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Artigo de método

Fabricação de Microesferas Porosas Altamente Abertas (HOPMs) via Tecnologia Microfluídica

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DOI:

10.3791/63971

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16 de maio de 2022

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Biomaterials and Tissue Engineering, Huaqiao University, 2Fujian Provincial Key Laboratory of Biochemical Technology, Huaqiao University, 3Affiliated Dongguan Hospital, Southern Medical University, 4Division of Engineering in Medicine, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

Neste artigo

Resumo

O presente protocolo descreve a fabricação de microesferas porosas altamente abertas (HOPMs) à base de poli(ácido lático-co-glicólico) através da tecnologia microfluídica fácil baseada em formulação de emulsão única. Essas microesferas têm aplicações potenciais em engenharia de tecidos e triagem de medicamentos.

Resumo

Em comparação com andaimes a granel e injeção direta de células sozinhas, as unidades modulares injetáveis atraíram enorme interesse em reparar tecidos com defeito devido à conveniência na embalagem das células, melhor retenção de células e invasividade mínima. Além disso, a conformação porosa desses portadores de microescala poderia aumentar a troca de meios e melhorar o nível de nutrientes e suprimentos de oxigênio. O presente estudo ilustra a fabricação conveniente de microesferas porosas altamente abertas à base de poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA-HOPMs) pela tecnologia microfluídica fácil para aplicações de entrega celular. Os PLGA-HOPMs monodispersos resultantes possuíam tamanhos de partículas de ~400 μm e poros abertos de ~50 μm com janelas interligadas. Resumidamente, as gotículas de óleo emulsionadas (solução PLGA em diclorometano, DCM), envoltas com a fase aquosa gelatinosa a 7,5% (p/v), foram introduzidas na solução aquosa de poli(álcool vinílico) (PVA) de fluxo contínuo a 1% (p/v) através do bocal coaxial na configuração microfluídica personalizada. Posteriormente, as microesferas foram submetidas a procedimentos de extração e liofilização com solvente, resultando na produção de HOPMs. Notavelmente, várias formulações (concentrações de PLGA e porogênio) e parâmetros de processamento (potência emulsificante, medidor de agulha e taxa de fluxo de fase dispersa) desempenham papéis cruciais nas qualidades e características dos HOPMs PLGA resultantes. Além disso, essas arquiteturas podem potencialmente encapsular várias outras pistas bioquímicas, como fatores de crescimento, para a descoberta prolongada de medicamentos e aplicações de regeneração de tecidos.

Introdução

Microesferas carregadas de células oferecem vantagens favoráveis, como maior capacidade de retenção celular in situ, entrega eficiente de células e subsequente capacidade de proliferação celular in vivo1. Até o momento, inúmeras investigações foram apresentadas para o desenvolvimento de uma estrutura de andaimes bem-sucedida para suportar um ambiente propício para células para regeneração tecidual ou aplicações de triagem de drogas2. No entanto, o ambiente de hipóxia é muitas vezes inevitável no interior devido ao fornecimento insuficiente de nutrientes/oxigênio e acúmulo de resíduos metabólicos3. Para superar esses problemas, microesferas (MPs) altamente porosas têm sido desenvolvidas utilizando diversos biomateriais 4,5,6. Além disso, em cultura dinâmica, os andaimes sofrem de tensão de cisalhamento excessiva7, e o estado instável do meio de cultura pode quebrar a fidelidade dos PMs. Alternativamente, o poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA) poderia ser usado para processar PMs com boa resistência mecânica para cultura dinâmica1. Por exemplo, demonstramos a co-injeção de microbastonetes ocos de poli(etilenoglicol) carregados de PLGA carregados de mioblastos (C2C12) de camundongos e microbastonetes ocos de poli(etilenoglicol) carregados de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) para curar a perda muscular volumétrica, alcançando notável melhora da regeneração muscular esquelética in situ 8.

Notavelmente, os PMs são caracterizados por grandes áreas superficiais e altas porosidades, o que é de interesse específico para a adesão e crescimento celular para a entrega celular minimamente invasiva9. Diante desses aspectos, diversos materiais biocompatíveis têm sido empregados para a fabricação dos MPs10,11. Esses PMs projetáveis cocultivados com células oferecem excelente aderência, considerável resistência mecânica e janelas altamente interconectadas, o que poderia melhorar a proliferação celular para reparar tecidos danificados12. Nesse sentido, diversas tecnologias também têm sido desenvolvidas para fabricar esferas porosas13,14. Por um lado, os PMs foram produzidos por meio de agentes formadores de gás, como o NH4HCO3, que foram contidos devido à insuficiente interconectividade15,16,17. Por outro lado, os PMs foram tosquiados diretamente após a emulsificação, o que levou a PMs polidispersos18. No final, a tecnologia microfluídica de gotículas baseada na abordagem de modelagem de emulsão talvez seja um método eficiente para a construção de PMs, pois muitas vezes resulta em partículas de tamanho uniforme19. Notavelmente, os atributos morfológicos das microesferas muitas vezes dependem da qualidade das gotículas de emulsão geradas (ou seja, água em óleo, W/O ou óleo em água, O/W), o que pode afetar significativamente os atributos dos biomateriais20. Vale a pena notar que a plataforma microfluídica pré-projetada pode ser aplicada para gerar as microfibras ou microesferas. Em um exemplo, Yu et al. demonstraram a produção de estruturas microfibrosas carregadas de células baseadas em plataformas microfluídicas baseadas em capilares, que poderiam ser usadas para montar redes celulares para imitar tecidos naturais21. Em outro caso, Ye et al. fabricaram microcápsulas de cristal fotônico pela replicação de molde de esferas de cristal coloidal de sílica por meio de tecnologias microfluídicas, o que poderia superar muitas limitações das técnicas atuais que requerem rotulagem complexa e aparelhos específicos22.

De fato, a lógica por trás da utilização dessa técnica se deve a várias vantagens, como ser fácil por natureza, não exigir equipamentos sofisticados e sua conveniência na síntese de PMs de tamanho uniforme para entrega celular e aplicações de medicina regenerativa. Neste contexto, com componentes pré-projetados de emulsão-modelagem, PMs com altas porosidades e interconectividade podem ser convenientemente obtidos a partir de um dispositivo microfluídico montado a partir de tubos de poli(cloreto de vinila) (PVC), um capilar de vidro e uma agulha. Uma emulsão-precursora de W/O é preparada homogeneizando uma solução aquosa de gelatina e uma solução orgânica de PLGA. Ao injetar seletivamente a porção aplicável da emulsão na plataforma microfluídica, os PMs com tamanhos de partículas uniformes e poros interconectados em toda a superfície para o interior são fabricados. O presente protocolo tem como objetivo fabricar os PLGA-HOPMs por emulsão-modelagem na plataforma microfluídica. Acredita-se que este protocolo permite a produção reprodutível de PLGA-HOPMs e será potencialmente aplicável em seus campos relacionados de engenharia de tecidos e triagem de medicamentos.

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Protocolo

1. Preparação de soluções

  1. Preparar a solução-mãe de PVA com antecedência, aquecendo a solução de PVA em banho-maria a 80 °C e, subsequentemente, colocando-a no frigorífico a 4 °C. Arrefecer até à temperatura ambiente (RT) para utilização experimental.
  2. Preparar o precursor da emulsão adicionando a solução aquosa de gelatina (1 ml, 7,5%, p/v) à fase orgânica do PLGA (2 ml, 2%, p/v em diclorometano, DCM) (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: Geralmente, a tecnologia microfluídica envolve diferentes fases para formar as microesferas. A fase contínua ou coletora compreende um poli(álcool vinílico) aquoso (PVA, 600 mL, 1%, p/v).

2. Montagem de dispositivos microfluídicos de gotículas e fabricação de PLGA-HOPMs

Observação : os itens consumíveis necessários para esta montagem estão listados na tabela de materiais.

  1. Personalize o conjunto do gerador de gotas.
    1. Construa um gerador microfluídico de co-fluxo usando um capilar de vidro (OD, 1 mm), tubos de PVC (ID, 1 mm) e uma agulha de dosagem de 26 G.
    2. Conecte o capilar de vidro à extremidade do tubo de PVC e, em seguida, perfure com uma agulha na conexão da estrutura acima.
    3. Coloque a outra extremidade do tubo de PVC na fase contínua durante a geração de gotículas. Usando cola UV, sele as lacunas na articulação após a cura.
      NOTA: A agulha precisa ser dobrada curvada cerca de 45° para uma perfuração conveniente no tubo de PVC, e o ponto da agulha esticado no tubo capilar para formar a estrutura coaxial.
  2. Prepare a plataforma microfluídica da gota.
    1. Use duas bombas de seringa, como mostra a Figura 1. Use uma seringa de 50 mL para carregar a fase contínua e uma seringa de 5 mL para formação de emulsão.
    2. Defina as taxas de fluxo das fases contínua e de dispersão em 2 mL/min e 0,08 mL/min, respectivamente.
    3. Colocar um copo de 500 ml num banho de gelo e enchê-lo com uma solução aquosa de PVA pré-arrefecida (passo 1.1).
      NOTA: A extremidade do capilar de vidro deve ser imersa na fase de coleta. Sugere-se agitar (1 h, 60 rpm) o sobrenadante da fase coletora com a haste de vidro após a formação de emulsão-gotículas na plataforma. As gotículas de emulsão são produzidas na ponta do ponto da agulha. Em geral, o calibre da agulha influencia o tamanho dos PMs, em que o menor calibre corresponde ao menor tamanho dos PMs. Além disso, o diâmetro dos poros está correlacionado principalmente com a concentração de porógenos, capaz de aumentar com a concentração adequada de gelatina1.
  3. Realizar a emulsificação e geração de gotículas.
    1. Prepare a emulsão seguindo as etapas abaixo.
      1. Preparar a emulsão decantando imediatamente a solução aquosa de gelatina na solução DCM de PLGA (passo 1.2) e emulsionando utilizando o dispositivo ultra-sónico (ver Tabela de Materiais).
      2. Ajuste a potência ultra-sônica para 400 W e defina o tempo total de processamento como 90 s (intervalo 2 s, tratamento ultrassônico 1 s), acompanhado pela mudança constante da posição da sonda manualmente.
      3. Estabilize a emulsão resultante para sucção de seringas e geração de gotículas em aproximadamente 20 min.
        NOTA: Coloque a sonda do disjuntor de células ultra-sônico na interface óleo-água. Sugere-se não deixar a sonda ultra-sônica entrar em contato com o recipiente.
    2. Execute a geração de gotículas.
      1. Carregar a emulsão preparada (passo 2.3.1) rapidamente na seringa de 5 ml da plataforma microfluídica após tratamento ultra-sónico.
      2. Introduza a emulsão de W/O instável (que está no curso da separação de fase) no dispositivo microfluídico como a fase descontínua. Ao mesmo tempo, use a solução aquosa de PVA como a fase contínua.
      3. Recolher as microesferas que contêm a emulsão no fundo do copo coletor (PVA, 1%, p/v) depois de injetar porções adequadas da emulsão no dispositivo microfluídico.
      4. Colocar a amostra a 4 °C durante a noite para uma maior estabilização.
    3. Enxaguar e liofilizar as microesferas preparadas (PLGA-HOPMs) seguindo os passos abaixo.
      NOTA: Os PLGA-HOPMs gerados contêm poros arbitrários no interior e na superfície.
      1. Conservar as microesferas a 4 °C antes de normalizar para RT e agitar por uma haste de vidro (1 h, 60 rpm) para eliminar o DCM residual.
      2. Filtre cuidadosamente a fase de coleta no copo de 500 mL e lave as microesferas coletadas três vezes com água deionizada para lavar o PVA residual na superfície dos PMs.
      3. Colocar as microesferas PLGA em banho-maria a 37 °C durante 30 minutos para dissolver a gelatina envolta na espinha dorsal do PLGA.
      4. Enxaguar os PLGA-HOPMs resultantes duas vezes com a água desionizada para remover a gelatina residual e pré-resfriar para liofilização a -80 °C por 24 h.
      5. Conservar os PLGA-HOPMs secos a -20 °C para experiências complementares.

3. Imagem do microscópio eletrônico de varredura (MEV)

  1. Depositar PLGA-HOPMs no estádio de amostra de MEV (ver Tabela de Materiais) no RT e colocar o estádio de amostra na célula de pulverização do sputter magnetron. Ligue o transformador e o magnetron um por um. Introduza a amostra no MEV depois de ser revestida com ouro por 1 min.
  2. Obtenha as imagens de MEV ajustando a tensão de aceleração em 5 kV.
  3. Além disso, quantifique o tamanho das partículas de PLGA-HOPMs usando 100 PMs no campo variável de imagem de MEV. Meça o resultado representativo para quantificar a distribuição do tamanho dos poros.
    1. Abra os gráficos com a Imagem J e use a "linha reta" para corresponder à barra de escala da imagem SEM, o que faz com que o software identifique o pixel até o comprimento.
    2. Clique em analisar > escala definida, defina a "distância conhecida" para a barra de escala da imagem SEM e clique em > global OK.
    3. Clique em analisar > Ferramentas > gerenciador de ROI ... para medir o tamanho do poro ou partícula dos PMs PLGA e clique em adicioná-lo. Meça o número de amostras com base no requisito.
    4. Clique em Medir para obter os dados quantitativos dos gráficos para um cálculo mais aprofundado.

4. Cultura celular e imagem de fluorescência

NOTA: Células-tronco mesenquimais da medula óssea de ratos (BMSCs) foram utilizadas para o presente trabalho. As células foram obtidas de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais).

  1. Cultivar as células em meio Eagle modificado de Dulbecco suplementado com L-glutamina (DMEM/F-12), soro fetal bovino a 10% (v/v) e 1% de penicilina/estreptomicina. Incubar as células a 37 °C e 5% de CO2.
  2. Passar os BMSCs de ratos em uma proporção de 1:2 após atingir 90% de confluência.
  3. Execute a adesão celular seguindo as etapas abaixo.
    1. Incubar os PLGA-HOPMs com álcool etílico (5 mL, 70%, v/v) e centrifugar a 500 x g por 10 min no RT para esterilização.
    2. Lave os PLGA-HOPMs esterilizados duas vezes com solução tampão fosfato.
    3. Incubar os HOPMs (cinco em número) com a suspensão celular (5 mL, 1 x 105 células/mL) em tubo centrífugo estéril (50 mL) sob cultura dinâmica para adesão de BMSCs a PLGA-HOPMs.
    4. Realizar a cultura dinâmica em um agitador asséptico termostático (37 °C, 90 rpm) colocando um tubo de centrífuga selado de 50 mL no agitador (ver Tabela de Materiais).
      NOTA: A cultura dinâmica pretende aumentar a taxa de aderência de BMSCs nos andaimes, em vez de incubar diretamente os PMs e células na placa de plástico. As células e os PMs PLGA são adicionados a um tubo de centrífuga estéril de 50 mL, incubando o tubo em um agitador asséptico termostático (37 °C, 90 rpm) e trocando o meio a cada 2 dias.
  4. Execute o ensaio de dupla mancha viva e morta.
    1. Enxaguar os PMs carregados de células três vezes para eluir BMSCs sem fixação a PLGA-HOPMs.
    2. Coloque os PMs carregados de células na placa de fundo de vidro de 35 mm. Adicionar 1 ml de tampão corante (ver Tabela de Materiais), incluindo 1 μL de calceína-AM e iodeto de propídio (PI), respetivamente, à amostra pré-lavada com PBS.
    3. Avaliar as amostras por microscopia confocal de varredura a laser (ver Tabela de Materiais). Ligue a luz de excitação de 488 nm e 552 nm no detector correspondente. Para a análise de sobreposição z, defina o z-wide para capturar as diferentes camadas da amostra pelo movimento do eixo z do microscópio.
      NOTA: Vale a pena notar que as outras manchas podem ser apropriadamente empregadas para análise.

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Resultados

Com base em trabalhos anteriores que otimizaram os principais parâmetros1, o PLGA foi dissolvido no solvente DCM evaporado. A emulsão primária de W/O foi preparada por homogeneização com gelatina sob tratamento com sonda ultrassônica. A estrutura fluídica de co-fluxo personalizada foi montada de forma simplista, na qual uma seringa foi empregada para introduzir os fluxos constantemente. Além disso, foram realizados procedimentos de enxágue suficientes para eliminar o PVA e a gelatina das microesfe...

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Discussão

Este artigo descreve uma estratégia eficiente para fabricar arquiteturas baseadas em PLGA, ou seja, os PLGA-HOPMs. Deve-se notar que várias etapas críticas devem ser tomadas com cuidado, incluindo evitar a volatilização do solvente do PLGA e o ajuste suave da potência ultra-sônica para a posição alvo durante a preparação da emulsão. Além disso, a saída líquida da seringa de 20 mL pode ser ajustada até certo ponto para resolver a separação de fases de precursores emulsionados. No entanto, uma limitação é que, uma vez que ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

SCL, YW, RKK e AZC reconhecem o apoio financeiro da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (NSFC, 32071323, 81971734 e U1605225) e do Programa para a Equipe de Pesquisa Inovadora em Ciência e Tecnologia na Universidade da Província de Fujian. A YSZ não foi apoiada por nenhum desses programas nem recebeu pagamento de qualquer tipo; em vez disso, o apoio do Brigham Research Institute é reconhecido.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo de centrífugaSolarbio, Pequim, China5 mL e 50 mL (esterilidade)
Microscopia confocal de varredura a laserLeica, Wetzlar, AlemanhaTCS SP8
DiclorometanoSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Xangai, China20161110Agulha
de distribuição deKindly, Xangai, China26 G, ID: 250 μ m, OD: 460 μ m
DMEM/F-12Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, EUA15400054DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's
Mod. De Eagle's Medium / Ham's F12
50/50 Mix) com L-glutamina
Álcool etílicoSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Xangai, China20210918Grau de pesquisa
Ácido etil-enodiaminotetracético (EDTA) -tripsinaIndústrias Biológicas, Kibbutz Beit-Haemek, IsraTripsina (0,25%), EDTA (0,02%)
Soro fetal bovino (FBS)Indústrias Biológicas, Kibbutz Beit-Haemek, Isragrau de pesquisa
Bilon, Xangai, ChinaFD-1B-50
GelatinaSigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, EUAlote # SZBF2870VDe pele suína, placa
inferior de vidroBiosharp, Hefei, ChinaBS-15-GJM, capilar de vidro de 35 mm
Huaou, Jiangsu, China0,9-1,1 e vezes; 120 mm
Agitador de incubadoraZhicheng, Xangai, ChinaZWYR-200D
Kit de imagem de células mortas vivasSolarbio, Pequim, China60421211112Fluorescência verde em células vivas (ex/em 488 nm/515 nm). Fluorescência vermelha em células mortas (ex/em 570 nm/602 nm)
Centrífuga de baixa velocidadeXiangyi, Hunan, ChinaTD5A
Magnetron sputterRiye electric Co. Ltd, Suzhou, ChinaMSP-2S
Bomba de injeção de microfluxoHarvard Apparatus, Holliston, EUAHarvard Pump 11 Plus
Penicilina-estreptomicinaBiological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra2135250Grau de Pesquisa
Fosfato tampolado salino (PBS)Servicebio Technology Co., Ltd. Wuhan, ChinaGP21090181556PBS 1x, grau de cultura, sem cálcio, sem magnésio
Poli (ácido lático-co< / em>-glicólico)Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, EUAlote # MKCF965166- 107 kDa, lactídeo:glicólido 75:25
Poli(álcool vinílico)Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, EUAlote# MKCK426613-13 kDa, 98% Tubo de PVC hidrolisado
Shenchen, Xangai, ChinaDiâmetro interno, ID: 1 mm
Células-tronco mesênquimas de medula óssea de ratoProcell, Wuhan, China
Microscópio eletrônico de varreduraPhenom pure, Eindhoven, HolandaDefina a tensão de aceleração em 5 kV
Syrine para fins médicosKindly, Shanghai, China5 mL e 50 mL (com a agulha)
Temperatura banho-mariaMingxiang, Shenzhen, China36 W
TransformadorRiye electric Co. Ltd, Suzhou, ChinaSZ-2KVA
Disjuntor de célula ultrassônicoJY 92-IID, Scientz, Ningbo, ChinaJY 92-IID
Cola de cura UVZhuolide, Foshan, ChinaD-3100
grau de pesquisa Liofilizador de tipo A

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