Summary
Die genaue Identifizierung von fibro-adipogene Vorläuferzellen (FAPs) und Muskelstammzellen (MuSCs) ist entscheidend für die Untersuchung ihrer biologischen Funktion unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Dieses Protokoll enthält Richtlinien für die Isolierung, Reinigung und Kultur von FAPs und MuSCs aus erwachsenen Mausmuskeln.
Abstract
Fibro-adipogene Vorläuferzellen (FAPs) sind eine Population von skelettmuskelresidenten mesenchymalen Stromazellen (MSCs), die sich entlang fibrogener, adipogener, osteogener oder chondrogener Linie differenzieren können. Zusammen mit Muskelstammzellen (MuSCs) spielen FAPs eine entscheidende Rolle bei der Muskelhomöostase, -reparatur und -regeneration, während sie die extrazelluläre Matrix (ECM) aktiv erhalten und umgestalten. Bei pathologischen Zuständen wie chronischen Schäden und Muskeldystrophien werden FAPs anomal aktiviert und differenzieren sich in kollagenproduzierende Fibroblasten und Adipozyten, was zu Fibrose und intramuskulärer Fettinfiltration führt. Daher spielen FAPs eine doppelte Rolle bei der Muskelregeneration, indem sie entweder den MuSC-Umsatz aufrechterhalten und die Gewebereparatur fördern oder zur fibrotischen Narbenbildung und ektopischen Fettinfiltraten beitragen, die die Integrität und Funktion des Skelettmuskelgewebes beeinträchtigen. Eine ordnungsgemäße Reinigung von FAPs und MuSCs ist eine Voraussetzung für das Verständnis der biologischen Rolle dieser Zellen sowohl bei physiologischen als auch bei pathologischen Zuständen. Hier beschreiben wir eine standardisierte Methode zur gleichzeitigen Isolierung von FAPs und MuSCs aus der Extremitätenmuskulatur erwachsener Mäuse mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS). Das Protokoll beschreibt detailliert die mechanische und enzymatische Dissoziation von einkernigen Zellen aus ganzen Extremitätenmuskeln und verletzten Tibialis anterior (TA) Muskeln. FAPs und MuSCs werden anschließend mit einem halbautomatischen Zellsortierer isoliert, um reine Zellpopulationen zu erhalten. Darüber hinaus beschreiben wir eine optimierte Methode zur Kultivierung ruhender und aktivierter FAPs und MuSCs, entweder allein oder unter Kokulturbedingungen.
Introduction
Der Skelettmuskel ist das größte Gewebe im Körper, macht ~ 40% des erwachsenen menschlichen Gewichts aus und ist verantwortlich für die Aufrechterhaltung der Körperhaltung, die Erzeugung von Bewegung, die Regulierung des Grundenergiestoffwechsels und der Körpertemperatur1. Die Skelettmuskulatur ist ein hochdynamisches Gewebe und besitzt eine bemerkenswerte Fähigkeit, sich an eine Vielzahl von Reizen wie mechanische Belastungen, metabolische Veränderungen und tägliche Umweltfaktoren anzupassen. Darüber hinaus regeneriert sich die Skelettmuskulatur als Reaktion auf akute Verletzungen, was zu einer vollständigen Wiederherstellung ihrer Morphologie und Funktionen führt2. Die Plastizität der Skelettmuskulatur beruht hauptsächlich auf einer Population residenter Muskelstammzellen (MuSCs), auch Satellitenzellen genannt, die sich zwischen der Myofaser-Plasmamembran und der Basallamina 2,3 befinden. Unter normalen Bedingungen befinden sich MuSCs in der Muskelnische in einem Ruhezustand, mit nur wenigen Teilungen, um den Zellumsatz zu kompensieren und den Stammzellpool wieder aufzufüllen4. Als Reaktion auf Verletzungen treten MuSCs in den Zellzyklus ein, vermehren sich und tragen entweder zur Bildung neuer Muskelfasern bei oder kehren in einem Selbsterneuerungsprozess in die Nische zurück 2,3. Zusätzlich zu MuSCs hängt die homöostatische Aufrechterhaltung und Regeneration der Skelettmuskulatur von der Unterstützung einer Population muskelresidenter Zellen ab, die als fibro-adipogene Vorläuferzellen (FAPs) bezeichnet werden5,6,7. FAPs sind mesenchymale Stromazellen, die in das Muskelbindegewebe eingebettet sind und in der Lage sind, sich entlang der fibrogenen, adipogenen, osteogenen oder chondrogenen Linie 5,8,9,10 zu differenzieren. FAPs bieten strukturelle Unterstützung für MuSCs, da sie eine Quelle für extrazelluläre Matrixproteine in der Muskelstammzellnische sind. FAPs fördern auch die langfristige Erhaltung der Skelettmuskulatur, indem sie Zytokine und Wachstumsfaktoren sezernieren, die trophische Unterstützung für Myogenese und Muskelwachstum bieten 6,11. Bei akuten Muskelverletzungen vermehren sich FAPs schnell, um eine vorübergehende Nische zu erzeugen, die die strukturelle Integrität des regenerierenden Muskels unterstützt und eine günstige Umgebung bietet, um die Proliferation und Differenzierung von MuSCs auf parakrine Weise aufrechtzuerhalten5. Mit fortschreitender Regeneration werden FAPs durch Apoptose aus dem regenerativen Muskel entfernt und ihre Anzahl kehrt allmählich auf das Basalniveau12 zurück. Unter Bedingungen, die chronische Muskelverletzungen begünstigen, überschreiben FAPs jedoch die pro-apoptotische Signalisierung und sammeln sich in der Muskelnische an, wo sie sich in kollagenproduzierende Fibroblasten und Adipozyten differenzieren, was zu ektopischen Fettinfiltraten und fibrotischer Narbenbildung führt12,13.
Aufgrund ihrer Multipotenz und ihrer regenerativen Fähigkeiten wurden FAPs und MuSCs als potenzielle Ziele in der regenerativen Medizin zur Behandlung von Skelettmuskelerkrankungen identifiziert. Um ihre Funktion und ihr therapeutisches Potenzial zu untersuchen, ist es daher wichtig, effiziente und reproduzierbare Protokolle für die Isolierung und Kultur von FAPs und MuSCs zu erstellen.
Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) kann verschiedene Zellpopulationen anhand morphologischer Merkmale wie Größe und Granularität identifizieren und ermöglicht eine zellspezifische Isolierung basierend auf der Verwendung von Antikörpern, die gegen Zelloberflächenmarker gerichtet sind. Bei erwachsenen Mäusen exprimieren MuSCs das vaskuläre Zelladhäsionsmolekül 1 (VCAM-1, auch bekannt als CD106)14,15 und α7-Integrin15, während FAPs den von Blutplättchen abgeleiteten Wachstumsfaktorrezeptor α (PDGFRα) und das Stammzellantigen 1 (Sca1 oder Ly6A/E)5,6,9,12,16,17 exprimieren. . In dem hier beschriebenen Protokoll wurden MuSCs als CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+ identifiziert, während FAPs als CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin- identifiziert wurden. Alternativ wurden PDGFRαEGFP-Mäuse verwendet, um FAPs als CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin- Ereignisse18,19 zu isolieren. Darüber hinaus verglichen wir die Überlappung zwischen dem Fluoreszenzsignal von PDGFRα-GFP+-Zellen mit Zellen, die durch den Oberflächenmarker Sca1 identifiziert wurden. Unsere Analyse zeigte, dass alle GFP-exprimierenden Zellen auch positiv für Sca1 waren, was darauf hindeutet, dass beide Ansätze für die Identifizierung und Isolierung von FAPs verwendet werden können. Schließlich bestätigte die Färbung mit spezifischen Markerantikörpern die Reinheit jeder Zellpopulation.
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Protocol
Alle durchgeführten Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den vom Animal Care and Use Committee (ACUC) des National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases (NIAMS) genehmigten institutionellen Richtlinien durchgeführt. Prüfer, die dieses Protokoll durchführen, müssen sich an ihre lokalen Tierethikrichtlinien halten.
HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt detailliert, wie FAPs und MuSCs aus Hintergliedmaßen und verletzten Tibialis anterior (TA) Muskeln von erwachsenen männlichen und weiblichen Mäusen (3-6 Monate) isoliert werden können, und bietet Richtlinien für die Kokultivierung von FAPs und MuSCs. Eine Übersicht über das experimentelle Verfahren ist in Abbildung 1 dargestellt. Alle Schritte dieses Protokolls sollten unter sterilen Bedingungen und bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben.
1. Reagenzien-Setup
- Waschmedium (WM): Bereiten Sie diese Lösung vor, indem Sie 10% (vol/vol) Pferdeserum und 1x Penicillin / Streptomycin zu Hams F-10 Nutrient Mix Zellmedien hinzufügen. WM kann vorab zubereitet und bei 4 °C gelagert werden.
- Muskeldissoziationspuffer (MDB): Bereiten Sie diesen Puffer vor, indem Sie Kollagenase II in WM auflösen. Wenn Sie ganze Hintergliedmaßenmuskeln sammeln, lösen Sie 1000 U / ml Kollagenase II in 10 ml WM für jede Maus auf (in einem 50 ml konischen Röhrchen vorzubereiten). Wenn Sie TA-Muskeln sammeln, lösen Sie 800 U / ml Kollagenase II in 7 ml WM für jede Maus auf (in einem 15 ml konischen Röhrchen vorzubereiten). Für TA-Muskeln hilft dies, Zellpellets besser sichtbar zu machen und eine höhere Ausbeute an FAPs und MuSCs zu erzielen. Bereiten Sie MDB frisch vor, bevor Sie die Muskeln sammeln, und halten Sie es auf Eis, bis es benötigt wird.
- Kollagenase II Lösungsvorrat: Bereiten Sie diese Lösung vor, indem Sie Kollagenase II in steriler 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf eine Endkonzentration von 1000 U/ml auflösen. Filtern Sie die Lösung durch einen 0,45 μm Spritzenfilter und aliquot in 1 ml Brühen. Lagern Sie die Lösung bei -20 °C.
- Dispase-Lösungsvorrat: Bereiten Sie diese Lösung vor, indem Sie Dispase in sterilem 1x PBS auf eine Endkonzentration von 11 U/ml auflösen. Filtern Sie die Lösung durch einen 0,45 μm Spritzenfilter und aliquot in 1 ml Brühen. Lagern Sie die Lösung bei -20 °C.
- Bereiten Sie das Kulturmedium von FAP vor, indem Sie DMEM mit 10% (vol/vol) fetalem Rinderserum, 1x Penicillin / Streptomycin und 2,5 ng / ml FGF ergänzen. Lagern Sie das Medium bei 4 °C.
- Bereiten Sie das Kulturmedium von MuSC vor, das F10 mit 10% (vol/vol) Pferdeserum, 1x Penicillin / Streptomycin und 2,5 ng / ml FGF ergänzt. Lagern Sie das Medium bei 4 °C.
- Bereiten Sie das Kokulturmedium vor, indem Sie DMEM mit 10% (vol/vol) fetalem Rinderserum, 10% (vol/vol) Pferdeserum, 1x Penicillin / Streptomycin und 2,5 ng / ml FGF ergänzen. Lagern Sie das Medium bei 4 °C.
2. Muskelentnahme der Hinterbeine
- 2-3 ml WM in eine 6 cm Schüssel geben (eine Schüssel pro Maus) und auf Eis legen.
- Euthanasie durch Ersticken durchführen: Legen Sie die Maus in eine CO 2 -Kammer und führen Sie 100% CO2 ein. Verwenden Sie zervikale Dislokation, um den Tod zu bestätigen.
- Legen Sie die Maus in Rückenlage auf ein Präparierkissen und besprühen Sie sie mit 70% (vol/vol) Ethanol, um eine Kontamination zu vermeiden.
- Verwenden Sie eine Pinzette, um die Mitte der Bauchhaut der Maus zu kneifen und eine ~ 1 cm Öffnung horizontal zu schneiden. Fassen Sie die Wundränder und den Schreibtisch in der Maus, indem Sie die Öffnung in entgegengesetzte Richtungen ziehen, um die darunter liegenden Muskeln freizulegen. Belichten Sie zu diesem Zeitpunkt eine Seite des Hinterbeins der Maus.
- Bevor Sie Muskeln sammeln, entfernen Sie intermuskuläres Fett zwischen den Oberschenkeln und dem proximalen Ende des Quadrizeps. Dies wird die Isolierung von FAPs und MuSCs verbessern.
- Ohne das Gewebe zu beschädigen, verwenden Sie scharfe Pinzetten, um die Faszie zu brechen und abzulösen, um die Muskeln unter TA und Extensor digitorum longus (EDL) freizulegen. Führen Sie die scharfe Spitze der Pinzette unter die TA / EDL-Muskeln, um die Muskeln von der Tibia zu lösen.
- Schneiden Sie die Sehnen ab, die den TA/EDL am Knöchel befestigen, und trimmen Sie die Muskeln mit einer Schere entlang der Längslinie des TA/EDL. Schneiden Sie die Sehnen um das Knie, um die gesamten TA / EDL-Muskeln zu lösen. Legen Sie die Muskeln in eine 6 cm lange Schale, die auf Eis gehalten wird.
- Isolieren Sie die Muskeln Gastrocnemius und Soleus, indem Sie alle Sehnen am Knöchel schneiden und die Muskeln von Tibia und Fibula lösen. Schneiden Sie um das Knie und übertragen Sie die Muskeln auf die 6 cm lange Schale.
- Ziehen Sie die Faszie um den Quadrizeps ab und trennen Sie sie vom Femur, indem Sie die scharfe Spitze der Pinzette zwischen Muskel und Knochen führen. Schneiden Sie die Sehnen um das Knie und schneiden Sie, während Sie den Quadrizeps mit einer Pinzette am distalen Ende halten, den Rest des Muskels, indem Sie entlang des Femurs schneiden. Legen Sie die Muskeln in die 6 cm lange Schale.
- Lösen Sie die Oberschenkelmuskulatur und die verbleibenden Muskeln um den Femur herum und übertragen Sie diese auf die 6 cm lange Schale. Sammeln Sie die Muskeln der Hinterbeine in einer 6 cm langen Schale, die auf Eis gehalten wird.
HINWEIS: Vermeiden Sie nach Möglichkeit die Beschädigung von Blutgefäßen, um die Bildung von Blutklumpen zu verhindern, die die nachgeschaltete Isolierung beeinträchtigen könnten. Wenn Blutungen auftreten, tupfen Sie das ausgeschnittene Gefäß sofort mit einer sterilen Gaze ab, um das Blut zu absorbieren. - Sammeln Sie TA, EDL, Gastrocnemius, Soleus, Quadrizep und Oberschenkelmuskulatur von der kontralateralen Extremität.
HINWEIS: Wenn Sie die gesamte Hinterbeinmuskulatur isolieren, sammeln Sie nicht zwei oder mehr Mäuse. Bei der Isolierung von TA-Muskeln können bis zu drei TA-Muskeln gepoolt werden.
3. Mechanische und enzymatische Muskelverdauung
- WM aus der 6 cm Schale absaugen und 1-2 ml MDB hinzufügen, um die Muskeln feucht zu halten.
- Zerkleinern Sie die Muskeln gründlich, bis Sie eine Aufschlämmungspaste aus gut gehacktem Gewebe erhalten. Verwenden Sie dazu eine Pinzette, um ein Ende eines Muskelstücks zu halten, und verwenden Sie dann ein Skalpell, um den Muskel zu reißen und zu schneiden, bis er weniger fest ist.
- Schneiden Sie den Muskel mit einer Schere für 1-2 Minuten in kleine Stücke. Wiederholen Sie diesen Schritt für jede Muskelgruppe, bis Sie einen gut gehackten Muskelschlamm erhalten.
HINWEIS: Dies ist ein sehr kritischer Schritt, um die Ausbeute von FAPs und MuSCs zu maximieren. Es wird empfohlen, 8-10 Minuten (4-5 Minuten, wenn nur TA-Muskeln isoliert werden) in diesem Schritt zu verbringen, um ein ordnungsgemäßes Muskelzerkleinern zu gewährleisten. - Übertragen Sie die gehackten Muskeln von jeder Maus in die konische Röhre, die MDB enthält.
- Die Röhrchen mit Laborfolie verschließen und in einem 37 °C heißen Wasserbad mit Rühren (75 U/min) 1 h inkubieren. Platzieren Sie die Rohre horizontal entlang des Schüttelpfades und verwenden Sie Gewichte, um die Rohre in Wasser zu tauchen.
- 1 ml Kollagenase II-Brühe und 1 ml Dispase-Brühe pro Maus auftauen. Vor Gebrauch den Dispase-Schaft in einem schwingenden Schaufelrotor bei 10.000 x g für 1 min bei 4 °C drehen. Verwenden Sie nur den Überstand.
- Wenn die gesamte Hinterbeinmuskulatur gesammelt wurde, gehen Sie wie folgt vor:
- Nach 1 h das Röhrchen aus dem Shaker nehmen und auf 50 ml mit WM füllen.
- Zentrifugieren Sie die Zellen in einem Schaufelrotor bei 250 x g für 5 min bei 4 °C. Übertragen Sie 42 mL Überstand in zwei neue Röhrchen (~ 21 ml in jeder Röhre) und lassen Sie ~ 8 ml in der ursprünglichen Röhre.
- Füllen Sie die neuen Röhrchen mit 21 mL des Überstands bis 50 mL mit WM. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut in einem schwingenden Schaufelrotor bei 350 x g für 8 min bei 4 °C. Saugen Sie den gesamten Überstand ab und halten Sie die Pellets auf Eis.
- Fügen Sie 1 ml Kollagenase II-Brühe und 1 ml Dispase-Brühe in das Originalröhrchen mit ~ 8 ml MDB hinzu.
- Verwenden Sie eine 5 ml serologische Pipette, resuspendieren Sie das Pellet 10 mal, ohne zu verstopfen. Werfen Sie die Lösung in Richtung der Rohrwand aus und vermeiden Sie die Bildung von Blasen. Wenn während der Resuspension eine Verstopfung auftritt, drücken Sie die Spitze der Pipette gegen den Boden des Röhrchens, um die Muskelbrocken mechanisch zu stören. Fahren Sie mit Schritt 3.9 fort.
- Wenn TA-Muskeln gesammelt wurden, gehen Sie wie folgt vor:
- Nach 1 h die Tube aus dem Shaker nehmen und auf 15 mL mit WM füllen.
- Zentrifugieren Sie die Zellen in einem Schaufelrotor bei 250 x g für 5 min bei 4 °C. Übertragen Sie 13 mL Überstand in ein neues 15 ml Röhrchen und lassen Sie ~ 2 ml in der ursprünglichen Röhre.
- Füllen Sie das neue Röhrchen mit 13 mL des Überstands bis zu 15 mL mit WM. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut in einem schwingenden Schaufelrotor bei 350 x g für 8 min bei 4 °C. Saugen Sie den gesamten Überstand ab und halten Sie das Pellet auf Eis.
- Resuspendieren Sie das Pellet im Originalrohr mit einer 1000-μL-Pipettenspitze nach oben und unten, ohne zu verstopfen.
- Fügen Sie 1 ml Kollagenase II-Brühe und 1 ml Dispase-Brühe in das Originalröhrchen mit 2 ml MDB hinzu und füllen Sie bis zu 10 ml mit WM. Fahren Sie mit Schritt 3.9 fort.
- Die Röhrchen mit Laborfolie verschließen und in einem 37 °C warmen Wasserbad mit Rühren (75 U/min) für 30 min inkubieren. Platzieren Sie die Röhrchen wie in Schritt 3.5.
4. Erzeugung von einkernigen Zellen
HINWEIS: Wenn Sie mit TA-Muskeln arbeiten, die in einem konischen 15-ml-Schlauch gesammelt wurden, geben Sie die Suspension in ein 50-ml-konisches Röhrchen, bevor Sie mit Schritt 4.1 fortfahren.
- Nach 30 min das Röhrchen aus dem Shaker nehmen. Die Muskelsuspension 10 Mal erfolgreich durch eine 10-ml-Spritze mit einer 20-G-Nadel absaugen und auswerfen.
HINWEIS: Werfen Sie die Muskelsuspension in Richtung der Wand des Röhrchens, um Blasen und Schaumbildung zu vermeiden. Kleine Stücke unverdauter Sehnen oder Knorpel können die Nadel während der ersten Aspirationsrunden verstopfen. Wenn eine Verstopfung auftritt, verwenden Sie eine sterile Pinzette, um die Verstopfung von der Nadelspitze zu entfernen. - Füllen Sie jede Tube bis zu 50 ml mit WM und invertieren Sie sie einige Male vorsichtig, um das Mischen sicherzustellen.
- Zentrifugieren Sie die Zellen in einem Schaufelrotor bei 250 x g für 5 min bei 4 °C. Überstand in eine neue Röhre (~ 42 ml) überführen und ~ 8 ml in der ursprünglichen Röhre belassen.
- Füllen Sie das neue Röhrchen mit 42 mL des Überstands bis zu 50 mL mit WM. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut in einem Schaufelrotor bei 350 x g für 8 min bei 4 °C. Saugen Sie den gesamten Überstand ab und halten Sie das Pellet auf Eis.
- Legen Sie ein 40 μm Nylonzellsieb in das originale 50 ml konische Röhrchen mit 8 mL WM und befeuchten Sie das Zellsieb mit 1-2 ml WM.
- Während Sie das 40-μm-Nylonzellensieb halten, verwenden Sie eine 10-ml-Pipette, um das Pellet 5-10 Mal vorsichtig zu resuspendieren. Filtern Sie die Pellets durch das Zellsieb zurück in dasselbe Röhrchen, um den Zellverlust zu minimieren.
- Stellen Sie bei diesem Schritt sicher, dass sich zusätzliche Röhrchen mit Zellpellets auf Eis befinden. Filtern Sie diese Pellets zurück in das Originalrohr, indem Sie 4-5 ml WM zu jedem Röhrchen hinzufügen, um die Pellets zu resuspendieren und die Lösung auf das Zellsieb im Originalröhrchen zu übertragen. Filtern nach Schwerkraft zulassen.
- Nachdem Sie alle Pellets in das ursprüngliche 50-ml-Konikenröhrchen gesammelt haben, spülen Sie das Zellsieb mit weiteren 4-5 ml WM ab. Verwenden Sie eine 1000-μL-Pipette, um die gesamte Flüssigkeit von der Unterseite des Zellsiebs zu sammeln.
- Füllen Sie jede Tube mit WM bis zu 50 ml und invertieren Sie sie einige Male vorsichtig, um das Mischen sicherzustellen.
- Zentrifugieren Sie die Zellen in einem Schaufelrotor bei 250 x g für 5 min bei 4 °C. Saugen Sie sofort den gesamten Überstand nach der Zentrifugation ab, ohne das Pellet zu stören.
- Resuspendieren Sie das Pellet in 600 μL WM und geben Sie es in ein 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
5. Antikörperfärbung für die Durchflusszytometrie
HINWEIS: Richten Sie für jedes Experiment die folgenden Kontrollen ein: i) ungefärbte Kontrolle, ii) Lebensfähigkeitskontrolle zur Auswahl für die lebende Zellpopulation, iii) Einzelgefärbte Kompensationskontrollen zur Korrektur von Fluorochromemissions-Spillover und iv) Fluoreszenz-minus eins-Kontrollen (FMO) zur Festlegung von Gating-Grenzen unter Berücksichtigung der Spillover-Ausbreitung. Eine vollständige Liste der Färbekontrollen finden Sie in Tabelle 1 .
- Zur Vorbereitung einer ungefärbten Kontrolle werden 10 μL der Zellsuspension in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 190 μl WM überführt. Resuspendieren Sie die Zellsuspension und filtern Sie durch ein 5-ml-Polystyrol-Rundbodenrohr mit einer 35-μm-Zellsiebkappe. Lassen Sie die Suspension nach Schwerkraft filtern.
- Verwenden Sie eine 200-μL-Pipette, um die gesamte Flüssigkeit von der Unterseite des Zellsiebs zu sammeln. Verschließen Sie es mit einer Kappe und lassen Sie es vor Licht geschützt auf Eis.
- Bereiten Sie Lebensfähigkeits-, FMO- und Einzelfärbekontrollen vor: Kennzeichnen Sie 10 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie 190 μL WM in jedes Röhrchen und 10 μL Zellsuspension hinzu. Eine vollständige Liste der Steuerelemente finden Sie in Tabelle 1 . Fügen Sie dem entsprechenden Röhrchen je nach experimenteller Kontrolle Antikörper hinzu. Informationen zur Antikörperkombination und -konzentration finden Sie in Tabelle 1 .
- Der Rest der Zellsuspension (500 μL) wird in ein 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen (Versuchsröhrchen) überführt und folgende Antikörper hinzugefügt: CD31-APC, CD45-APC, Sca1-Pacific Blue, VCAM-1-biotin und α7-Integrin-PE. Informationen zur Antikörperkombination und -konzentration finden Sie in Tabelle 1 .
- Mischen Sie jedes Röhrchen vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten, und inkubieren Sie die Zellen in einem rotierenden Shaker bei 4 °C für 45 min vor Licht geschützt.
- Nach 45 min füllen Sie alle Mikrozentrifugenröhrchen bis 2 ml mit WM. Drehen Sie die Röhrchen einige Male vorsichtig um, um eine vollständige Mischung zu gewährleisten. Zentrifugieren Sie die Röhrchen in einer Kühlzentrifuge mit einem Festwinkelrotor bei 250 x g für 5 min bei 4 °C. Saugen Sie den Überstand ab, ohne das Pellet zu stören.
- Resuspendieren Sie die Zellen in allen Mikrozentrifugenröhrchen in 300 μL WM.
- Geben Sie Streptavidin-Antikörper in geeignete Röhrchen. Informationen zur Antikörperkombination und -konzentration finden Sie in Tabelle 1 . Mischen Sie jedes Röhrchen vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten, und inkubieren Sie die Zellen in einem rotierenden Shaker bei 4 °C für 20 Minuten vor Licht geschützt. Lassen Sie die restlichen Röhren lichtgeschützt auf Eis.
- Nach 20 min füllen Sie Mikrozentrifugenröhrchen mit Streptavidin-Antikörpern auf 2 ml mit WM. Drehen Sie die Röhrchen einige Male vorsichtig um, um eine vollständige Mischung zu gewährleisten. Zentrifugieren Sie die Röhrchen in einer Kühlzentrifuge mit einem Festwinkelrotor bei 250 x g für 5 min bei 4 °C. Saugen Sie den Überstand vollständig ab und resuspendieren Sie die Zellen in 300 μL WM.
- Die 35-μm-Zellsiebkappe aus 10 5-ml-Polystyrol-Rundbodenrohren mit 200 μL WM vorbenetzen. Filterzellen aus Steuerrohren durch die entsprechenden 5-ml-Polystyrol-Rundbodenrohre. Verwenden Sie eine 200-μL-Pipette, um die gesamte Flüssigkeit von der Unterseite des Zellsiebs zu sammeln. Verschließen Sie mit Kappen, lassen Sie die Röhrchen auf Eis und schützen Sie sie vor Licht.
- Resuspendieren Sie die Zellen im Versuchsröhrchen mit zusätzlichen 200 μL WM für insgesamt 500 μL WM. Befeuchten Sie eine Zellsiebkappe aus einem 5-ml-Polystyrol-Rundbodenrohr mit 200 μL WM. Die Zellsuspension wird aus dem Versuchsröhrchen in das 5-ml-Polystyrol-Rundbodenrohr überführt und durch die Schwerkraft filtrieren lassen.
- Spülen Sie das 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit der experimentellen Probensuspension mit 300 μL WM aus und führen Sie es durch dieselbe Siebkappe. Verwenden Sie eine 200-μL-Pipette, um die gesamte Flüssigkeit von der Unterseite des Zellsiebs zu sammeln. Verschließen Sie mit einer Kappe, lassen Sie die Röhrchen auf Eis und schützen Sie sie vor Licht.
HINWEIS: Wenn die 35-μm-Zellsiebkappe verstopft ist, klopfen Sie vorsichtig auf das Rohr auf dem Tisch, um den Durchfluss zu erleichtern. - Bereiten Sie die Sammelröhrchen für FAPs und MuSCs vor und beschriften Sie sie. Wenn Sie Zellen aus der gesamten Hintergliedmaßenmuskulatur isolieren, sortieren Sie die Zellen in 5 ml Polypropylen-Rundbodenröhrchen mit bis zu 1 ml FAPs oder MuSCs Kulturmedium, ergänzt mit 2x Serum. Wenn Sie Zellen aus TA-Muskeln isolieren, sortieren Sie FAPs und MuSCs in 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit bis zu 400 μL Kulturmedium, ergänzt mit 2x Serum.
6. Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)
HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet ein kompaktes Tisch-Forschungsdurchflusszytometer, das mit einer 100-μm-Düse ausgestattet ist und über eine Drei-Laser-Konfiguration (488 nm, 640 nm, 405 nm) verfügt, mit der Fähigkeit, bis zu neun verschiedene Fluorochrome (11 Parameter einschließlich der Vorwärts- und Seitenstreuung) zu analysieren. Die in diesem Protokoll verwendeten Fluorochrome und die zugehörigen Detektorbandpassfilter lauten wie folgt: PE 586/42; PE-Cy7 783/56; APC 660/10; Pacific Blue 448/45; 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) 700/54, GFP 527/32. Die Zellen werden bei 4 °C sortiert und bleiben nach der Sortierung auf Eis. Stellen Sie vor der Inbetriebnahme dieses Geräts sicher, dass der Benutzer von einem technischen Anwendungsspezialisten ordnungsgemäß geschult wird.
- Einrichtung und Leistungsprüfung des Zellsortierers nach Herstellerangaben.
- Richten Sie eine hierarchische Gating-Strategie ein, um FAPs und MuSCs zu identifizieren (Abbildung 2).
- Isolierung von FAPs basierend auf dem folgenden Schema: i) Vorwärtszellstreufläche vs. Seitenzellstreufläche (FSC-A vs. SSC-A) zur Trennung von Zellen versus Trümmern, ii) Seitenzellenstreuhöhe vs. Seitenzellenstreubreite (SSC-H vs. SSC-W) zur Unterscheidung von Sinsingeln von Dubletten im SSC-Bereich, iii) Vorwärtszellstreuhöhe vs. Vorwärtszellstreubreite (FSC-H vs. FSC-W) zur Unterscheidung von Singuletten im FSC-Bereich, und iv) 7-AAD-Bereich vs SSC-A, um lebende von toten Zellen zu unterscheiden.
- Wenn Sie FAPs durch die Antikörper-basierte Methode isolieren, verwenden Sie das folgende Schema: v) APC-CD45/CD31-Bereich vs Pacific Blue-Ly-6A/E (Sca1) Bereich, um CD31+ und CD45+ Zellen von der weiteren Analyse auszuschließen, und vi) PE-Cy7-VCAM-1 Bereich vs PE-α7-Integrin Bereich von der CD31-/CD45-/Sca1+ Population zur Unterscheidung von FAPs. FAPs werden als CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin- Ereignisse identifiziert.
- Wenn Sie FAPs durch endogene GFP-Reportermethode isolieren, verwenden Sie das folgende Schema: v) APC-CD45/CD31-Bereich vs. GFP-PDGFRα-Bereich, um CD31+- und CD45+-Zellen von der weiteren Analyse auszuschließen und GFP+-Zellen zu isolieren. FAPs werden als CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin- Ereignisse identifiziert.
- Isolierung von MuSCs basierend auf dem folgenden Schema: i) Vorwärtszellstreufläche vs. Seitenzellstreufläche (FSC-A vs. SSC-A) zur Trennung von Zellen versus Trümmern, ii) Seitenzellenstreuhöhe vs. Seitenzellenstreubreite (SSC-H vs. SSC-W) zur Unterscheidung von Sinsingeln von Dubletten im SSC-Bereich, iii) Vorwärtszellstreuhöhe vs. Vorwärtszellstreubreite (FSC-H vs. FSC-W) zur Unterscheidung von Einzellingen aus Dubletten im FSC-Bereich, iv) 7-AAD-Bereich vs SSC-A, um lebende vs. tote Zellen zu unterscheiden, v) APC-CD45/CD31-Bereich vs Pacific Blue-Ly-6A/E (Sca1) Bereich, um CD31+ und CD45+ Zellen von der weiteren Analyse auszuschließen, und vi) PE-Cy7-VCAM-1 Bereich vs PE-α7-Integrin Bereich von der CD31-/CD45-/Sca1-Population zur Unterscheidung von MuSCs. MuSCs werden als CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+-Ereignisse identifiziert.
- Isolierung von FAPs basierend auf dem folgenden Schema: i) Vorwärtszellstreufläche vs. Seitenzellstreufläche (FSC-A vs. SSC-A) zur Trennung von Zellen versus Trümmern, ii) Seitenzellenstreuhöhe vs. Seitenzellenstreubreite (SSC-H vs. SSC-W) zur Unterscheidung von Sinsingeln von Dubletten im SSC-Bereich, iii) Vorwärtszellstreuhöhe vs. Vorwärtszellstreubreite (FSC-H vs. FSC-W) zur Unterscheidung von Singuletten im FSC-Bereich, und iv) 7-AAD-Bereich vs SSC-A, um lebende von toten Zellen zu unterscheiden.
- Führen Sie die Kontrolle der ungefärbten Kontrolle und Lebensfähigkeit durch, um sicherzustellen, dass die Zellpopulation im SSC-A vs. FSC-A-Diagramm richtig positioniert ist, und um lebende Einzelzellen ordnungsgemäß zu treffen.
- Erfassen Sie alle einzelnen gefärbten Kontrollen und generieren Sie die Spillover-Kompensationsmatrix.
- Führen Sie alle FMO-Kontrollen durch und bestimmen Sie den Grenzwert zwischen der Hintergrundfluoreszenzausbreitung und der positiv gefärbten Population.
- Etwa 5-10 Minuten vor der Entnahme der experimentellen Probe 7-AAD-Lebensfähigkeitsfarbstoff hinzufügen und vorsichtig mischen.
- Sobald alle Kontrollen verarbeitet wurden, setzen Sie die Sortiertore entsprechend den FMO-Kontrollen. Erfassen und sortieren Sie die experimentellen Proben.
- Nachdem alle Proben verarbeitet wurden, reinigen Sie das Zytometer gemäß den Angaben des Herstellers. Exportieren Sie alle .fcs-Daten zur Analyse.
7. Kultur der FAPs und MuSCs
HINWEIS: Sortierte Zellen sollten unmittelbar nach der Sortierung in einem geeigneten Medium auf mit Kollagen I beschichteten Platten kultiviert werden.
- Zentrifugieren Sie die Sammelröhrchen in einem Festwinkelrotor bei 250 x g für 5 min bei 4 °C.
- Saugen Sie den Überstand ab, ohne das Zellpellet zu stören.
- Für die MuSC-Kultur werden die Zellen in einem geeigneten Volumen MuSC-Kulturmedium resuspendiert und unter Standardbedingungen bei 37 °C und 5%CO2 inkubiert.
- Plate frisch isolierte MuSCs mit einer Dichte von 20.000 Zellen/cm2 und aktivierte MuSCs mit einer Dichte von 15.000 Zellen/cm2.
- Nach der Beschichtung erscheinen die Zellen klein, kugelförmig und durchscheinend. Innerhalb von 36 h haften MuSCs an der Oberfläche der Platte und vergrößern sich langsam für die ersten 48 h.
- Tauschen Sie das Medium alle 2 Tage aus.
HINWEIS: MuSCs reagieren sehr empfindlich auf die Zelldichte. Um MuSCs in ihrem wuchernden Zustand zu halten, züchten Sie sie, bis sie 60% -70% konfluierend sind. Geben Sie die Zellen in neues Kollagen, mit dem ich beschichtetes Geschirr oder Teller überzog, und fügen Sie alle 2 Tage ein neues frisches Medium hinzu. Wenn MuSCs länger als 3-4 Tage in derselben Schale oder Platte aufbewahrt werden, erhalten sie eine längliche Form und richten sich mit benachbarten Zellen aus, bis sie miteinander verschmelzen.
- Für die FAP-Kultur resuspendieren Sie die Zellen in einem geeigneten Volumen MuSC-Kulturmedium und inkubieren sie unter Standardbedingungen bei 37 °C und 5% CO2.
- Die FAPs, die aus ungestörten Muskeln isoliert wurden, werden mit einer Dichte von 15.000 Zellen /cm2 und FAPs, die aus verletzten Muskeln isoliert wurden, mit einer Dichte von 9.000 Zellen / cm2 verkleidet.
HINWEIS: Nach der Beschichtung haften FAPs innerhalb von 48 h vollständig an der Oberfläche der Platte, während aktivierte FAPs innerhalb weniger Stunden an der Platte haften. Sobald sie befestigt sind, erhalten FAPs ihre charakteristische Form mit einem kleinen Zellkörper und länglichen Zellfortsätzen und vermehren sich schnell. - Tauschen Sie das Medium alle 2 Tage aus.
HINWEIS: FAPs reagieren sehr empfindlich auf die Zelldichte. Die Aussaat von FAPs bei niedrigen Dichten kann zu schlechtem Zellwachstum und Zelltod führen. Im Gegenteil, die Beschichtung von FAPs mit hoher Seeding-Dichte erhöht das Überleben der Zellen und verbessert ihre Ausdehnung. FAPs, die von geschädigten Muskeln herrühren, erfordern in der Regel eine geringere Zelldichte als unbeschädigte Muskeln, da sie bereits aktiviert sind. Es wird empfohlen, die FAP-Beschichtungsdichte basierend auf den Versuchsbedingungen und der Quelle der Proben anzupassen.
- Die FAPs, die aus ungestörten Muskeln isoliert wurden, werden mit einer Dichte von 15.000 Zellen /cm2 und FAPs, die aus verletzten Muskeln isoliert wurden, mit einer Dichte von 9.000 Zellen / cm2 verkleidet.
- Für die Kokultur werden FAPs und MuSCs im Kokulturmedium im Verhältnis 1:1 resuspendiert und unter Standardbedingungen bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Lassen Sie die Zellen für 48 h anheften und ersetzen Sie das Medium alle 2 Tage.
8. Immunfluoreszenzanalyse von kultivierten FAPs und MuSCs
- Saugen Sie das Zellmedium ab und führen Sie zwei oder drei Wäschen mit 1x PBS durch.
- Fixieren Sie die Zellen mit 2% Paraformaldehyd (PFA) in 1x PBS für 15 min bei RT.
- 2% PFA absaugen und die Zellen zwei- bis dreimal mit 1x PBS waschen.
- Führen Sie Zellpermeabilisierung und -blockierung durch:
- Für die Immunfärbung von frisch isolierten FAPs führen Sie eine Zellpermeabilisierung und -blockierung durch, indem Zellen mit 1x PBS + 0,1% Triton X-100 (PBST) + 1% Rinderserumalbumin (BSA) + 5% normalem Eselserum (NDS) für 30 min bei RT inkubiert werden.
- Für die Immunfärbung von frisch isolierten MuSCs führen Sie eine Zellpermeabilisierung und -blockierung durch, indem Zellen mit PBST + 1% BSA + 5% normalem Ziegenserum (NGS) für 30 Minuten bei RT inkubiert werden.
- Primäre Antikörper anwenden:
- Zur Immunfärbung von frisch isolierten FAPs Ziegenanti-PDGFRα-Primärantikörper (1:300) verdünnt in PBST + 1% BSA + 5% NDS über Nacht bei 4 °C auftragen.
- Zur Immunfärbung von frisch isolierten MuSCs 45 min bei RT einen primären Mausanti-Pax7-Antikörper (1:10) verdünnt in PBST + 1% BSA + 5% NGS auftragen.
- Waschen Sie die Zellen zwei- oder dreimal mit 1x PBS, um die primäre Antikörperlösung zu entfernen.
- Sekundäre Antikörper anwenden:
- Zur Immunfärbung von frisch isolierten FAPs Esel Anti-Ziegen-IgG (H+L) Alexa Fluor 488 sekundärer Antikörper (1:500) verdünnt in PBST + 1% BSA für 1 h bei RT auftragen.
- Für die Immunfärbung von frisch isolierten MuSCs Ziegen-Anti-Maus-IgG 1 Alexa Fluor 555 sekundärer Antikörper (1:500) verdünnt in PBST +1 % BSA für 45 min bei RT auftragen.
- Waschen Sie die Zellen zwei- oder dreimal mit 1x PBS, um die primäre Antikörperlösung zu entfernen.
- Führen Sie eine nukleare Gegenfärbung durch, indem Sie Zellen mit DAPI in PBST (1:1000) für 5 min bei RT inkubieren.
- Waschen Sie die Zellen dreimal mit 1x PBS, um die DAPI-Lösung zu entfernen.
VORSICHT: DAPI ist giftig und gefährlich; Behandeln Sie es vorsichtig und entsorgen Sie es in der Sondermüllflasche. - Lagern Sie die Zellen lichtgeschützt bei 4 °C.
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Representative Results
Dieses Protokoll ermöglicht die Isolierung von etwa einer Million FAPs und bis zu 350.000 MuSCs aus unverletzten Hinterbeinen erwachsener Wildtyp-Mäuse (3-6 Monate), was einer Ausbeute von 8% für FAPs und 3% für MuSCs von Gesamtereignissen entspricht. Bei der Sortierung von Zellen aus beschädigter TA 7 Tage nach der Verletzung werden zwei bis drei TA-Muskeln gepoolt, um bis zu 300.000 FAPs und 120.000 MuSCs zu erhalten, was einer Ausbeute von 11% bzw. 4% entspricht. Die Reinheitswerte nach der Sortierung liegen bei FAPs und MuSCs in der Regel über 95%.
Die Gating-Strategie zur Isolierung von FAPs und MuSCs ist in Abbildung 2 dargestellt. Zunächst werden Zellpopulationen von Interesse identifiziert, indem ein Vorwärtsstreuungs- (FSC) versus Seitenstreudichtediagramm (SSC) erstellt wird, das ein gewisses Maß an zellulärer Identifizierung basierend auf zellmorphologischen Eigenschaften ermöglicht. Diese Gating-Strategie wird auch verwendet, um kleine zelluläre Trümmer auszuschließen, die sich normalerweise in der unteren linken Ecke des FSC-vs-SSC-Diagramms befinden. Die Zellen werden weiter eingezäunt, um Dubletten basierend auf FSC- und SSC-Höhen- und Breitensignalen auszuschließen, und die resultierenden Singulettzellen werden dann mit 7-AAD gefärbt, um ihre Lebensfähigkeit zu bewerten. Lebende Zellen werden weiter auf Sca1- und CD31/CD45-Expression untersucht, um Lineage-positive Zellen von der weiteren Analyse auszuschließen. Lineage negative Sca1 negative Singlets werden dann für VCAM-1 und α7-Integrin gefärbt, um FAPs und MuSCs zu unterscheiden. FAPs werden als CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin- Zellen und MuSCs als CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+ Zellen identifiziert. Alternativ werden lebende Zellen auch für CD31/CD45 und GFP-PDGFRα eingezäunt, um FAPs zu unterscheiden. FAPs werden als CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin- Zellen identifiziert.
Dieses Protokoll stellt zwei Gating-Strategien zur Isolierung der FAP-Population vor: entweder durch Verwendung eines endogenen PDGFRα-EGFP-Reporters oder durch Zellfärbung mit einem Sca1-Antikörper. Die PDGFRα-EGFP-Knock-in-Reportermäuse (B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J)18 exprimieren das H2B-eGFP-Fusionsgen aus dem endogenen PDGFRα-Locus, was eine effiziente und spezifische Markierung der PDGFRα-Linie ermöglicht (Abbildung 3A). Diese Mauslinie wurde früher verwendet, um Pdgfrα+ FAPs zu isolieren und ist in der Tat sehr hilfreich für die Isolierung von FAPs, da der GFP-Reporter ein gut sichtbares und spezifisches Signalliefert 19. Alternativ beschreibt dieses Protokoll eine Sca1-basierte Isolationsmethode zur Identifizierung von FAPs. Sca1 (Ly-6A / E) wird häufig verwendet, um FAPs in der Muskelvorbereitung zu identifizieren und zu isolieren13,16,17. Sca1 ist ein 18-kDa Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-verknüpftes Protein, das Mitglied der Ly-6-Familie20 ist. Neben der Expression auf der Zelloberfläche mesenchymaler Vorläufermuskelzellen wird die Sca1-Expression jedoch auch in hämatopoetischen Stammzellen (HSZ) sowie in reifen Leukozyten und T-Zellen beobachtet. In diesem Protokoll bestätigten wir die Eignung von Sca1 als FAPs-Marker durch die Durchführung von FACS-basierten Linienverfolgungsstudien. Insbesondere wurden PDGFRα-EGFP-Mäuse eingesetzt, um Sca1+/GFP-exprimierende FAPs in Populationen von einkernigen Zellen zu isolieren. Wir fanden heraus, dass alle GFP-exprimierenden Zellen auch positiv für Sca1 und negativ für CD31, CD45, VCAM-1 und α7-Integrin waren (Abbildung 4). Diese Analyse bestätigte die Verwendung von Sca1-Antikörpern als Marker für FAPs sowohl in ruhenden als auch in aktivierten FAPs und bietet Mittel für die undeutliche Verwendung beider Strategien zur Isolierung von FAPs.
In diesem Protokoll wurden FAPs und MuSCs auch von erwachsenen Mäusen isoliert, die 7 Tage nach der Verletzung mit intramuskulären Injektionen von Notexin verletzt wurden (Abbildung 5). Nach einer Verletzung aktivieren und vermehren sich MuSCs und FAPs in vivo und erreichen den Höhepunkt der Proliferation zwischen Tag 3 und 4 2,3. Diese Veränderungen in der Proliferation spiegeln sich in einem Anstieg des Prozentsatzes von Sca1/PDFGRα- sowie VCAM-1/α7-Integrin-positiven Zellen wider. Abbildung 6 zeigt die Quantifizierung von FAPs und MuSCs in TAs ohne Verletzung und 7 Tage nach der Verletzung; Obwohl der Höhepunkt der Proliferation zwischen den Tagen 2 und 3 nach der Verletzung beobachtet wird, ist eine geringe Rate proliferierender Zellen 7 Tage nach der Verletzung immer noch spürbar. Wenn MuSCs aktiviert werden, gibt es eine deutliche Zunahme ihrer Zellgröße21,22. Daher ist es bei der Isolierung dieser Zellen durch FACS von entscheidender Bedeutung, die FSC-A- und SSC-A-Parameter anzupassen und das Gate so zu erweitern, dass es diese Zellen in der Mitte einschließt (Abbildung 5A).
Die Reinheit der isolierten Zellpopulationen wurde durch Immunfärbung von kokultivierten GFP+ FAPs und MuSCs mit Pax7-Antikörpern bestätigt. Frisch isolierte GFP+ FAPs und MuSCs wurden für 48 h im Verhältnis 1:1 kokultiviert (Abbildung 3B). GFP+ FAPs exprimierten keinen Pax7-Marker, während MuSCs mit diesem Antikörper reagierten. Somit ist die Lin-/Sca-1+/VCAM-1-/α7-Integrin- und Lin-/Sca-1-/VCAM-1+/α7-Integrin+ Gating-Strategie effektiv bei der Isolierung reiner Populationen von FAPs bzw. MuSCs.
Abbildung 1: Grafische Übersicht der FAP- und MuSC-Isolierung. Grafische Übersicht, die die FAP- und MuSC-Isolierung von den Hintergliedmaßenmuskeln zeigt. Das Protokoll gilt auch für Zellen, die aus TA-Muskeln isoliert wurden. Zuerst werden die Muskeln gesammelt und mechanisch zerkleinert, bevor sie einer enzymatischen Verdauung unterzogen werden. Die Muskelmischung wird dann durch eine 20-G-Nadel verarbeitet und filtriert, um eine Suspension von einkernigen Zellen zu erhalten. Die Zellen werden dann mit einem Cocktail aus fluorophorkonjugierten Antikörpern inkubiert und durchlaufen schließlich einen Zellsortierer, um eine reine Population von FAPs und MuSCs zu isolieren. Reine Zellpopulationen werden dann für die nachgeschaltete Anwendung aufbereitet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Repräsentatives FACS-Profil ruhender FAPs und MuSCs. (A-H) Gating-Strategie zur Isolierung von FAPs und MuSCs. (A) Zunächst werden die Proben so geschlossen, dass zelluläre Trümmer und (B,C)-Dubletten basierend auf SSC- und FSC-Eigenschaften ausgeschlossen werden. (D) Die resultierenden Einzelzellen werden dann mit 7-AAD angefärbt, um ihre Lebensfähigkeit zu bewerten. (E) 7-AAD-negative Einzelzellen werden dann für APC-CD31/CD45 und Pacific Blue-Sca1 untersucht, um Lineage-positive Zellen von der weiteren Analyse auszuschließen. (F,G) Lineage negative Singlets werden dann für PE-Cy7-VCAM-1 und PE-α7-Integrin gefärbt. (F) FAPs werden als CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin- Zellen und (G) MuSCs als CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+-Zellen identifiziert. (H) FAPs-Isolierung in PDGFRα-EGFP-Mäusen mit einem GFP-Reporter. (I-M) FACS-Profil für FMO-Kontrollen (Fluorescence Minus One) zum Nachweis einer ordnungsgemäßen Kompensation und Ansteuerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Validierung der FAP- und MuSC-Zellkultur. (A) Frisch isolierte FAPs, die GFP exprimieren, wurden plattiert und mit einem PDGFRα-Antikörper co-gefärbt. Kerne wurden mit DAPI gefärbt. Zusammengeführte Bilder der GFP- (grün), PDGFRα- (rot) und DAPI-Färbung (blau) werden angezeigt. Maßstabsbalken, 25 μm. (B) Frisch isolierte FAPs (grün) und MuSCs wurden für 48h kokultiviert und mit Pax7 (rot) gefärbt. Kerne wurden mit DAPI gefärbt. GFP-exprimierende FAPs exprimieren Pax7 nicht, während MuSCs ausschließlich Pax7 exprimieren und nicht positiv für GFP sind, was die Reinheit beider sortierter Populationen bestätigt. Maßstabsbalken, 75 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: PDGFRα-EGFP-Mäuse und Sca1-Expression markieren spezifisch FAPs in erwachsenen Mäusen. FAPs werden als GFP+/Sca1+-Zellen isoliert. 7-AAD-negative Einzelzellen werden für APC-CD31/CD45 und GFP-PDGFRα bewertet, um Lineage-positive Zellen auszuschließen und FAPs zu unterscheiden. Lineage negative/Sca1-positive Zellen werden für PE-Cy7-VCAM-1 und PE-α7-Integrin gefärbt, um MuSCs auszuschließen. FAPs werden als CD31-/CD45-/PDGFRα+/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-Zellen identifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Repräsentatives FACS-Profil aktivierter FAPs und MuSCs. (A-H) Gating-Strategie zur Isolierung aktivierter FAPs und MuSCs. (A) Die Proben werden eingezäunt, um Zelltrümmer auszuschließen, indem ein FSC-A- vs. SSC-A-Dichtediagramm erstellt wird. Beachten Sie das vergrößerte Tor, um die Bevölkerung von Interesse unterzubringen. (B,C) Die Proben werden weiter eingezäunt, um Dubletten basierend auf SSC- und FSC-Eigenschaften zu eliminieren. (D) Die resultierenden Einzelzellen werden dann mit 7-AAD angefärbt, um ihre Lebensfähigkeit zu bewerten. (E) 7-AAD-negative Einzelzellen werden dann für APC-CD31/CD45 und Pacific Blue-Sca1 untersucht, um Lineage-positive Zellen von der weiteren Analyse auszuschließen. (F,G) Lineage negative Singlets werden dann für PE-Cy7-VCAM-1 und PE-α7-Integrin gefärbt. (F) FAPs werden als CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-Zellen und (G) MuSCs als CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-integrin+-Zellen identifiziert. (H) FAPs-Isolierung in PDGFRα-EGFP-Mäusen mit einem GFP-Reporter. (I-M) FACS-Profil für FMO-Kontrollen (Fluorescence Minus One) zum Nachweis einer ordnungsgemäßen Kompensation und Ansteuerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Quantifizierung von FAPs und MuSCs in ungestörten und verletzten TAs. Quantifizierung von FAPs und MuSCs in unverletzten und 7 Tage nach der Verletzung TA-Muskeln. Die Zellzählung wurde durchgeführt, indem die Anzahl der nach mg gesammelten Muskeln sortierten Zellen geteilt wurde. ** P < 0,01 zwischen Unverletzten und Verletzten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| 7-AAD (μg/ml) |
CD31/CD45-APC (μg/ml) |
Sca1-Pacific Blau (μg/ml) |
α 7-Integrin-PE (μg/ml) |
VCAM-1-Biotin (μg/ml) |
PE-Cy7 Streptavidin (μg/ml) |
||
| Ungefärbte Kontrolle | |||||||
| Einzeln gefärbte Kontrollen | |||||||
| 7-AAD (Viability Control) | 1 | ||||||
| CD31/CD45 | 2 | ||||||
| Sca1 | 5 | ||||||
| α7-Integrin | 0.4 | ||||||
| VCAM-1 | 5 | 2 | |||||
| FMO-Steuerungen | |||||||
| FMO 7 AAD | 2 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO CD31/CD45 | 1 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO Sca1 | 1 | 2 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO α7-Integrin | 1 | 2 | 5 | 5 | 2 | ||
| FMO VCAM-1 | 1 | 2 | 5 | 0.4 | |||
| Versuchsprobe | |||||||
| Voller Fleck | 1 | 2 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | |
Tabelle 1: Antikörper-Färbematrix. Liste der Antikörperkonzentrationen, die für die Färbung der Versuchs- und Kontrollproben verwendet wurden. Bei der Isolierung von FAPs durch GFP kann auf die Sca1-Färbung verzichtet werden. Führen Sie stattdessen GFP Single Stained Control und GFP FMO aus.
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Discussion
Die Etablierung effizienter und reproduzierbarer Protokolle für die Identifizierung und Isolierung von reinen adulten Stammzellpopulationen ist der erste und kritischste Schritt zum Verständnis ihrer Funktion. Isolierte FAPs und MuSCs können zur Durchführung von Multiomics-Analysen in Transplantationsexperimenten als potenzielle Behandlung von Muskelerkrankungen verwendet oder für die Krankheitsmodellierung in der Stammzelltherapie genetisch modifiziert werden.
Das hier beschriebene Protokoll bietet standardisierte Richtlinien für die Identifizierung, Isolierung und Kultur von FAPs und MuSCs, die aus den Hintergliedmaßenmuskeln erwachsener Mäuse gewonnen werden. Reine Populationen von FAPs und MuSCs wurden mit einer FACS-basierten Technik isoliert und ihre Reinheit anschließend durch Immunfärbung von Zellen mit spezifischen Zelloberflächenmarkern und genetischen Mitteln bewertet.
Das Protokoll besteht aus drei Hauptabschnitten, die die Ausbeute von FAPs und MuSCs stark beeinflussen: die mechanische und enzymatische Muskelverdauung, die Erzeugung einer einkernigen Zellsuspension durch die 20-G-Nadel und die endgültige Isolierung einzelner Zellen durch FACS.
Die Durchführung des richtigen Muskelhackens ist von entscheidender Bedeutung, um einzelne Zellen freizusetzen. Der Schwerpunkt sollte auf diesen Schritt gelegt werden, da das Erreichen der optimalen Größe der Muskelstücke nach dem Zerkleinern die für die Verdauung verwendeten Enzyme am besten funktionieren lässt und ein Verstopfen der in Schritt 4.1 verwendeten Nadel verhindert. Auf der anderen Seite kann eine übermäßige Zerkleinerung des Muskels zu einer schlechten Zellausbeute und verminderten Zelllebensfähigkeit führen, da MuSCs während der ersten Verdauung schnell freigesetzt werden und in Schritt 3.7.2 oder 3.8.214 abgesaugt werden können. Darüber hinaus beeinflusst die Effizienz der Enzyme, die für die Verdauung des Muskelpräparats verwendet werden, auch die Qualität der enzymatischen Dissoziation, da es zu Schwankungen zwischen verschiedenen Enzymchargen oder zu einer Abnahme der Enzymaktivität mit der Zeit23 kommen kann. Daher wird empfohlen, jede Charge von Enzymen zu testen, um den Verdauungszeitpunkt und die Konzentration zu optimieren. Darüber hinaus kann die Konzentration und Zeit, die für die Verdauung des Muskels benötigt wird, auch durch pathologische Zustände beeinflusst werden, die die Muskelsteifheit beeinflussen. Diese besonderen Bedingungen erfordern eine individuelle Optimierung.
Die letzte Generation von einkernigen Zellen geschieht, indem die Suspension mit einer 20-G-Nadel durch eine 10-ml-Spritze geleitet wird. Bei der Durchführung dieses Schritts ist besondere Vorsicht geboten, um die Anzahl der gebildeten Blasen zu minimieren, da ihr Platzen zusätzliche Zellschäden verursacht24.
Die Zellsuspension wird dann mit einem Antikörpercocktail angefärbt und mit einem Zellsortierer gewonnen. Das Einstellen der richtigen Tore ist ein weiterer kritischer Schritt. Bei der Durchführung dieser Experimente wird dringend empfohlen, die aufgeführten Einzelfärbungskontrollen und FMO-Kontrollen auszuführen, um das Emissions-Spillover ordnungsgemäß zu kompensieren und das Hintergrundsignal aufgrund der Spillover-Ausbreitung zu berücksichtigen. Dies ist besonders wichtig, wenn es um hell fluoreszierende Proteine wie GFP und indirekte Färbungen wie den VCAM-1-Biotin/Stretpavidin-PE-Cy7-Komplex geht.
Darüber hinaus ist es eine gute Praxis, vor der ersten Durchführung dieses Experiments eine Titration der Antikörper durchzuführen, die zum Nachweis von Populationen von Interesse verwendet werden. Die Bestimmung der optimalen Konzentration der Antikörper ist ein entscheidender Schritt, um das hellste Signal der positiven Population zu gewährleisten und die Zunahme der Hintergrundfärbung zu vermeiden.
Sobald die Sortierung abgeschlossen ist, ist es wichtig, eine Analyse nach der Sortierung der sortierten Zellen durchzuführen, um ihre Reinheit und Lebensfähigkeit zu bestimmen. Die Ausbeute und Lebensfähigkeit der sortierten Zellen wird stark von der Zeit beeinflusst, die für die Verarbeitung der Probe benötigt wird, und sollten bei der Planung der Verarbeitung mehrerer Mäuse berücksichtigt werden. Darüber hinaus kann die Aufbewahrung der sortierten Zellen auf Eis in 2x serumangereicherten Medien die Zellregeneration unterstützen und ihre Lebensfähigkeit verbessern.
In diesem Protokoll wurden FAPs und MuSCs aus den Tibialis-Frontmuskeln unverletzter Mäuse sowie 7 Tage nach der Notexin-Injektion isoliert. Nach einer akuten Verletzung wurde berichtet, dass verschiedene FAP- und MuSC-Subpopulationen vorübergehend im regenerierenden Muskelgewebe exprimiert werden. Malecova und Kollegen haben das Vorhandensein einer Subpopulation von VCAM-1 berichtet, die FAPs exprimiert, die in unbeschädigten Muskeln fehlt, zwischen den Tagen 2 und 3 nach der Verletzung bei akuter Entzündung ihren Höhepunkt erreichte und bei murinen dystrophischen Mäusen persistierte13. In ähnlicher Weise berichteten Kafadar und Kollegen über einen vorübergehenden Anstieg der Expression von Sca1 auf einer kleinen Untergruppe myogener Vorläuferzellen 2 Tage nach der Verletzung25. Die myogenen Zellen von Sca1+ waren jedoch 3 Tage nach der Verletzung stark vermindert25. Das Vorhandensein dieser Subpopulationen sollte anerkannt und berücksichtigt werden, wenn dieses Protokoll zur Isolierung von FAPs und MuSCs in früheren Stadien verwendet wird.
Zusammenfassend beschreibt dieses Protokoll eine Methode zur Isolierung und Kultur einer reinen Population von FAPs und MuSCs, die entweder aus gesunden oder verletzten erwachsenen Mausmuskeln isoliert wurden. Die hohe Reinheit und Lebensfähigkeit der Zellen macht dieses Protokoll für weitere nachgelagerte Anwendungen geeignet.
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Disclosures
Nichts.
Acknowledgments
Wir danken Tom Cheung (The Hong Kong University of Science & Technology) für die Beratung zur MuSC-Isolation. Diese Arbeit wurde vom NIAMS-IRP durch die NIH-Zuschüsse AR041126 und AR041164 finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 20 G BD Needle 1 in. single use, sterile | BD Biosciences | 305175 | |
| anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b) | The University of British Columbia | 53-0010-01 | |
| APC anti-mouse CD31 Antibody | BioLegend | 102510 | |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL | BD Biosciences | 309604 | |
| Biotin anti-mouse CD106 Antibody | BioLegend | 105703 | |
| C57BL/6J mouse (Female and Male) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | 007669 | |
| Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356400 | |
| Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356500 | |
| Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356408 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile | VWR | 414004-265 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11055 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile | Corning | 352340 | |
| Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile | Corning | 353002 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL | VWR | 352196 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning | VWR | 60819-728 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning | VWR | 21008-948 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic) | Promega | G5071 | |
| FlowJo 10.8.1 | |||
| Gibco Collagenase, Type II, powder | ThermoFisher Scientific | 17101015 | |
| Gibco Dispase, powder | ThermoFisher Scientific | 17105041 | |
| Gibco DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher Scientific | 12430054 | |
| Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States | ThermoFisher Scientific | 16000044 | |
| Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix | ThermoFisher Scientific | 11550043 | |
| Gibco Horse Serum, New Zealand origin | ThermoFisher Scientific | 16050122 | |
| Gibco PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Gibco PBS (10x), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | ThermoFisher Scientific | 10378016 | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21127 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools Inc | 14090-09 | |
| Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | ThermoFisher Scientific | A1310 | |
| Mouse PDGF R alpha Antibody | R&D Systems | AF1062 | |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | NC9624464 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher Scientific | 31872 | |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody | BioLegend | 108120 | |
| Paraformaldehyde, 16% | Fisher Scientific | NCC0528893 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| PE/Cyanine7 Streptavidin | BioLegend | 405206 | |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools Inc | 91500-09 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools Inc | 91150-20 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. Muscle as a "mediator" of systemic metabolism. Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite cells and skeletal muscle regeneration. Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers. Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).
- Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
- Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
- Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging. Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).
- Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
- Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
- Eisner, C., et al. Murine tissue-resident PDGFRα+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).
- Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).
- Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
- Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9, 3670 (2018).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).
- Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture. Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).
- Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle. Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
- Contreras, O., et al. Cross-talk between TGF-β and PDGFRα signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors. Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).
- Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma. Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).
- Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert. Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).
- García-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Walls, P. L. L., et al. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
- Kafadar, K. A., et al. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).
