Method Article

Detecção simultânea baseada em imagens e flutometria de marcadores de senescência fluorescentes múltiplas em células cancerígenas senescentes induzidas por terapia

DOI:

10.3791/63973

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July 12th, 2022

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1Johannes Kepler University Linz, 2Charité - University Medicine Berlin, 3Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association

In This Article

Summary

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Aqui apresentamos um método baseado em citometria de fluxo para visualização e quantificação de marcadores associados à senescência múltipla em células únicas.

Abstract

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Drogas quimioterápicas podem induzir danos irreparáveis de DNA em células cancerosas, levando à apoptose ou senescência prematura. Ao contrário da morte celular apoptótica, a senescência é uma máquina fundamentalmente diferente que restringe a propagação de células cancerígenas. Décadas de estudos científicos revelaram os efeitos patológicos complexos das células cancerígenas senescentes em tumores e microambientes que modulam células cancerígenas e células estromais. Novas evidências sugerem que a senescência é um fator prognóstico potente durante o tratamento do câncer e, portanto, a detecção rápida e precisa de células senescentes em amostras de câncer é essencial. Este artigo apresenta um método para visualizar e detectar senescência induzida por terapia (TIS) em células cancerosas. Linhas celulares difusas de grandes células B (DLBCL) foram tratadas com mafosfamida (MAF) ou daunorubicina (DN) e examinadas para o marcador de senescência, β-galactosidase associada à senescência (SA-β-gal), o marcador de síntese de DNA 5-ethynyl-2′-desoxyuridina (EdU), e o marcador de dano de DNA gama-H2AX (γH2AX). A imagem do citómetro de fluxo pode ajudar a gerar imagens unicelulares de alta resolução em um curto período de tempo para visualizar e quantificar simultaneamente os três marcadores em células cancerosas.

Introduction

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Uma variedade de estímulos pode desencadear senescência celular, fazendo com que as células entrem em um estado de parada estável do ciclo celular. Esses estímulos incluem alterações intrínsecas de sinalização ou tensões extrínsecas. Sinais intrínsecos incluem encurtamento progressivo do telômero, alterações na estrutura do telômero, modificação epigenética, distúrbios da proteostase, disfunção mitocondrial e ativação de oncogênicos. As tensões extrínsecas incluem sinais inflamatórios e/ou de danos teciduais, radiação ou tratamento químico e privação nutricional 1,2,3,4.....

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Protocol

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1. Linhas celulares DLBCL com tratamento de mafosfamida ou daunorubicina para induzir senescência celular

NOTA: O protocolo também funciona para células cancerígenas aderentes. Dependendo do tamanho da célula, a semente 1-2 × 105 células em um poço de uma placa de 6 poços e incubar a placa em uma incubadora de 5% de CO2, 37 °C durante a noite antes do tratamento. As etapas do protocolo são as mesmas das células de suspensão, mas com duas exceções. Primeiro, as células precisam ser experimentadas fora da placa após a etapa 3.4. Em segundo lugar, as etapas de lavagem são realizadas sem centrifugação antes ....

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Results

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Uma matriz de compensação foi gerada por meio de software de análise de imagem, carregando dados gravados de amostras de controle de cor única. Como mostrado na Figura Suplementar S1, foi detectado um derramamento de luz não desprezível (coeficiente ≥ 0,1) de EdU para C12FDG com valor de coeficiente de crosstalk 0,248, enquanto o crosstalk entre outros canais não foi significativo. Quatro diferentes linhas celulares DLBCL foram tratadas com 5 μg/mL MAF ou 20 ng/mL DN para induzir senescência c.......

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Discussion

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Este método examinou a capacidade de entrada de senescência de quatro diferentes linhas celulares DLBCL após o tratamento quimioterápico, com imagem de campo brilhante e quantificação baseada em citometria de fluxo. Em um nível unicelular, detectamos com sucesso populações senescentes C12FDG+EdU-Ki67+ em células KARPAS422 e WSU-DLCL2 tratadas, e em menor grau nas células OCI-LY1, enquanto a linha celular SU-DHL6 era resistente ao tratamento. A diferença na capacidade de entrada.......

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Disclosures

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Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Acknowledgements

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Este trabalho foi apoiado por uma bolsa para Yong Yu da Universidade Johannes Kepler Linz (BERM16108001).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Fosfo (Ser139) AnticorpoBiolegend613407
Anti-Ki-67 Camundongo Anticorpo Monoclonal (Alexa Fluor 647)Biolegend350509
C12FDG (5-Dodecanoilaminofluoresceína Di-β-D-Galactopiranosídeo)Fisher Scientific11590276
Cloroquina -difosfatoSigma aldrichC6628
Limpador (Coulter Clenz)Beckman Coulter8546929
Click-iT EdU Kit de Ensaio de Citometria de Fluxo Pacific BlueThermo ScientificC10418
DaunorrubicinaMedchemexpressHY-13062A
Debubbler (70% Isopropanol)Millipore1.3704
Software de Análise de Imagem (Amnis  IDEIAS  6.3)LuminexCN-SW69-12
Software de instrumento e imagem (Amnis  ImageStreamX  Sistema de citômetro de fluxo de imagem Mk II e software INSPIRE)Luminex100220
KARPASDSMZACC 31
mafosfamida ciclohexilaminaNiomechD-17272
OCI-LY1DSMZACC 722
ParaformaldeídoFisher Scientific11473704
PETG (2-feniletil-β-D-tiogalactosid) Sigma aldrichP4902
saponinaSigma aldrich47036
BainhaMilliporeBSS-1006-B
Kit SpeedBead para esterilizador ImageStreamLuminex 400041
(0,4-0,7% hipoclorito)VWRJT9416-1
SU-DHL6DSMZACC 572
WSU-DLCL2DSMZACC 575

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
  2. Di Micco, R., et al. Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature. 444 (7119),....

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Imaging Flow CytometrySenescence MarkersTherapy Induced SenescenceFluorescent Marker DetectionDLBCL Cell LinesGamma H2AX DetectionEdU IncorporationC12 FDG StainingSingle Cell ImagingNuclear Foci Quantification

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