Os metabólitos microbianos derivados do intestino têm efeitos multifacetados, levando a um comportamento complexo em animais. Nosso objetivo é fornecer um método passo-a-passo para delinear os efeitos dos metabólitos microbianos derivados do intestino no cérebro através da entrega intracerebroventricular através de uma cânula guia.
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Artigo de método
Entrega intracerebroventricular de metabólitos microbianos derivados do intestino em camundongos em movimento livre
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O impacto da microbiota intestinal e seus metabólitos na fisiologia e no comportamento do hospedeiro tem sido extensivamente investigado nesta década. Numerosos estudos revelaram que os metabólitos derivados da microbiota intestinal modulam as funções fisiológicas mediadas pelo cérebro através de intrincadas vias intestino-cérebro no hospedeiro. Os ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) são os principais metabólitos derivados de bactérias produzidos durante a fermentação de fibras alimentares pelo microbioma intestinal. Os AGCCs secretados do intestino podem atuar em vários locais da periferia, afetando as respostas imunológicas, endócrinas e neurais devido à vasta distribuição de receptores SCFAs. Portanto, é um desafio diferenciar os efeitos centrais e periféricos dos AGCCs por meio da administração oral e intraperitoneal de AGCC. Este artigo apresenta um método baseado em vídeo para interrogar o papel funcional dos AGCCs no cérebro através de uma cânula guia em camundongos em movimento livre. A quantidade e o tipo de AGCCs no cérebro podem ser ajustados controlando o volume e a taxa de infusão. Este método pode fornecer aos cientistas uma maneira de apreciar o papel dos metabólitos derivados do intestino no cérebro.
Introdução
O trato gastrointestinal humano abriga diversos microrganismos que impactam o hospedeiro 1,2,3. Essas bactérias intestinais podem secretar metabólitos derivados do intestino durante a utilização de componentes dietéticos consumidos pelo hospedeiro 4,5. Curiosamente, os metabólitos intestinais não metabolizados na periferia podem ser transportados para outros órgãos via circulação6. Vale ressaltar que esses metabólitos secretados podem servir como mediadores para o eixo intestino-cérebr....
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Protocolo
Todos os protocolos experimentais e os cuidados com os animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Nacional de Cheng Kung (NCKU).
1. Preparação para o animal experimental
- Obtenha camundongos machos C57BL/6JNarl do tipo selvagem de 6 a 8 semanas de idade de um fornecedor.
- Coloque os ratos em uma gaiola de rato padrão com ração de rato padrão e água esterilizada ad libitum.
NOTA: As condições de alojamento para o Centro de Animais de Laboratório da NCKU são 22 ± temperatura de 1 °C, 55% ± 10% de umidade e um ciclo claro/escuro de 13 h/1....
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Resultados
O camundongo foi infundido com AGCCs 1 semana após a recuperação do implante da cânula-guia para avaliar a atividade locomotora em uma nova gaiola. O camundongo foi colocado em uma nova gaiola e infundido com 2.100 nL de AGCCs ou ACSF nos primeiros 5 minutos (taxa de entrega de 7 nL/s) no cérebro através da cânula guia comercial implantada no ventrículo lateral do cérebro. A atividade locomotora em uma nova gaiola foi registrada por mais 30 minutos após a infusão. Não foi observada diferença na atividade locomotora na no.......
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Discussão
Metabólitos derivados do intestino têm sido associados a doenças mediadas pelo cérebro sem muito mecanismo preciso, em parte devido aos seus múltiplos sítios de ligação no organismo 6,12,24. Relatos anteriores indicaram que os AGCCs poderiam servir como ligantes para receptores acoplados à proteína G, reguladores epigenéticos e fontes de produção de energia em múltiplos locais do organismo 6,12.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse relacionados a este trabalho.
Agradecimentos
Reconhecemos a equipe do Centro de Animais de Laboratório da Universidade Nacional de Cheng Kung (NCKU) por cuidar dos animais. Este trabalho foi apoiado pela bolsa de estudos do Prof. Kun-Yen Huang Education Fund da CHENG-HSING Medical Foundation para C.-W.L.; os fundos do Ministério da Ciência e Tecnologia (MOST) em Taiwan: (Iniciação Científica MOST 109-2813-C-006-095-B) para T.-H.Y.; (MAIS 107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3) a W.-L.W.; e o Projeto Sprout de Ensino Superior, do Ministério da Educação para a Sede do Avanço Universitário na NCKU para W.-L.W.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Material | |||
| Advil Liqui-Géis Solubilizado Ibuprofeno A2:D41 | Pfizer | n/a | |
| Alexa Fluor 488 burro anti-coelho | ThermoFisher Scientific | A-21206 | |
| Anti-Fluorescente Ouro (coelho policlonal) | Millipore | AB153-I | |
| , 500 mL, 0.22 μ m, PES, Estéril | NEST | 121921LA01 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | ACSF: 0,14 g/L |
| Clorexidina esfoliante 2% | Phoenix | NDC 57319-611-09 | |
| Solução de clorexidina | Phoenix | NDC 57319-599-09 | |
| Manequim comercial | RWD Life Science | 62004 | Single_OD 0,20 mm/ M3,5/G = 0,5 mm |
| Cânula guia comercial | RWD Life Science | 62104 | Single_OD 0,41 mm-27G/ M3,5/C = 2,5 mm |
| Injetor comercial | RWD Life Science | 62204 | Single_OD 0,21 mm-33G/ Combina com M3,5/C = 3,5 mm/G = 0,5 mm |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | ACSF: 0,61 g/L |
| Acrílico dental | HYGENIC | n/a | |
| Parafusos de fixação | RWD Life Science | 62521 | |
| Meio de montagem Fluoroshield com DAPI | Abcam | AB104139 | |
| Seringas | ThermoFisher Scientific | 16050130 | |
| Serum | para cavalos BBraun | XG-LBB-9151133S-1BX | 1 mL |
| Isoflurano | Panion & BF biotech | DG-4900-250D | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | ACSF: 0,19 g/L |
| Cetoprofeno | Swiss Pharmaceutical | n/a | |
| Lidocaína | AstraZeneca | n/a | |
| Baixo ponto de fusão agarose | Invitrogen | 16520 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | ACSF: 0,19 g/L |
| Lâminas de microscópio | MARIENFELD | 101242 | |
| Lâminas de microscópio | ThermoFisher Scientific | 4951PLUS-001E | |
| Óleo mineral leve, branco NF | Macron Fine Chemicals | MA-6358-04 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | ACSF: 7,46 g/L |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | ACSF: 0.18 g/L |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | ACSF: adesivo de 1,76 g/L |
| n-butil cianoacrilato (cola adesiva de tecido) | 3M | 1469SB | 3M Vetbond |
| Neural tracer | Santa Cruz | SC-358883 | |
| Paraformaldeído | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Tubo de polietileno | RWD Life Science | 62329 | OD 1.50, I.D 0.50 mm e OD 1.09, I.D 0.38 mm |
| Pomada Puralube Vet (olho) | Dechra | ||
| Acetato de sódio | Sigma-Aldrich | S2889 | SCFAs: 13.5 mM |
| Azida de sódio | Butirato de sódio Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sigma-Aldrich | B5887 | SCFAs: 8 mM | |
| Propionato de Sódio | SCFAs Sigma-Aldrich | P1880 | de 5,18 mM |
| Chun Ta empresa de aço inoxidável CO., LTD. | n/a | OD 0,63 mm; Fornecedor local | |
| Injetor de aço inoxidável | Chun Ta empresa de aço inoxidável CO., LTD. | n/a | OD 0,3 mm; manequim é feito de injetor; fornecedor local |
| Supercola | Krazy Cola | KG94548R | |
| Triton X-100 | Merck | 1.08603.1000 | |
| EquipamentoSuporte de | |||
| cânula | RWD Life Science | B485-68217 | |
| Câmera de teto | FOSCAM | R2 | |
| Instrumentos estereotáxicos digitais | Stoelting | 51730D | |
| Microscópio de dissecação | INNOVIEW | SEM-HT/TW | |
| Esterilizador de esferas de vidro | RWD Life Science | RS1501 | |
| Almofada de aquecimento | Stoelting | 53800M | |
| Microscópio Leica | Leica | DM2500 | |
| Micro Pinça de Dissecação | ROBOZ | RS-5136 | Serrilhada, Ligeira Curva; Extra Delicado; Largura da ponta de 0,5 mm; 4" de comprimento |
| Tesoura de Micro Dissecação | ROBOZ | RS-5918 | Angular Sharp de 4,5" |
| World Precision Instruments (WPI) | MICRO2T | Controlador SMARTouch | |
| Bomba de seringa de microinjeção | World Precision Instruments (WPI) | UMP3T-1 | UltraMicroPump3 |
| Seringa de microlitro | Hamilton | 80014 | 10 µ L |
| Luz Fria de Fibra Óptica com Fibra Dupla Passo | LGY-150 | Fornecedor local | |
| Aparador de animais de estimação | WAHL | 09962-2018 | |
| Vaporizador para Isoflurano | Step | AS-01 | Fornecedor local |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| SoftwareVídeo de | |||
| comportamento animal software de rastreamento | Noldus | EthoVision | Versão: 15.0.1416 |
| Software Leica Application Suite X | Leica | LASX | Versão: 3.7.2.22383 |
Referências
- Lynch, J. B., Hsiao, E. Y. Microbiomes as sources of emergent host phenotypes. Science. 365 (6460), 1405-1409 (2019).
- Dinan, T. G., Cryan, J. F. The microbiome-gut-brain axis in health and disease. Gastroenterology Clinics of North America. 46 (1), 77-89 (2017).....
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Reimpressões e permissões
