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Artigo de método

Entrega intracerebroventricular de metabólitos microbianos derivados do intestino em camundongos em movimento livre

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DOI:

10.3791/63972

⸱

2 de junho de 2022

 ,  , 
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Physiology, College of Medicine, National Cheng Kung University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Os metabólitos microbianos derivados do intestino têm efeitos multifacetados, levando a um comportamento complexo em animais. Nosso objetivo é fornecer um método passo-a-passo para delinear os efeitos dos metabólitos microbianos derivados do intestino no cérebro através da entrega intracerebroventricular através de uma cânula guia.

Resumo

O impacto da microbiota intestinal e seus metabólitos na fisiologia e no comportamento do hospedeiro tem sido extensivamente investigado nesta década. Numerosos estudos revelaram que os metabólitos derivados da microbiota intestinal modulam as funções fisiológicas mediadas pelo cérebro através de intrincadas vias intestino-cérebro no hospedeiro. Os ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) são os principais metabólitos derivados de bactérias produzidos durante a fermentação de fibras alimentares pelo microbioma intestinal. Os AGCCs secretados do intestino podem atuar em vários locais da periferia, afetando as respostas imunológicas, endócrinas e neurais devido à vasta distribuição de receptores SCFAs. Portanto, é um desafio diferenciar os efeitos centrais e periféricos dos AGCCs por meio da administração oral e intraperitoneal de AGCC. Este artigo apresenta um método baseado em vídeo para interrogar o papel funcional dos AGCCs no cérebro através de uma cânula guia em camundongos em movimento livre. A quantidade e o tipo de AGCCs no cérebro podem ser ajustados controlando o volume e a taxa de infusão. Este método pode fornecer aos cientistas uma maneira de apreciar o papel dos metabólitos derivados do intestino no cérebro.

Introdução

O trato gastrointestinal humano abriga diversos microrganismos que impactam o hospedeiro 1,2,3. Essas bactérias intestinais podem secretar metabólitos derivados do intestino durante a utilização de componentes dietéticos consumidos pelo hospedeiro 4,5. Curiosamente, os metabólitos intestinais não metabolizados na periferia podem ser transportados para outros órgãos via circulação6. Vale ressaltar que esses metabólitos secretados podem servir como mediadores para o eixo intestino-cérebro, definido como a comunicação bidirecional entre o sistema nervoso central e o intestino7. Estudos prévios mostraram que metabólitos derivados do intestino podem modular o comportamento complexo e a emoção em animais 8,9,10,11.

Os ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) são os principais metabólitos produzidos pela microbiota intestinal durante a fermentação de fibras alimentares e carboidratos indigestos6. Acetato, propionato e butirato são os AGCCs mais abundantes no intestino12. Os AGCCs servem como fonte de energia para as células do trato gastrointestinal. AGCCs não metabolizados no intestino podem ser transportados para o cérebro através da veia porta, modulando assim o cérebro e o comportamento 6,12. Estudos prévios sugeriram que os AGCCs podem desempenhar um papel crítico nos transtornos neuropsiquiátricos 6,12. Por exemplo, a injeção intraperitoneal de butirato em camundongos BTBR T+ Itpr3tf/J (BTBR), um modelo animal de transtorno do espectro autista (TEA), resgatou seus déficits sociais13. Ratos tratados com antibióticos que receberam microbiota de indivíduos depressivos mostraram um aumento nos comportamentos semelhantes à ansiedade e nos AGCCs fecais14. Clinicamente, alterações nos níveis de AGCCs fecais foram observadas em pessoas com TEA em comparação com controles com desenvolvimento típico15,16. Pessoas com depressão apresentam níveis mais baixos de AGCCs fecais do que indivíduos saudáveis17,18. Esses estudos sugeriram que os AGCCs podem alterar o comportamento em animais e humanos através de várias rotas.

Os metabólitos microbianos exercem diversos efeitos em múltiplos locais do corpo, impactando a fisiologia e os comportamentos do hospedeiro 4,19, incluindo o trato gastrointestinal, o nervo vago e o nervo simpático. É difícil identificar o papel preciso dos metabólitos derivados do intestino no cérebro ao administrar os metabólitos por vias periféricas. Este trabalho apresenta um protocolo baseado em vídeo para investigar os efeitos de metabólitos derivados do intestino no cérebro de um rato em movimento livre (Figura 1). Mostramos que os AGCCs poderiam ser administrados agudamente através da cânula-guia durante os testes comportamentais. O tipo, o volume e a taxa de infusão de metabólitos podem ser modificados dependendo da finalidade. O local da canulização pode ser ajustado para explorar o impacto dos metabólitos intestinais em uma região específica do cérebro. Nosso objetivo é fornecer aos cientistas um método para explorar o impacto potencial dos metabólitos microbianos derivados do intestino no cérebro e no comportamento.

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Protocolo

Todos os protocolos experimentais e os cuidados com os animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Nacional de Cheng Kung (NCKU).

1. Preparação para o animal experimental

  1. Obtenha camundongos machos C57BL/6JNarl do tipo selvagem de 6 a 8 semanas de idade de um fornecedor.
  2. Coloque os ratos em uma gaiola de rato padrão com ração de rato padrão e água esterilizada ad libitum.
    NOTA: As condições de alojamento para o Centro de Animais de Laboratório da NCKU são 22 ± temperatura de 1 °C, 55% ± 10% de umidade e um ciclo claro/escuro de 13 h/11 h.

2. Cirurgia estereotáxica

  1. Preparar e esterilizar o instrumento estereotáxico, instrumentos cirúrgicos e itens relacionados.
    NOTA: Todos os itens que entrarão em contato diretamente com o local cirúrgico devem ser esterilizados para evitar a infecção.
  2. Anestesiar o rato, colocando-o na gaiola de plexiglas com 1%-5% de isoflurano em oxigénio.
    NOTA: Observe atentamente o rato para garantir que a taxa de respiração é mantida em torno de uma respiração por segundo.
  3. Tire o rato da câmara de anestesia. Raspe o local cirúrgico (cabeça do rato) com um aparador de animais de estimação. Coloque o mouse sobre o quadro estereotáxico fixando os incisivos do mouse na barra do incisivo no suporte do incisivo estereotáxico. Cubra o nariz com a máscara do nariz.
  4. Anestesiar o camundongo com isoflurano de 1% a 2,5% em oxigênio durante toda a cirurgia estereotáxica. Avalie a nocicepção do rato através do reflexo da pinça do dedo do pé e assegure uma taxa de respiração constante antes de incidir o local cirúrgico.
  5. Coloque uma almofada de aquecimento (37,0 °C) por baixo do rato na estrutura estereotáxica para manter a temperatura corporal durante a cirurgia. Alternativamente, mantenha a temperatura central com o auxílio de uma sonda térmica retal conectando o aquecedor programado e a almofada de aquecimento.
  6. Remova o pelo aparado na cabeça usando fita adesiva. Injete o rato com o analgésico cetoprofeno (5 mg/kg) por via subcutânea para aliviar a dor. Aplique pomada ocular para evitar olhos secos.
  7. Insira a barra auricular pontiaguda no canal auditivo para fixar a cabeça.
  8. Centralize a cabeça ajustando a escala da barra auricular.
  9. Aperte a braçadeira do nariz no suporte do incisivo para evitar o movimento vertical. Pressione a cabeça suavemente para verificar se a cabeça está fixa e evitar que a cabeça se solte durante a cirurgia subsequente.
  10. Desinfete o couro cabeludo com três esfoliantes alternados de clorexidina usando um cotonete. Inicie cada esfoliação do meio para o lado externo (da área central mais desinfetada para a área menos desinfetada).
    NOTA: O uso de esfoliantes do meio para o exterior pode ajudar os cientistas a minimizar a infecção e a contaminação da pele. A área externa está próxima à região da cabeça não raspada, que ainda tem uma grande quantidade de pelo e não é fácil de desinfetar completamente.
  11. Incidir o couro cabeludo de forma anterior/posterior (<1 cm) utilizando uma lâmina cirúrgica. Abra a incisão e limpe o crânio com um cotonete segurado por pinça de microdissecação.
    NOTA: A pinça microdissecante, a lâmina cirúrgica e os cotonetes devem ser esterilizados por autoclave antes da cirurgia. Durante o processo cirúrgico, esterilizar todo o equipamento cirúrgico utilizando um esterilizador de esferas de vidro (150 °C) durante pelo menos 5 s antes e depois de cada animal. Prepare um copo esterilizado para segurar a lâmina cirúrgica e a pinça durante o processo cirúrgico e entre os animais.
  12. Identifique o Bregma e o Lambda no crânio. Use o Bregma como referência para localizar a região de interesse.
    1. Opcional: Monte a broca estereotáxica no suporte da broca estereotáxica e use a ponta da broca para apontar Bregma como referência. Esterilizar a broca estereotáxica utilizando o esterilizador de esferas de vidro (150 °C) durante, pelo menos, 5 s.
  13. Calibrar e alinhar o plano horizontal do crânio plano nos planos esquerdo/direito e anterior/posterior por Bregma/Lambda.
    NOTA: Se não estiver em um plano horizontal correto, remonte o mouse no instrumento estereotáxico.

3. Implantação de cânula guia personalizada comercial

  1. Identificar e rotular a posição do ventrículo lateral direito, com base nas coordenadas estereotáxicas: Distância a Bregma, anterior/posterior (A/P): 0,26 mm, medial/lateral (M/L): -1,0 mm, dorsal/ventral (D/V): -2,0 mm20.
    NOTA: As coordenadas podem ser modificadas com base na região de interesse. As coordenadas para o ventrículo lateral foram baseadas em camundongos adultos C57BL/6J com uma faixa de peso de 26-30 g. Se ratos mais jovens forem usados, consulte a discussão.
  2. Faça um furo (diâmetro = 1,5 mm) através do crânio no local marcado usando uma broca estereotáxica para a implantação de uma cânula guia comercial.
  3. Faça mais dois a quatro furos (diâmetro = 1,5 mm) no crânio usando uma broca estereotáxica para a montagem de parafusos de aço inoxidável.
    NOTA: Esterilizar a broca estereotáxica utilizando um esterilizador de esferas de vidro (150 °C) durante, pelo menos, 5 s antes e depois de cada animal.
  4. Limpe os restos ósseos e pare de sangrar com um cotonete.
  5. Limpe o crânio com lidocaína (1 mg / kg) usando um cotonete para efeitos anestésicos locais, antipruriginosos e analgésicos. Se o sangramento não parar após a perfuração, coloque suavemente um cotonete no orifício para hemostasia.
  6. Monte dois a quatro parafusos inoxidáveis nos orifícios para fornecer âncoras para acrílico dental.
  7. Colocar a cânula guia comercial no suporte da cânula estereotáxica e desinfectar com o esterilizador de esferas de vidro (150 °C).
    NOTA: A cânula guia comercial, o manequim comercial e o injetor comercial (Figura 2A) foram personalizados com as especificações mostradas na Tabela de Materiais.
  8. Mova o suporte da cânula estereotáxica para o orifício perfurado para o ventrículo lateral e insira lentamente a cânula guia comercial no orifício até a profundidade desejada (2,5 mm).
    NOTA: A coordenada dorsal/ventral pode ser definida definindo a ponta da cânula guia comercial como referência quando a ponta mal é inserida no orifício.
  9. Aplique 10 μL de adesivo de n-butilcianoacrilato (cola adesiva de tecido) para fixar a cânula guia comercial no furo perfurado e aguarde 3-4 min. Solte a cânula guia comercial suavemente do suporte da cânula estereotáxica e afaste-o.
  10. Aplique o acrílico dentário no couro cabeludo incisado para fixar a cânula guia comercial e aguarde pelo menos 5 minutos. Implante o manequim comercial na cânula guia comercial para evitar o entupimento da cânula pelo sangue ou fluido corporal (Figura 2B).
  11. Solte a barra auricular do canal auditivo e remova o mouse do quadro estereotáxico.
  12. Coloque o rato numa nova gaiola com uma almofada de aquecimento por baixo para recuperação da anestesia e observe continuamente até que o rato acorde completamente.
    NOTA: Não deixe o animal sozinho até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Um animal que tenha sido submetido a cirurgia não deve retornar à companhia de outros animais até que seja totalmente recuperado.
  13. Devolver o rato a um alojamento único ou a um alojamento em grupo, dependendo do protocolo institucional da IACUC e do desenho experimental. Para alojamento em grupo, certifique-se de que menos ratos estão alojados em uma gaiola para minimizar lesões indesejadas ou o descolamento da cânula.
  14. Administrar ibuprofeno (0,2 mg/mL) na água potável por pelo menos 3 dias para cuidados pós-operatórios e monitorar duas vezes ao dia sinais de dor e angústia por pelo menos 3 dias.
    1. Durante os cuidados pós-operatórios, aplique pomada de roxitromicina ao redor da pele para prevenir a inflamação e a infecção nos camundongos.
    2. Continue monitorando o estado do animal e dê uma injeção intraperitoneal oportuna de glicose a 5% e / ou cloreto de sódio a 0,9% para fornecer energia suficiente.
    3. Se o estado de dor, angústia ou infecção se deteriorar constantemente, eutanasie o rato por inalação de CO2 .
  15. Aguarde 1 semana após a operação para que o rato esteja pronto para a entrega intracerebroventricular de AGCCs e testes comportamentais.

4. Preparação dos SCFAs

  1. Dissolva o acetato de sódio, o butirato de sódio e o propionato de sódio no líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) (consulte a Tabela de Materiais).
  2. Certifique-se de que os produtos químicos estejam totalmente dissolvidos, ajuste o pH para 7,4 e filtre a mistura de SCFAs através de um filtro de 0,22 μm para esterilização.

5. Configurar o sistema de infusão para a entrega intracerebroventricular de AGCCs durante o teste comportamental

  1. Monte uma câmera de teto para registrar o comportamento. Conecte a câmera a um computador para controlar o software de gravação de vídeo (Figura 3).
  2. Encha uma seringa de 10 μL com água destilada.
    NOTA: Evite bolhas de ar na seringa de microlitro.
  3. Conecte uma bomba de microinjeção com o controlador de microinjeção.
  4. Monte a seringa de microlitro na bomba de microinjeção. Para instalar a seringa, prima o botão para soltar a braçadeira e instale a seringa na posição correspondente. Feche a braçadeira e aperte o parafuso de retenção do êmbolo na bomba de microinjeção (Figura 4A).
  5. Inserir o injetor comercial no tubo de polietileno (Figura 2A).
  6. Pendure o tubo de polietileno na câmera de teto acima da arena de testes.
  7. Encha o tubo de polietileno com água destilada usando uma seringa de insulina. Ligue a seringa de microlitros ao tubo de polietileno suspenso.
    NOTA: Certifique-se de que o tubo de polietileno seja longo o suficiente para permitir que o mouse se mova livremente por toda a arena de teste.

6. Configurações do sistema do controlador de microinjeção

  1. Ligue o controlador de microinjeção e pressione Display All Channels para acessar a tela Command (Figura 4C). Pressione Configuração e defina Volume Target para 9.800 nL com Delivery Rate para 100 nL/s. Infundir 9.800 nL de água destilada do tubo de polietileno conectado à seringa de microlitro (pressione Direção para alternar para o modo Infusão e pressione RUN) (veja quadrados vermelhos na tela de comando da Figura 4C).
  2. Pressione Configuração e defina Volume Target como 3.000 nL com Delivery Rate para 100 nL/s. Retire 3.000 nL de óleo mineral (pressione Direction para alternar para o modo Withdraw e pressione RUN) (veja quadrados vermelhos na tela Command da Figura 4C).
    NOTA: Uma separação clara da fase óleo-água deve ser observada no tubo de polietileno.
  3. Desmonte o tubo de polietileno da agulha da seringa de microlitro. Cuspa 3.000 nL de água destilada da agulha da seringa de microlitro (pressione Direção para alternar para o modo Infusão e pressione RUN).
  4. Insira a seringa de microlitro de volta no tubo de polietileno. Pressione Configuração e defina Volume Target para 9.500 nL com Delivery Rate para 100 nL/s. Retire 9.500 nL de SCFAs (pressione Direção para alternar para o modo Retirar e pressione RUN). Rotule a fase óleo-SCFAs para validar se os SCFAs são infundidos com êxito.
  5. Pressione Configuration (Configuração ) e defina o Volume Target desejado com Delivery Rate para 7 nL/s. Pressione Direction para alternar para o modo Infuse (consulte quadrados vermelhos na tela Command da Figura 4C).
    NOTA: Determine o volume com base no tempo de perfusão. Por exemplo, se o tempo de perfusão for de 3 min para a taxa de administração de 7 nL/s, o volume alvo = 1.260 nL.
  6. Pressione RUN para infundir a seringa de microlitro para a frente até que o líquido saia na extremidade frontal do injetor comercial antes de inserir o injetor na cânula para injeção de SCFAs.

7. Infusão de AGCC no ventrículo lateral através da cânula guia comercial em camundongo em movimento livre

  1. Anestesiar o rato, colocando-o na gaiola de plexiglas com 1%-5% de isoflurano em oxigénio.
    NOTA: Observe atentamente o rato para garantir que a taxa de respiração é mantida em torno de uma respiração por segundo.
  2. Scruff o mouse e inserir o injetor comercial na cânula guia comercial (Figura 4B).
    NOTA: Se a cânula guia comercial estiver obstruída por sangue ou fluido corporal, desobstrua-a suavemente com uma pinça.
  3. Permita que o rato se recupere da anestesia por 15 minutos em uma gaiola antes do teste comportamental.
  4. Para o teste básico de locomoção, coloque o rato em uma nova gaiola e permita que ele explore livremente por 35 minutos. Infunda SCFAs usando uma Taxa de Entrega de 7 nL /s para um volume de destino de 2.100 nL nos primeiros 5 minutos (pressione Direção para o modo Infusão e pressione RUN).
    NOTA: A locomoção na nova gaiola pode ser analisada por meio de um software de rastreamento de vídeo do comportamento animal21,22.
  5. Anestesiar o rato (repetindo o passo 7.1) e retirar o injector comercial da cânula guia comercial.
    NOTA: O rato pode ser repetidamente injetado com diferentes controlos/metabolitos depois de administrar o período de tempo adequado para lavar a injeção anterior. Desde que a cânula esteja fixada na cabeça do rato, o rato pode ser repetidamente testado com diferentes metabolitos.

8. Restauração do sistema de microinjeção

  1. Desmonte o tubo de polietileno da seringa de microlitro.
  2. Injete ar no tubo usando a seringa de insulina para descartar a água destilada no tubo de polietileno. Esvazie a seringa de microlitro.
  3. Pressione Reset Pos na tela Configuration para abrir a tela Syringe Stop Definition (Figura 4C).
  4. Pressione Retirar até que ocorra um som de bipe para redefinir a bomba de microinjeção para a posição totalmente retirada (Figura 4C).
  5. Retorne à tela Command e desligue o controlador de microinjeção se houver um sinal ** END REACH** nesta tela (Figura 4C).

9. Opcional: Validação da injeção intracerebroventricular pelo traçador neural

  1. Infundir 2.100 nL do traçador neural com a Taxa de Entrega de 7 nL/s para verificar o local de perfusão.
    NOTA: Deixe o injetor na cânula guia por 5 minutos para evitar o refluxo.
  2. Anestesiar o rato com uma sobredosagem de isoflurano (5%) 30 min após a perfusão de marcador neural.
  3. Verifique a taxa de respiração e o reflexo de pinça da cauda / pata no rato anestesiado.
    Observação : os mouses devem parar de responder antes da próxima etapa.
  4. Faça uma incisão de 4-5 cm através da pele, músculo e parede abdominal abaixo da caixa torácica.
  5. Mova ligeiramente o fígado para longe do diafragma com cuidado.
  6. Incise o diafragma para expor o coração do rato.
  7. Perfundir o rato através do coração com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e paraformaldeído gelado a 4% em PBS.
  8. Decapitar o camundongo e dissecar o cérebro cuidadosamente com pinça de microdissecação e tesoura de microdissecação para retirar todo o cérebro23. Coloque as amostras de cérebro em paraformaldeído gelado a 4% em PBS por 3-4 dias e lave-as 3 x 5 min com PBS.
  9. Corte o cérebro em duas partes no suporte da fatia do cérebro do rato no oitavo corte do suporte da fatia do cérebro do rato (1 mm / seção) da direção anterior para posterior. Coloque o cérebro no molde de incorporação e incorpore as amostras de cérebro em agarose de baixo ponto de fusão (4% em PBS).
  10. Cole o cérebro embutido em agarose no palco do vibratome usando supercola. Separe o cérebro coronalmente em fatias cerebrais de 50 μm usando o vibratome.
  11. Incubar as fatias cerebrais no anticorpo visando o marcador neural diluído em tampão de bloqueio (diluição de 1:1.000) durante a noite à temperatura ambiente.
    NOTA: O tampão de bloqueio continha 10% de soro de cavalo, 0,1% de Triton X-100 e 0,02% de azida de sódio.
  12. Lave as fatias 3 x 5 min com PBST (PBS com 0,1% de tritão X-100).
  13. Incubar as fatias cerebrais em anticorpo secundário conjugado com fluorescência-corante diluído em tampão de bloqueio (diluição de 1:500) por 2 h à temperatura ambiente.
  14. Lave as fatias 3 x 5 min com PBS.
  15. Monte as fatias cerebrais na lâmina com um meio de montagem contendo 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).
  16. Cubra a lâmina com uma tampa de microscópio.
  17. Aplique esmalte na borda deslizante para evitar vazamento do meio de montagem.
  18. Após a incubação durante a noite à temperatura ambiente, protegida da luz, imagem do sinal de fluorescência no local de perfusão utilizando um microscópio de fluorescência.

10. Opcional: Infusão de metabólitos através de uma cânula guia de aço inoxidável personalizada no ventrículo lateral em camundongos

  1. Siga as seções de protocolo 1-8 e substitua a cânula guia comercial por uma cânula guia de aço inoxidável para infundir produtos químicos através de um injetor de aço inoxidável no mouse.
    NOTA: Os prós e contras das diferentes cânulas comerciais e de aço inoxidável são elaborados na seção de discussão.
  2. Realizar o protocolo cirúrgico da mesma forma descrita nas seções 2 e 3 do protocolo, exceto lembrar de substituir a cânula guia comercial por uma cânula guia de aço inoxidável (Figura 5B).
    NOTA: A cânula guia de aço inoxidável, o manequim de aço inoxidável e o injetor de aço inoxidável (Figura 5A) foram personalizados com as especificações mostradas na Tabela de Materiais. Insira a cânula guia de aço inoxidável personalizada no orifício até a profundidade desejada (2,0 mm).
  3. Infundir SCFAs através da cânula guia de aço inoxidável usando o sistema de microinjeção que consiste no controlador de microinjeção e na bomba de microinjeção (Figura 4B) (o mesmo que as seções de protocolo 4-7). Para o manequim de aço inoxidável da cânula guia de aço inoxidável, dobre um lado do injetor de aço inoxidável suavemente até que a ponta do outro lado seja 1 mm mais longa que a cânula guia de aço inoxidável.
  4. Infundir 2.100 nL do marcador neural através da cânula guia de aço inoxidável no ventrículo lateral em camundongos (o mesmo que a seção 9 do protocolo).
  5. Coletar a amostra por 30 minutos após a infusão do traçador neural (o mesmo que a seção 9 do protocolo).
  6. Realizar a aquisição de imagens nas fatias cerebrais infundidas do traçador neural (o mesmo que a seção 9 do protocolo).

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Resultados

O camundongo foi infundido com AGCCs 1 semana após a recuperação do implante da cânula-guia para avaliar a atividade locomotora em uma nova gaiola. O camundongo foi colocado em uma nova gaiola e infundido com 2.100 nL de AGCCs ou ACSF nos primeiros 5 minutos (taxa de entrega de 7 nL/s) no cérebro através da cânula guia comercial implantada no ventrículo lateral do cérebro. A atividade locomotora em uma nova gaiola foi registrada por mais 30 minutos após a infusão. Não foi observada diferença na atividade locomotora na no...

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Discussão

Metabólitos derivados do intestino têm sido associados a doenças mediadas pelo cérebro sem muito mecanismo preciso, em parte devido aos seus múltiplos sítios de ligação no organismo 6,12,24. Relatos anteriores indicaram que os AGCCs poderiam servir como ligantes para receptores acoplados à proteína G, reguladores epigenéticos e fontes de produção de energia em múltiplos locais do organismo 6,12...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse relacionados a este trabalho.

Agradecimentos

Reconhecemos a equipe do Centro de Animais de Laboratório da Universidade Nacional de Cheng Kung (NCKU) por cuidar dos animais. Este trabalho foi apoiado pela bolsa de estudos do Prof. Kun-Yen Huang Education Fund da CHENG-HSING Medical Foundation para C.-W.L.; os fundos do Ministério da Ciência e Tecnologia (MOST) em Taiwan: (Iniciação Científica MOST 109-2813-C-006-095-B) para T.-H.Y.; (MAIS 107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3) a W.-L.W.; e o Projeto Sprout de Ensino Superior, do Ministério da Educação para a Sede do Avanço Universitário na NCKU para W.-L.W.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Material
Advil Liqui-Géis Solubilizado Ibuprofeno A2:D41Pfizern/a
Alexa Fluor 488 burro anti-coelhoThermoFisher ScientificA-21206
Anti-Fluorescente Ouro (coelho policlonal)MilliporeAB153-I
, 500 mL, 0.22 μ m, PES, EstérilNEST121921LA01
CaCl2 Sigma-AldrichC1016ACSF: 0,14 g/L
Clorexidina esfoliante 2%PhoenixNDC 57319-611-09
Solução de clorexidinaPhoenixNDC 57319-599-09
Manequim comercialRWD Life Science62004Single_OD 0,20 mm/ M3,5/G = 0,5 mm
Cânula guia comercialRWD Life Science62104Single_OD 0,41 mm-27G/ M3,5/C = 2,5 mm 
Injetor comercialRWD Life Science62204Single_OD 0,21 mm-33G/ Combina com M3,5/C = 3,5 mm/G = 0,5 mm
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270ACSF: 0,61 g/L
Acrílico dentalHYGENICn/a
Parafusos de fixaçãoRWD Life Science62521
Meio de montagem Fluoroshield com DAPIAbcamAB104139
SeringasThermoFisher Scientific16050130
Serumpara cavalos BBraunXG-LBB-9151133S-1BX1 mL
Isoflurano Panion & BF biotechDG-4900-250D
KCl Sigma-AldrichP3911ACSF: 0,19 g/L
Cetoprofeno Swiss Pharmaceuticaln/a
Lidocaína AstraZenecan/a
Baixo ponto de fusão agaroseInvitrogen16520
MgCl2 Sigma-AldrichM8266ACSF: 0,19 g/L
Lâminas de microscópioMARIENFELD101242
Lâminas de microscópioThermoFisher Scientific4951PLUS-001E
Óleo mineral leve, branco NFMacron Fine ChemicalsMA-6358-04
NaCl Sigma-AldrichS9888ACSF: 7,46 g/L
NaH2PO4 Sigma-AldrichS8282ACSF: 0.18 g/L
NaHCO3 Sigma-AldrichS5761ACSF: adesivo de 1,76 g/L
n-butil cianoacrilato (cola adesiva de tecido)3M1469SB3M Vetbond
Neural tracer Santa CruzSC-358883
ParaformaldeídoSigma-AldrichP6148
Tubo de polietilenoRWD Life Science62329OD 1.50, I.D 0.50 mm e OD 1.09, I.D 0.38 mm
Pomada Puralube Vet (olho)Dechra 
Acetato de sódio Sigma-AldrichS2889SCFAs: 13.5 mM
Azida de sódio Butirato de sódio Sigma-AldrichS2002
Sigma-AldrichB5887SCFAs: 8 mM
Propionato de Sódio SCFAs Sigma-AldrichP1880de 5,18 mM
Chun Ta empresa de aço inoxidável CO., LTD.n/aOD 0,63 mm; Fornecedor local
Injetor de aço inoxidávelChun Ta empresa de aço inoxidável CO., LTD.n/aOD 0,3 mm; manequim é feito de injetor; fornecedor local
SupercolaKrazy ColaKG94548R
Triton X-100Merck1.08603.1000
EquipamentoSuporte de
cânulaRWD Life ScienceB485-68217
Câmera de tetoFOSCAMR2
Instrumentos estereotáxicos digitaisStoelting51730D
Microscópio de dissecaçãoINNOVIEWSEM-HT/TW
Esterilizador de esferas de vidroRWD Life ScienceRS1501
Almofada de aquecimentoStoelting53800M
Microscópio Leica LeicaDM2500
Micro Pinça de DissecaçãoROBOZRS-5136Serrilhada, Ligeira Curva; Extra Delicado; Largura da ponta de 0,5 mm; 4" de comprimento 
Tesoura de Micro DissecaçãoROBOZRS-5918Angular Sharp de 4,5"
World Precision Instruments (WPI)MICRO2TControlador SMARTouch
Bomba de seringa de microinjeçãoWorld Precision Instruments (WPI)UMP3T-1UltraMicroPump3   
Seringa de microlitroHamilton8001410 µ L
Luz Fria de Fibra Óptica com Fibra Dupla PassoLGY-150Fornecedor local
Aparador de animais de estimaçãoWAHL09962-2018
Vaporizador para IsofluranoStepAS-01Fornecedor local
VibratomeLeicaVT1000S
SoftwareVídeo de
comportamento animal software de rastreamentoNoldusEthoVisionVersão: 15.0.1416
Software Leica Application Suite XLeicaLASXVersão: 3.7.2.22383
Filtro de Aspirador de Pó de Insulina FluoroGold 12920060: Cânula guia inoxidável Controlador de Microinjeção

Referências

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