, a colocalização de AlPcS_2a puncta e corante verde^{fluorescente 22} (Figura 2).

A galectina-3 marcada com ...

Discussão

AlPcS_2a liga-se à membrana plasmática, em seguida, é internalizado por endocitose e eventualmente se acumula em lisossomos. AlPcS_2a pode, assim, ser localizado nos compartimentos subcelulares ajustando a duração da incubação. Uma limitação dessa metodologia é que apenas uma subpopulação de IVs poderia ser marcada por AlPcS_2a através de endocitose, pois existem muitas outras fontes de IV de membrana, como RE e aparelho de Golgi. Além disso, a marcação seletiva de AlPcS_2a em endo...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagente
Al(III) Cloreto de ftalocianina Ácido dissulfônico (AlPcS2a)	Frontier Scientific	P40632
Placa de cultura	ibidi	812128-200
Meio de cultura			DMEM suplementado com 10% de FBS e 100 U/mL de penicilina G e 100 mg/mL de estreptomicina
DMEM	Gibco	11965092
FBS	Thermo Fisher Scientific	A4736301
Gal3-GFP plasmídeo	addgene
Lipofectamine 3000 kit	Thermo Fisher Scientific	L3000008
LysoTracker Verde DND-26	Thermo Fisher Scientific	L7526	corante fluorescente verde
Placa multifoliada	perkinelmer	PK-6005550
NaOH	Thermo Fisher Scientific	Q15895
OptiMEM	Thermo Fisher Scientific	31985070
Penicilina-estreptomicina	Gibco	15140163
salina tamponada com fosfato (PBS)	Gibco	21600-069	137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4
Linha celular
Linha Celular HeLa	ATCC	CCL-2	Os métodos são aplicáveis à maioria das linhas celulares anexadas. As condições devem ser determinadas individualmente.
Equipments
0.22 µ m Filtro	Merck	SLGV013SL
Luz LED Colimada  (660nm)	Thorlabs	M660L3-C1 e DC2100	é a base ideal no espectro de excitação de AlPcS2a.
Microscopia confocal	Carl Zeiss	LSM 780	É necessário um sistema de incubação para imagens de longo prazo.
NanoDrop 2000/2000c Espectrofotômetros	Thermo Fisher Scientific Vermelho
LED luz	Tholabs	M660L4-C1