Summary
L'identificazione precisa delle cellule progenitrici fibro-adipogeniche (FAP) e delle cellule staminali muscolari (MuSC) è fondamentale per studiare la loro funzione biologica in condizioni fisiologiche e patologiche. Questo protocollo fornisce linee guida per l'isolamento, la purificazione e la coltura di FAP e MuSC da muscoli di topo adulti.
Abstract
Le cellule progenitrici fibro-adipogeniche (FAP) sono una popolazione di cellule stromali mesenchimali (MSC) residenti nel muscolo scheletrico in grado di differenziarsi lungo la linea fibrogenica, adipogena, osteogenica o condrogena. Insieme alle cellule staminali muscolari (MuSC), le FAP svolgono un ruolo fondamentale nell'omeostasi, nella riparazione e nella rigenerazione muscolare, mantenendo e rimodellando attivamente la matrice extracellulare (ECM). In condizioni patologiche, come danni cronici e distrofie muscolari, i FAP subiscono un'attivazione aberrante e si differenziano in fibroblasti e adipociti produttori di collagene, portando alla fibrosi e all'infiltrazione grassa intramuscolare. Pertanto, i FAP svolgono un duplice ruolo nella rigenerazione muscolare, sostenendo il turnover MuSC e promuovendo la riparazione dei tessuti o contribuendo alla formazione di cicatrici fibrotiche e infiltrati di grasso ectopico, che compromettono l'integrità e la funzione del tessuto muscolare scheletrico. Una corretta purificazione di FAP e MuSC è un prerequisito per comprendere il ruolo biologico di queste cellule sia in condizioni fisiologiche che patologiche. Qui, descriviamo un metodo standardizzato per l'isolamento simultaneo di FAP e MuSC dai muscoli degli arti di topi adulti utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS). Il protocollo descrive in dettaglio la dissociazione meccanica ed enzimatica delle cellule mononucleate dai muscoli dell'intero arto e dai muscoli tibiali anteriori (TA) lesionati. FAP e MuSC vengono successivamente isolati utilizzando uno smistatore di cellule semi-automatico per ottenere popolazioni cellulari pure. Descriviamo inoltre un metodo ottimizzato per la coltura di FAP e MuSC quiescenti e attivati, da soli o in condizioni di cocultura.
Introduction
Il muscolo scheletrico è il tessuto più grande del corpo, che rappresenta ~ 40% del peso umano adulto, ed è responsabile del mantenimento della postura, della generazione di movimento, della regolazione del metabolismo energetico basale e della temperatura corporea1. Il muscolo scheletrico è un tessuto altamente dinamico e possiede una notevole capacità di adattarsi a una varietà di stimoli, come stress meccanico, alterazioni metaboliche e fattori ambientali quotidiani. Inoltre, il muscolo scheletrico si rigenera in risposta a lesioni acute, portando al completo ripristino della sua morfologia e delle sue funzioni2. La plasticità del muscolo scheletrico si basa principalmente su una popolazione di cellule staminali muscolari residenti (MuSC), chiamate anche cellule satelliti, che si trovano tra la membrana plasmatica della miofibra e la lamina basale 2,3. In condizioni normali, i MuSC risiedono nella nicchia muscolare in uno stato quiescente, con solo poche divisioni per compensare il turnover cellulare e ricostituire il pool di cellule staminali4. In risposta alle lesioni, le MuSC entrano nel ciclo cellulare, proliferano e contribuiscono alla formazione di nuove fibre muscolari o ritornano nella nicchia in un processo di auto-rinnovamento 2,3. Oltre ai MuSC, il mantenimento omeostatico e la rigenerazione del muscolo scheletrico si basano sul supporto di una popolazione di cellule muscolari residenti denominate progenitori fibro-adipogeni (FAP)5,6,7. Le FAP sono cellule stromali mesenchimali incorporate nel tessuto connettivo muscolare e in grado di differenziarsi lungo la linea fibrogenica, adipogena, osteogenica o condrogena 5,8,9,10. I FAP forniscono supporto strutturale per i MuSC in quanto sono una fonte di proteine della matrice extracellulare nella nicchia delle cellule staminali muscolari. I FAP promuovono anche il mantenimento a lungo termine del muscolo scheletrico secernendo citochine e fattori di crescita che forniscono supporto trofico per la miogenesi e la crescita muscolare 6,11. In caso di lesione muscolare acuta, i FAP proliferano rapidamente per produrre una nicchia transitoria che supporta l'integrità strutturale del muscolo rigenerante e fornisce un ambiente favorevole per sostenere la proliferazione e la differenziazione dei MuSC in modo paracrino5. Man mano che la rigenerazione procede, i FAP vengono eliminati dal muscolo rigenerativo mediante apoptosi e il loro numero ritorna gradualmente al livello basale12. Tuttavia, in condizioni che favoriscono il danno muscolare cronico, i FAP annullano la segnalazione pro-apoptotica e si accumulano nella nicchia muscolare, dove si differenziano in fibroblasti e adipociti che producono collagene, portando a infiltrati di grasso ectopico e formazione di cicatrici fibrotiche12,13.
Grazie alla loro multipotenza e alle loro capacità rigenerative, FAP e MuSC sono stati identificati come potenziali bersagli nella medicina rigenerativa per il trattamento dei disturbi del muscolo scheletrico. Pertanto, per studiare la loro funzione e il potenziale terapeutico, è importante stabilire protocolli efficienti e riproducibili per l'isolamento e la coltura di FAP e MuSC.
La selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) può identificare diverse popolazioni cellulari in base a caratteristiche morfologiche come dimensioni e granularità e consente l'isolamento cellulare specifico basato sull'uso di anticorpi diretti contro i marcatori della superficie cellulare. Nei topi adulti, i MuSC esprimono la molecola di adesione delle cellule vascolari 1 (VCAM-1, nota anche come CD106)14,15 e α7-integrina 15, mentre i FAP esprimono il recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine α (PDGFRα) e l'antigene delle cellule staminali 1 (Sca1 o Ly6A/E)5,6,9,12,16,17 . Nel protocollo qui descritto, i MuSC sono stati identificati come CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+, mentre i FAP sono stati identificati come CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. In alternativa, topi PDGFRαEGFP sono stati impiegati per isolare FAP come CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin- eventi18,19. Inoltre, abbiamo confrontato la sovrapposizione tra il segnale fluorescente delle cellule PDGFRα-GFP+ alle cellule identificate dal marcatore di superficie Sca1. La nostra analisi ha mostrato che tutte le cellule che esprimono GFP erano anche positive per Sca1, indicando che entrambi gli approcci possono essere impiegati per l'identificazione e l'isolamento delle FAP. Infine, la colorazione con anticorpi marcatori specifici ha confermato la purezza di ciascuna popolazione cellulare.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida istituzionali approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali (ACUC) dell'Istituto nazionale di artrite, muscoloscheletrico e malattie della pelle (NIAMS). Gli investigatori che eseguono questo protocollo devono aderire alle loro linee guida locali sull'etica animale.
NOTA: Questo protocollo descrive in dettaglio come isolare FAP e MuSC dagli arti posteriori e dai muscoli tibiali anteriori (TA) feriti di topi maschi e femmine adulti (3-6 mesi) e fornisce linee guida per la cocoltura di FAP e MuSC. Una panoramica della procedura sperimentale è mostrata nella Figura 1. Tutte le fasi di questo protocollo devono essere eseguite in condizioni sterili e a temperatura ambiente (RT) se non diversamente specificato.
1. Configurazione del reagente
- Wash Medium (WM): Preparare questa soluzione aggiungendo il 10% (vol/vol) di siero di cavallo e 1x penicillina/streptomicina al mezzo cellulare F-10 Nutrient Mix di Ham. WM può essere preparato in anticipo e conservato a 4 °C.
- Tampone di dissociazione muscolare (MDB): preparare questo tampone sciogliendo la collagenasi II in WM. Se si raccolgono muscoli interi degli arti posteriori, sciogliere 1000 U/mL di collagenasi II in 10 mL di WM per ciascun topo (da preparare in un tubo conico da 50 ml). Se si raccolgono muscoli TA, sciogliere 800 U/mL di collagenasi II in 7 mL di WM per ciascun topo (da preparare in un tubo conico da 15 ml). Per i muscoli TA, questo aiuterà a visualizzare meglio i pellet cellulari e ottenere una maggiore resa di FAP e MuSC. Preparare MDB fresco prima di raccogliere i muscoli e tenerlo in ghiaccio fino al momento del bisogno.
- Stock di soluzione di collagenasi II: preparare questa soluzione sciogliendo la collagenasi II in soluzione salina sterile tamponata con fosfato 1x (PBS) fino ad una concentrazione finale di 1000 U/ml. Filtrare la soluzione attraverso un filtro a siringa da 0,45 μm e aliquote in 1 mL di stock. Conservare la soluzione a -20 °C.
- Stock di soluzione di dispase: preparare questa soluzione sciogliendo Dispase in 1x PBS sterile fino ad una concentrazione finale di 11 U/mL. Filtrare la soluzione attraverso un filtro a siringa da 0,45 μm e aliquote in 1 mL di stock. Conservare la soluzione a -20 °C.
- Preparare il terreno di coltura di FAP integrando DMEM con siero bovino fetale al 10% (vol / vol), 1x penicillina / streptomicina e 2,5 ng / mL FGF. Conservare il fluido a 4 °C.
- Preparare il terreno di coltura di MuSC integrando F10 con siero di cavallo al 10% (vol / vol), 1x penicillina / streptomicina e 2,5 ng / mL FGF. Conservare il fluido a 4 °C.
- Preparare il terreno di coltura integrando DMEM con siero bovino fetale al 10% (vol/vol), siero equino al 10% (vol/vol), 1x penicillina/streptomicina e 2,5 ng/mL FGF. Conservare il fluido a 4 °C.
2. Raccolta dei muscoli degli arti posteriori
- Aggiungere 2-3 ml di WM in un piatto da 6 cm (un piatto per mouse) e metterlo sul ghiaccio.
- Eseguire l'eutanasia per asfissia: posizionare il topo in una camera di CO 2 e introdurre il 100% di CO2. Utilizzare la dislocazione cervicale per confermare la morte.
- Posizionare il topo supino su un tampone di dissezione e spruzzarlo con etanolo al 70% (vol/vol) per evitare la contaminazione.
- Utilizzare una pinza per pizzicare il centro della pelle della pancia del topo e tagliare un'apertura di ~ 1 cm orizzontalmente. Afferrare i bordi della ferita e scrivania nel mouse tirando l'apertura in direzioni opposte per scoprire i muscoli sottostanti. Esporre un lato dell'arto posteriore del topo in quel momento.
- Prima di raccogliere i muscoli, rimuovere il grasso intermuscolare tra i muscoli posteriori della coscia e l'estremità prossimale del quadricipite. Ciò migliorerà l'isolamento di FAP e MuSC.
- Senza danneggiare il tessuto, utilizzare una pinza affilata per rompere e staccare la fascia per esporre i muscoli TA e estensore digitorum longus (EDL). Eseguire la punta affilata della pinza sotto i muscoli TA / EDL per staccare i muscoli dalla tibia.
- Tagliare i tendini che attaccano il TA / EDL alla caviglia e, mentre lo si tiene con una pinza, tagliare i muscoli con le forbici lungo la linea longitudinale del TA / EDL. Tagliare i tendini intorno al ginocchio per staccare tutti i muscoli TA / EDL. Posizionare i muscoli in un piatto di 6 cm tenuto in ghiaccio.
- Procedere a isolare i muscoli gastrocnemio e soleo tagliando tutti i tendini alla caviglia e staccando i muscoli dalla tibia e dal perone. Tagliare intorno al ginocchio e trasferire i muscoli sul piatto di 6 cm.
- Staccare la fascia intorno al quadricipite e separarla dal femore facendo scorrere la punta affilata della pinza tra il muscolo e l'osso. Tagliare i tendini intorno al ginocchio e, tenendo i quadricipiti con una pinza all'estremità distale, tagliare il resto del muscolo tagliando lungo il femore. Posizionare i muscoli nel piatto da 6 cm.
- Staccare i muscoli posteriori della coscia e i muscoli rimanenti intorno al femore e trasferirli nel piatto di 6 cm. Raccogliere i muscoli degli arti posteriori in un piatto di 6 cm tenuto sul ghiaccio.
NOTA: Evitare di danneggiare i vasi sanguigni, quando possibile, per prevenire la formazione di grumi di sangue che potrebbero interferire con l'isolamento a valle. Se si verifica sanguinamento, tamponare immediatamente il recipiente asportato con una garza sterile per assorbire il sangue. - Raccogliere TA, EDL, gastrocnemio, soleo, quadricipite e muscoli posteriori della coscia dall'arto controlaterale.
NOTA: Quando si isolano tutti i muscoli degli arti posteriori, non raggruppare due o più topi. Se si isolano i muscoli TA, è possibile raggruppare fino a tre muscoli TA.
3. Digestione muscolare meccanica ed enzimatica
- Aspirare WM dal piatto da 6 cm e aggiungere 1-2 ml di MDB per mantenere i muscoli umidi.
- Tritare accuratamente i muscoli fino ad ottenere una pasta di liquame di tessuto ben tritato. Per fare ciò, utilizzare una pinza per tenere un'estremità di un pezzo di muscolo, quindi utilizzare un bisturi per strappare e tagliare il muscolo fino a quando meno stretto.
- Usando le forbici, continua a tagliare il muscolo in piccoli pezzi per 1-2 minuti. Ripetere questo passaggio per ogni gruppo di muscoli fino ad ottenere un fango muscolare ben tritato.
NOTA: Questo è un passaggio molto critico per massimizzare la resa di FAP e MuSC. Si consiglia di trascorrere 8-10 minuti (4-5 minuti se si isolano solo i muscoli TA) in questo passaggio per garantire un corretto tritamento muscolare. - Trasferire i muscoli tritati da ciascun topo al tubo conico contenente MDB.
- Sigillare i tubi con pellicola da laboratorio e incubare in bagnomaria a 37 °C con agitazione (75 rpm) per 1 h. Posizionare i tubi orizzontalmente lungo il percorso di agitazione e utilizzare i pesi per mantenere i tubi immersi nell'acqua.
- Scongelare 1 mL di brodo di collagenasi II e 1 mL di stock di dispase per topo. Prima dell'uso, ruotare il brodo di dispase in un rotore a benna oscillante a 10.000 x g per 1 minuto a 4 °C. Usa solo il surnatante.
- Se sono stati raccolti interi muscoli degli arti posteriori, procedere come segue:
- Dopo 1 ora, rimuovere il tubo dallo shaker e riempirlo a 50 ml con WM. Capovolgere delicatamente un paio di volte per garantire la miscelazione.
- Centrifugare le celle in un rotore a benna oscillante a 250 x g per 5 minuti a 4 °C. Trasferire 42 mL di surnatante in due nuove provette (~21 mL in ciascuna provetta) e lasciare ~8 mL nella provetta originale.
- Riempire le nuove provette contenenti 21 mL di surnatante fino a 50 mL con WM. Centrifugare nuovamente le celle in un rotore a benna oscillante a 350 x g per 8 minuti a 4 °C. Aspirare tutto il surnatante e mantenere il pellet sul ghiaccio.
- Aggiungere 1 mL di brodo di collagenasi II e 1 mL di stock di dispase nel tubo originale contenente ~8 mL di MDB.
- Utilizzando una pipetta sierologica da 5 ml, risospendere il pellet 10 volte senza intasarlo. Espellere la soluzione verso la parete del tubo, evitando la formazione di bolle. Se si verifica un intasamento durante la risospensione, spingere la punta della pipetta contro il fondo del tubo per interrompere meccanicamente i pezzi muscolari. Procedere al passaggio 3.9.
- Se i muscoli TA sono stati raccolti, procedere come segue:
- Dopo 1 ora, rimuovere il tubo dallo shaker e riempirli a 15 ml con WM. Capovolgere delicatamente un paio di volte per garantire la miscelazione.
- Centrifugare le celle in un rotore a benna oscillante a 250 x g per 5 minuti a 4 °C. Trasferire 13 mL di surnatante in un nuovo tubo da 15 mL e lasciare ~2 mL nel tubo originale.
- Riempire la nuova provetta contenente 13 mL di surnatante fino a 15 mL con WM. Centrifugare nuovamente le celle in un rotore a benna oscillante a 350 x g per 8 minuti a 4 °C. Aspirare tutto il surnatante e mantenere il pellet sul ghiaccio.
- Utilizzando una punta per pipetta da 1000 μL, risospendere il pellet nel tubo originale su e giù senza intasarsi.
- Aggiungere 1 mL di brodo di collagenasi II e 1 mL di brodo di dispase nel tubo originale contenente 2 mL di MDB e riempire fino a 10 mL con WM. Procedere al passaggio 3.9.
- Sigillare i tubi con pellicola da laboratorio e incubare in bagnomaria a 37 °C con agitazione (75 rpm) per 30 min. Posizionare i tubi come al punto 3.5.
4. Generazione di cellule mononucleate
NOTA: Se si lavora con muscoli TA raccolti in un tubo conico da 15 ml, trasferire la sospensione in un tubo conico da 50 ml prima di procedere con il punto 4.1.
- Dopo 30 minuti, rimuovere il tubo dall'agitatore. Aspirare ed espellere la sospensione muscolare attraverso una siringa da 10 mL con un ago da 20 G con successo 10 volte.
NOTA: Espellere la sospensione muscolare verso la parete del tubo per evitare bolle e schiuma. Piccoli pezzi di tendini o cartilagini non digeriti potrebbero ostruire l'ago durante i primi cicli di aspirazione. Se si verifica l'intasamento, utilizzare una pinza sterile per rimuovere l'intasamento dalla punta dell'ago. - Riempire ogni tubo fino a 50 ml con WM e capovolgere delicatamente un paio di volte per garantire la miscelazione.
- Centrifugare le celle in un rotore a benna oscillante a 250 x g per 5 minuti a 4 °C. Trasferire il surnatante in una nuova provetta (~42 ml) e lasciare ~8 mL nel tubo originale.
- Riempire la nuova provetta contenente 42 mL di surnatante fino a 50 mL con WM. Centrifugare nuovamente le celle in un rotore a benna oscillante a 350 x g per 8 minuti a 4 °C. Aspirare tutto il surnatante e mantenere il pellet sul ghiaccio.
- Posizionare un filtro cellulare in nylon da 40 μm nel tubo conico originale da 50 mL contenente 8 mL di WM e pre-bagnare il filtro cellulare con 1-2 mL di WM.
- Mentre si tiene il filtro a celle di nylon da 40 μm, utilizzare una pipetta da 10 ml per risospendere delicatamente il pellet 5-10 volte. Filtrare i pellet attraverso il filtro cellulare nello stesso tubo per ridurre al minimo la perdita di cellule.
- A questo punto, assicurarsi che ci siano tubi aggiuntivi con pellet di celle sul ghiaccio. Filtrare quei pellet nel tubo originale aggiungendo 4-5 ml di WM a ciascun tubo per risospendere i pellet e trasferire la soluzione al filtro cellulare posizionato nel tubo originale. Consentire il filtraggio per gravità.
- Dopo aver raccolto tutti i pellet nel tubo conico originale da 50 ml, sciacquare il filtro cellulare con altri 4-5 ml di WM. Utilizzare una pipetta da 1000 μL per raccogliere tutto il liquido dalla parte inferiore del filtro cellulare.
- Riempire ogni tubo con WM fino a 50 ml e capovolgere delicatamente un paio di volte per garantire la miscelazione.
- Centrifugare le celle in un rotore a benna oscillante a 250 x g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare immediatamente tutto il surnatante dopo la centrifugazione senza disturbare il pellet.
- Risospendere il pellet in 600 μL di WM e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga da 2 ml.
5. Colorazione anticorpale per citometria a flusso
NOTA: Per ogni esperimento, impostare i seguenti controlli: i) controllo non colorato, ii) controllo di vitalità per selezionare la popolazione di cellule vive, iii) controlli di compensazione a singola colorazione per correggere lo spillover dell'emissione di fluorocromo e iv) controlli di fluorescenza meno uno (FMO) per impostare i limiti di gating tenendo conto della diffusione dello spillover. Fare riferimento alla Tabella 1 per un elenco completo dei controlli di colorazione.
- Per preparare il controllo non colorato, trasferire 10 μL della sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga da 2 mL contenente 190 μL di WM. Risospendere la sospensione cellulare e filtrare attraverso un tubo a fondo tondo in polistirene da 5 mL con un tappo filtrante da 35 μm. Lasciare filtrare la sospensione per gravità.
- Utilizzare una pipetta da 200 μL per raccogliere tutto il liquido dalla parte inferiore del filtro cellulare. Sigillare con un cappuccio e lasciarlo sul ghiaccio, al riparo dalla luce.
- Preparare controlli di vitalità, FMO e singola colorazione: etichettare 10 provette da microcentrifuga da 2 ml e aggiungere 190 μL di WM in ciascuna provetta e 10 μL di sospensione cellulare. Fare riferimento alla Tabella 1 per un elenco completo dei controlli. Aggiungere anticorpi al tubo appropriato a seconda del controllo sperimentale. Fare riferimento alla Tabella 1 per informazioni riguardanti la combinazione e la concentrazione di anticorpi.
- Trasferire il resto della sospensione cellulare (500 μL) in una provetta da microcentrifuga da 2 mL (provetta sperimentale) e aggiungere i seguenti anticorpi: CD31-APC, CD45-APC, Sca1-Pacific Blue, VCAM-1-biotina e α7-integrina-PE. Fare riferimento alla Tabella 1 per informazioni riguardanti la combinazione e la concentrazione di anticorpi.
- Mescolare delicatamente bene ogni tubo per garantire una distribuzione uniforme e incubare le cellule in uno shaker rotante a 4 °C per 45 minuti al riparo dalla luce.
- Dopo 45 minuti, riempire tutti i tubi di microcentrifuga fino a 2 ml con WM. Capovolgere delicatamente i tubi un paio di volte per garantire una miscelazione completa. Centrifugare i tubi in una centrifuga refrigerata con rotore ad angolo fisso a 250 x g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare il surnatante senza disturbare il pellet.
- Risospendere le cellule in tutte le provette di microcentrifuga in 300 μL di WM.
- Aggiungere l'anticorpo streptavidina in tubi appropriati. Fare riferimento alla Tabella 1 per informazioni riguardanti la combinazione e la concentrazione di anticorpi. Mescolare delicatamente bene ogni tubo per garantire una distribuzione uniforme e incubare le cellule in uno shaker rotante a 4 °C per 20 minuti al riparo dalla luce. Lasciare i tubi rimanenti sul ghiaccio, al riparo dalla luce.
- Dopo 20 minuti, riempire le provette di microcentrifuga contenenti anticorpi streptavidina a 2 ml con WM. Capovolgere delicatamente i tubi alcune volte per garantire una miscelazione completa. Centrifugare i tubi in una centrifuga refrigerata con rotore ad angolo fisso a 250 x g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare completamente il surnatante e risospendere le cellule in 300 μL di WM.
- Pre-bagnare il tappo del filtro cellulare da 35 μm di 10 tubi a fondo tondo in polistirene da 5 mL con 200 μL di WM. Filtrare le celle dai tubi di controllo attraverso gli appositi tubi a fondo tondo in polistirene da 5 ml. Utilizzare una pipetta da 200 μL per raccogliere tutto il liquido dalla parte inferiore del filtro cellulare. Sigillare con tappi, lasciare i tubi sul ghiaccio e proteggerli dalla luce.
- Risospendere le celle nel tubo sperimentale con ulteriori 200 μL di WM per un totale di 500 μL di WM. Pre-bagnare un tappo del filtro cellulare di un tubo a fondo tondo in polistirene da 5 mL con 200 μL di WM. Trasferire la sospensione cellulare dal tubo sperimentale nel tubo a fondo tondo in polistirene da 5 mL e lasciarlo filtrare per gravità.
- Risciacquare la provetta da 2 mL di microcentrifuga contenente la sospensione del campione sperimentale con 300 μL di WM e farla passare attraverso lo stesso tappo del filtro. Utilizzare una pipetta da 200 μL per raccogliere tutto il liquido dalla parte inferiore del filtro cellulare. Sigillare con un cappuccio, lasciare i tubi sul ghiaccio e proteggerli dalla luce.
NOTA: Se si verifica l'intasamento del tappo del filtro cellulare da 35 μm, picchiettare delicatamente il tubo sul banco per facilitare il flusso attraverso. - Preparare ed etichettare i tubi di raccolta per FAP e MuSC. Se si isolano le cellule da interi muscoli degli arti posteriori, ordinare le cellule in tubi a fondo tondo in polipropilene da 5 ml con un massimo di 1 ml di terreno di coltura FAP o MuSCs integrato con 2x siero. Se si isolano le cellule dai muscoli TA, ordinare FAP e MuSC in provette da microcentrifuga da 2 ml contenenti fino a 400 μL di terreno di coltura integrato con siero 2x.
6. Selezione cellulare attivata da fluorescenza (FACS)
NOTA: Questo protocollo utilizza un citometro a flusso di ricerca da banco compatto dotato di un ugello da 100 μm e caratterizzato da una configurazione a tre laser (488 nm, 640 nm, 405 nm) con la capacità di analizzare fino a nove diversi fluorocromi (11 parametri inclusi la dispersione diretta e laterale). I fluorocromi utilizzati in questo protocollo e i relativi filtri passa-banda del rivelatore sono i seguenti: PE 586/42; PE-Cy7 783/56; APC 660/10; Blu Pacifico 448/45; 7-amminoactinomicina D (7-AAD) 700/54, GFP 527/32. Le cellule vengono ordinate a 4 °C e rimangono sul ghiaccio seguendo l'ordinamento. Prima di utilizzare questo strumento, assicurarsi che l'utente sia adeguatamente formato da uno specialista di applicazioni tecniche.
- Configurazione e controllo delle prestazioni dello smistatore di celle in base alle specifiche del produttore.
- Impostare una strategia di gating gerarchica per identificare FAP e MuSC (Figura 2).
- Isolare i FAP in base al seguente schema: i) area di dispersione delle cellule dirette vs area di dispersione delle cellule laterali (FSC-A vs. SSC-A) per separare le celle rispetto ai detriti, ii) altezza di dispersione delle celle laterali vs larghezza di dispersione delle cellule laterali (SSC-H vs. SSC-W) per discriminare i singoletti dai doppietti nell'intervallo SSC, iii) altezza di dispersione della cella diretta vs larghezza di dispersione della cella diretta (FSC-H vs. FSC-W) per discriminare i singoletti dai doppietti nell'intervallo FSC, e iv) area 7-AAD vs SSC-A per distinguere le cellule vive da quelle morte.
- Se si isolano le FAP attraverso il metodo basato sugli anticorpi, utilizzare il seguente schema: v) area APC-CD45/CD31 vs area Pacific Blue-Ly-6A/E (Sca1) per escludere le cellule CD31+ e CD45+ da ulteriori analisi e vi) area PE-Cy7-VCAM-1 vs area PE-α7-Integrina dalla popolazione CD31-/CD45-/Sca1+ per distinguere le FAP. I FAP sono identificati come eventi CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-.
- Se si isolano le FAP attraverso il metodo del reporter GFP endogeno, utilizzare il seguente schema: v) Area APC-CD45/CD31 vs area GFP-PDGFRα per escludere le cellule CD31+ e CD45+ da ulteriori analisi e isolare le cellule GFP+. I FAP sono identificati come eventi CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin-.
- Isolare i MuSC in base al seguente schema: i) area di dispersione delle cellule dirette vs area di dispersione delle cellule laterali (FSC-A vs. SSC-A) per separare le celle rispetto ai detriti, ii) altezza di dispersione delle celle laterali vs larghezza di dispersione delle celle laterali (SSC-H vs. SSC-W) per discriminare i singoletti dai doppietti nell'intervallo SSC, iii) altezza di dispersione della cella diretta vs larghezza di dispersione della cella diretta (FSC-H vs. FSC-W) per discriminare i singoletti dai doppietti nell'intervallo FSC, iv) area 7-AAD vs SSC-A per distinguere le cellule vive da quelle morte, v) area APC-CD45/CD31 vs area Pacific Blue-Ly-6A/E (Sca1) per escludere le cellule CD31+ e CD45+ da ulteriori analisi e vi) area PE-Cy7-VCAM-1 vs area PE-α7-Integrina dalla popolazione CD31-/CD45-/Sca1- per distinguere i MuSC. Le MuSC sono identificate come eventi CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+.
- Isolare i FAP in base al seguente schema: i) area di dispersione delle cellule dirette vs area di dispersione delle cellule laterali (FSC-A vs. SSC-A) per separare le celle rispetto ai detriti, ii) altezza di dispersione delle celle laterali vs larghezza di dispersione delle cellule laterali (SSC-H vs. SSC-W) per discriminare i singoletti dai doppietti nell'intervallo SSC, iii) altezza di dispersione della cella diretta vs larghezza di dispersione della cella diretta (FSC-H vs. FSC-W) per discriminare i singoletti dai doppietti nell'intervallo FSC, e iv) area 7-AAD vs SSC-A per distinguere le cellule vive da quelle morte.
- Eseguire il controllo non colorato e il controllo di vitalità per garantire che la popolazione cellulare sia posizionata correttamente nel grafico SSC-A vs FSC-A e per il gate corretto su singole celle vive.
- Acquisisci tutti i controlli a singola macchia e genera la matrice di compensazione dello spillover.
- Eseguire tutti i controlli FMO e determinare il punto di interruzione tra la diffusione della fluorescenza di fondo e la popolazione colorata positivamente.
- Circa 5-10 minuti prima dell'acquisizione del campione sperimentale, aggiungere il colorante di vitalità 7-AAD e mescolare delicatamente.
- Una volta che tutti i controlli sono stati elaborati, impostare le porte di smistamento in conformità con i controlli FMO; acquisire e ordinare i campioni sperimentali.
- Dopo che tutti i campioni sono stati elaborati, pulire il citometro secondo le specifiche del produttore. Esportare tutti i dati .fcs per l'analisi.
7. Cultura dei FAP e dei MuSC
NOTA: Le cellule selezionate devono essere coltivate immediatamente dopo la selezione, in un mezzo appropriato su piastre rivestite di collagene I.
- Centrifugare i tubi di raccolta in un rotore ad angolo fisso a 250 x g per 5 minuti a 4 °C.
- Aspirare il surnatante senza disturbare il pellet cellulare.
- Per la coltura di MuSC, risospendere le cellule in un volume appropriato di terreno di coltura MuSC e incubarle in condizioni standard a 37 °C e 5% di CO2.
- Placcare MuSC appena isolati a una densità di 20.000 cellule/cm 2 e MuSC attivati ad una densità di 15.000 cellule/cm2.
- Dopo la placcatura, le cellule appaiono piccole, sferiche e traslucide. Entro 36 ore, i MuSC aderiscono alla superficie della piastra e aumentano lentamente le loro dimensioni per le prime 48 ore.
- Sostituire il mezzo ogni 2 giorni.
NOTA: I MuSC sono molto sensibili alla densità cellulare. Per mantenere i MuSC nel loro stato proliferante, coltivarli fino a quando non sono confluenti al 60% -70%. Passare le cellule in nuovi piatti o piatti rivestiti di collagene I e aggiungere nuovo terreno fresco ogni 2 giorni. Se i MuSC vengono tenuti nello stesso piatto o piatto per più di 3-4 giorni, acquisiranno una forma allungata e si allineeranno con le cellule vicine fino a fondersi insieme.
- Per la coltura di FAP, risospendere le cellule in un volume appropriato di terreno di coltura MuSC e incubarle in condizioni standard a 37 °C e 5% di CO2.
- Placcare i FAP isolati dal muscolo imperturbato ad una densità di 15.000 cellule/cm 2 e i FAP isolati dal muscolo leso a 9.000 cellule/cm2.
NOTA: Dopo la placcatura, i FAP aderiscono completamente alla superficie della piastra entro 48 ore, mentre i FAP attivati si attaccano alla piastra entro poche ore. Una volta attaccati, i FAP acquisiscono la loro forma caratteristica, con un corpo a piccole cellule e processi cellulari allungati, e proliferano rapidamente. - Sostituire il mezzo ogni 2 giorni.
NOTA: I FAP sono molto sensibili alla densità cellulare. La semina di FAP a basse densità può portare a una scarsa crescita cellulare e alla morte cellulare. Al contrario, la placcatura di FAP ad alta densità di semina aumenterà la sopravvivenza cellulare e migliorerà la loro espansione. Le FAP derivanti dal muscolo danneggiato di solito richiedono una densità cellulare inferiore rispetto al muscolo non danneggiato, poiché sono già attivate. Si raccomanda di regolare la densità di placcatura FAP in base alle proprie condizioni sperimentali e alla fonte dei campioni.
- Placcare i FAP isolati dal muscolo imperturbato ad una densità di 15.000 cellule/cm 2 e i FAP isolati dal muscolo leso a 9.000 cellule/cm2.
- Per la cocultura, risospendere FAP e MuSC nel mezzo di cocoltura con un rapporto di 1:1 e incubare quelli in condizioni standard a 37 °C e 5% di CO2. Lasciare che le cellule si attacchino per 48 ore e sostituire il mezzo ogni 2 giorni.
8. Analisi di immunofluorescenza di FAP e MuSCs in coltura
- Aspirare il mezzo cellulare ed eseguire due o tre lavaggi con 1x PBS.
- Fissare le cellule con paraformaldeide (PFA) al 2% in 1x PBS per 15 minuti a RT.
- Aspirare il 2% di PFA e lavare rapidamente le cellule due o tre volte con 1x PBS.
- Eseguire la permeabilizzazione e il blocco cellulare:
- Per l'immunocolorazione di FAP appena isolati, eseguire la permeabilizzazione e il blocco cellulare incubando cellule con 1x PBS + 0,1% Triton X-100 (PBST) + 1% albumina sierica bovina (BSA) + 5% siero d'asina normale (NDS) per 30 minuti a RT.
- Per l'immunocolorazione di MuSC appena isolate, eseguire la permeabilizzazione e il blocco cellulare incubando cellule con PBST + 1% BSA + 5% siero di capra normale (NGS) per 30 minuti a RT.
- Applicare anticorpi primari:
- Per l'immunocolorazione di FAP appena isolate, applicare l'anticorpo primario anti PDGFRα di capra (1:300) diluito in PBST + 1% BSA + 5% NDS durante la notte a 4 °C.
- Per l'immunocolorazione di MuSC appena isolati, applicare l'anticorpo primario anti-Pax7 del topo (1:10) diluito in PBST + 1% BSA + 5% NGS per 45 minuti a RT.
- Lavare le cellule due o tre volte con 1x PBS per rimuovere la soluzione anticorpale primaria.
- Applicare anticorpi secondari:
- Per l'immunocolorazione di FAP appena isolati, applicare l'anticorpo secondario Alexa Fluor 488 anticorpo secondario IgG (H + L) Alexa Fluor 488 (1:500) diluito in PBST + 1% BSA per 1 ora a RT.
- Per l'immunocolorazione di MuSC appena isolate, applicare l'anticorpo secondario IgG 1 Alexa Fluor 555 (1:500) diluito in PBST +1 % BSA per 45 minuti a RT.
- Lavare le cellule due o tre volte con 1x PBS per rimuovere la soluzione anticorpale primaria.
- Eseguire la controcolorazione nucleare incubando cellule con DAPI in PBST (1:1000) per 5 minuti a RT.
- Lavare le celle tre volte con 1x PBS per rimuovere la soluzione DAPI.
ATTENZIONE: DAPI è tossico e pericoloso; maneggiarlo con cura e smaltirlo nella bottiglia dei rifiuti pericolosi. - Conservare le celle a 4 °C al riparo dalla luce.
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Representative Results
Questo protocollo consente l'isolamento di circa un milione di FAP e fino a 350.000 MuSC dagli arti posteriori illesi di topi adulti wild-type (3-6 mesi), corrispondente a una resa dell'8% per le FAP e del 3% per le MuSC degli eventi totali. Quando si selezionano le cellule dal TA danneggiato 7 giorni dopo l'infortunio, vengono raggruppati da due a tre muscoli TA per ottenere fino a 300.000 FAP e 120.000 MuSC, che corrispondono a una resa rispettivamente dell'11% e del 4%. I valori di purezza post-ordinamento sono generalmente superiori al 95% per FAP e MuSC.
La strategia di gating adottata per isolare FAP e MuSC è illustrata nella Figura 2. In primo luogo, le popolazioni cellulari di interesse vengono identificate creando un grafico di densità di dispersione diretta (FSC) rispetto a dispersione laterale (SSC), che consente un certo grado di identificazione cellulare basato sulle proprietà morfologiche cellulari. Questa strategia di gating viene utilizzata anche per escludere piccoli detriti cellulari, che di solito si trovano nell'angolo in basso a sinistra del grafico FSC vs SSC. Le celle vengono ulteriormente recintate per escludere doppietti in base ai segnali di altezza e larghezza FSC e SSC e le celle singolette risultanti vengono quindi colorate con 7-AAD per valutare la loro vitalità. Le cellule viventi vengono ulteriormente valutate per l'espressione di Sca1 e CD31/CD45 per escludere le cellule positive al lignaggio da ulteriori analisi. I singoletti negativi Sca1 negativi di linea vengono quindi colorati per VCAM-1 e α7-integrina per distinguere FAP e MuSC. Le FAP sono identificate come cellule CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin- e le MuSC sono identificate come cellule CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+. In alternativa, le cellule viventi sono anche recintate per CD31 / CD45 e GFP-PDGFRα per distinguere le FAP. Le FAP sono identificate come cellule CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-integrin-.
Questo protocollo presenta due strategie di gating per isolare la popolazione FAP: utilizzando un reporter endogeno PDGFRα-EGFP o eseguendo la colorazione cellulare con un anticorpo Sca1. I topi reporter knock-in PDGFRα-EGFP (B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J)18 esprimono il gene di fusione H2B-eGFP dal locus endogeno PDGFRα, consentendo una marcatura efficiente e specifica del lignaggio PDGFRα (Figura 3A). Questa linea di mouse è stata precedentemente utilizzata per isolare i FAP Pdgfrα+ ed è davvero molto utile per l'isolamento dei FAP, poiché il reporter GFP fornisce un segnale altamente visibile e specifico19. In alternativa, questo protocollo descrive un metodo di isolamento basato su Sca1 per l'identificazione delle FAP. Sca1 (Ly-6A/E) è comunemente usato per identificare e isolare i FAP nella preparazione muscolare13,16,17. Sca1 è una proteina legata al glicosilfosfatidilinositolo (GPI) da 18 kDa appartenente alla famigliaLy-6 20. Tuttavia, oltre ad essere espressa sulla superficie cellulare delle cellule muscolari progenitrici mesenchimali, l'espressione di Sca1 è osservata anche nelle cellule staminali ematopoietiche (HSC) e nei leucociti maturi e nelle cellule T. In questo protocollo, abbiamo confermato l'idoneità di Sca1 come marcatore FAP eseguendo studi di tracciamento del lignaggio basati su FACS. In particolare, topi PDGFRα-EGFP sono stati impiegati per isolare FAP che esprimono Sca1+/GFP tra popolazioni di cellule mononucleate. Abbiamo scoperto che tutte le cellule che esprimono GFP erano anche positive per Sca1 e negative per CD31, CD45, VCAM-1 e α7-integrina (Figura 4). Questa analisi ha confermato l'uso dell'anticorpo Sca1 come marcatore per le FAP sia nelle FAP quiescenti che in quelle attivate e fornisce i mezzi per l'uso indistinto di entrambe le strategie per isolare le FAP.
In questo protocollo, FAP e MuSC sono stati isolati anche da topi adulti feriti con iniezioni intramuscolari di Notexin, 7 giorni dopo l'infortunio (Figura 5). A seguito di lesioni, MuSCs e FAPs si attivano e proliferano in vivo, raggiungendo il picco di proliferazione tra il giorno 3 e il giorno 4 2,3. Questi cambiamenti nella proliferazione si riflettono in un aumento della percentuale di cellule positive per Sca1/PDFGRα e VCAM-1/α7-integrina. La figura 6 rappresenta la quantificazione di FAP e MuSC nei TA illesi e 7 giorni dopo l'infortunio; Sebbene il picco di proliferazione si osservi tra i giorni 2 e 3 dopo l'infortunio, un basso tasso di cellule proliferanti è ancora apprezzabile 7 giorni dopo l'infortunio. Man mano che i MuSC vengono attivati, c'è un marcato aumento della loro dimensione cellulare21,22. Pertanto, durante l'isolamento di queste celle mediante FACS, è di fondamentale importanza regolare i parametri FSC-A e SSC-A ed espandere il gate per includere quelle celle al centro (Figura 5A).
La purezza delle popolazioni cellulari isolate è stata confermata dall'immunocolorazione di FAP GFP+ e MuSC in cocoltura con anticorpi Pax7. I FAP e i MuSC GFP+ appena isolati sono stati cocoltivati per 48 ore con un rapporto di 1:1 (Figura 3B). I FAP GFP+ non hanno espresso il marcatore Pax7, mentre i MuSC hanno reagito con questo anticorpo. Pertanto, la strategia di gating Lin-/Sca-1+/VCAM-1-/α7-Integrin- e Lin-/Sca-1-/VCAM-1+/α7-Integrin+ è efficace nell'isolare popolazioni pure di FAP e MuSC, rispettivamente.
Figura 1: Panoramica grafica dell'isolamento FAP e MuSC. Panoramica grafica che mostra l'isolamento di FAP e MuSC dai muscoli degli arti posteriori. Il protocollo si applica anche alle cellule isolate dai muscoli TA. In primo luogo, i muscoli vengono raccolti e tritati meccanicamente prima di subire la digestione enzimatica. La miscela muscolare viene quindi elaborata attraverso un ago da 20 G e filtrata per ottenere una sospensione di cellule mononucleate. Le cellule vengono quindi incubate con un cocktail di anticorpi coniugati con fluorofori e infine passano attraverso un selezionatore cellulare per isolare una popolazione pura di FAP e MuSC. Le popolazioni cellulari pure vengono quindi elaborate per l'applicazione a valle. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Profilo FACS rappresentativo di FAP e MuSC quiescenti. (A-H) Strategia di gating per l'isolamento di FAP e MuSC. (A) In primo luogo, i campioni sono controllati per escludere i detriti cellulari e le doppiette (B,C) in base alle proprietà SSC e FSC. (D) Le singole cellule risultanti vengono quindi colorate con 7-AAD per valutarne la vitalità. (E) Le singole cellule 7-AAD negative vengono quindi valutate per APC-CD31/CD45 e Pacific Blue-Sca1 per escludere le cellule positive al lignaggio da ulteriori analisi. (F,G) I singoletti negativi di linea vengono quindi colorati per PE-Cy7-VCAM-1 e PE-α7-integrina. (F) Le FAP sono identificate come cellule CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin- e (G) le MuSC sono identificate come cellule CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+. (H) Isolamento di FAP in topi PDGFRα-EGFP utilizzando un reporter GFP. (I-M) Profilo FACS per i controlli FMO (Fluorescence Minus One) per dimostrare la corretta compensazione e gating. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Validazione di colture cellulari FAP e MuSC. (A) Le FAP appena isolate che esprimono GFP sono state placcate e co-colorate con un anticorpo PDGFRα. I nuclei sono stati colorati con DAPI. Vengono visualizzate le immagini unite della colorazione GFP (verde), PDGFRα (rosso) e DAPI (blu). Barre scala, 25 μm. (B) I FAP appena isolati (verde) e i MuSC sono stati cocoltivati per 48 ore e colorati con Pax7 (rosso). I nuclei sono stati colorati con DAPI. I FAP che esprimono GFP non esprimono Pax7, mentre i MuSC esprimono esclusivamente Pax7 e non sono positivi per GFP, confermando la purezza di entrambe le popolazioni selezionate. Barre della scala, 75 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: I topi PDGFRα-EGFP e l'espressione di Sca1 marcano specificamente le FAP nei topi adulti. Le FAP sono isolate come celle GFP+/Sca1+. Le singole cellule 7-AAD negative sono valutate per APC-CD31/CD45 e GFP-PDGFRα per escludere le cellule positive al lignaggio e distinguere le FAP. Le cellule negative al lignaggio/Sca1 positive sono colorate per PE-Cy7-VCAM-1 e PE-α7-integrina per escludere i MuSC. Le FAP sono identificate come cellule CD31-/CD45-/PDGFRα+/Sca1+/VCAM-1-/α7-integrin-. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Profilo FACS rappresentativo di FAP e MuSC attivati. (A-H) Strategia di gating per l'isolamento di FAP e MuSC attivati. (A) I campioni sono controllati per escludere i detriti cellulari creando grafici di densità FSC-A vs SSC-A. Da notare il cancello allargato per accogliere la popolazione di interesse. (B,C) I campioni vengono ulteriormente controllati per eliminare i doppietti in base alle proprietà SSC e FSC. (D) Le singole cellule risultanti vengono quindi colorate con 7-AAD per valutarne la vitalità. (E) Le singole cellule 7-AAD negative vengono quindi valutate per APC-CD31/CD45 e Pacific Blue-Sca1 per escludere le cellule positive al lignaggio da ulteriori analisi. (F,G) I singoletti negativi di lignaggio vengono quindi colorati per PE-Cy7-VCAM-1 e PE-α7-integrina. (F) Le FAP sono identificate come cellule CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-integrin- e le (G) MuSC sono identificate come cellule CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-integrin+. (H) Isolamento di FAP in topi PDGFRα-EGFP utilizzando un reporter GFP. (I-M) Profilo FACS per i controlli FMO (Fluorescence Minus One) per dimostrare la corretta compensazione e gating. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Quantificazione di FAP e MuSC in TA imperturbati e feriti. Quantificazione di FAP e MuSCs nei muscoli TA illesi e 7 giorni dopo l'infortunio. Il conteggio delle cellule è stato eseguito dividendo il numero di cellule ordinate per mg di muscolo raccolto. ** P < 0,01 tra illesi e feriti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| 7-AAD (μg/ml) |
CD31/CD45-APC (μg/ml) |
Sca1-Blu Pacifico (μg/ml) |
α 7-integrina-PE (μg/ml) |
VCAM-1-Biotina (μg/ml) |
PE-Cy7 Streptavidina (μg/ml) |
||
| Controllo senza macchie | |||||||
| Controlli a colorazione singola | |||||||
| 7-AAD (controllo di vitalità) | 1 | ||||||
| CD31/CD45 | 2 | ||||||
| Sca1 | 5 | ||||||
| α7-integrina | 0.4 | ||||||
| VCAM-1 | 5 | 2 | |||||
| Controlli FMO | |||||||
| FMO 7 AAD | 2 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO CD31/CD45 | 1 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO Sca1 | 1 | 2 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO α7-integrina | 1 | 2 | 5 | 5 | 2 | ||
| FMO VCAM-1 | 1 | 2 | 5 | 0.4 | |||
| Campione sperimentale | |||||||
| Macchia totale | 1 | 2 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | |
Tabella 1: Matrice di colorazione anticorpale. Elenco delle concentrazioni di anticorpi utilizzati per colorare i campioni sperimentali e di controllo. Se si isolano i FAP mediante GFP, la colorazione Sca1 può essere omessa. Eseguire invece il controllo a singola colorazione GFP e GFP FMO.
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Discussion
Stabilire protocolli efficienti e riproducibili per l'identificazione e l'isolamento di popolazioni di cellule staminali adulte pure è il primo e più critico passo verso la comprensione della loro funzione. Le FAP e le MuSC isolate possono essere utilizzate per condurre analisi multiomiche in esperimenti di trapianto come potenziale trattamento per le malattie muscolari o possono essere geneticamente modificate per la modellizzazione della malattia nella terapia con cellule staminali.
Il protocollo qui descritto fornisce linee guida standardizzate per l'identificazione, l'isolamento e la coltura di FAP e MuSC ottenuti dai muscoli degli arti posteriori di topi adulti. Popolazioni pure di FAP e MuSC sono state isolate utilizzando una tecnica basata su FACS e la loro purezza è stata successivamente valutata mediante cellule immunocoloranti con specifici marcatori di superficie cellulare e mezzi genetici.
Il protocollo è costituito da tre sezioni principali che hanno un forte impatto sulla resa di FAP e MuSC: la digestione muscolare meccanica ed enzimatica, la generazione di una sospensione cellulare mononucleata attraverso l'ago da 20 G e l'isolamento finale di singole cellule attraverso FACS.
L'esecuzione di un corretto tritamento muscolare è di fondamentale importanza per rilasciare singole cellule. L'accento dovrebbe essere posto su questo passaggio, poiché raggiungere la dimensione ottimale dei pezzi muscolari dopo la tritatura consente agli enzimi utilizzati per la digestione di funzionare al meglio e impedisce l'intasamento dell'ago utilizzato nella fase 4.1. D'altra parte, l'eccessiva macinazione del muscolo può comportare una scarsa resa cellulare e una ridotta vitalità cellulare, poiché i MuSC vengono rapidamente rilasciati durante la prima digestione e possono essere aspirati nella fase 3.7.2 o 3.8.214. Inoltre, l'efficienza degli enzimi utilizzati per la digestione della preparazione muscolare influisce anche sulla qualità della dissociazione enzimatica, in quanto potrebbe esserci variabilità tra i diversi lotti enzimatici o una diminuzione dell'attività degli enzimi nel tempo23. Pertanto, si consiglia di testare ogni lotto di enzimi per ottimizzare i tempi e la concentrazione della digestione. Inoltre, la concentrazione e la quantità di tempo necessaria per digerire il muscolo possono anche essere influenzate da condizioni patologiche che influenzano la rigidità muscolare. Queste particolari condizioni richiederanno un'ottimizzazione individuale.
La generazione finale di cellule mononucleate avviene facendo passare la sospensione attraverso una siringa da 10 ml con un ago da 20 G. È necessario prestare particolare attenzione quando si esegue questo passaggio per ridurre al minimo il numero di bolle formate poiché il loro scoppio causa ulteriori danni cellulari24.
La sospensione cellulare viene quindi colorata con un cocktail di anticorpi e acquisita con un selezionatore cellulare. Impostare i cancelli corretti è un altro passo critico. Quando si eseguono questi esperimenti, si consiglia vivamente di eseguire i controlli a singola colorazione elencati e i controlli FMO per compensare correttamente lo spillover delle emissioni e tenere conto del segnale di fondo dovuto alla diffusione dello spillover. Ciò è particolarmente importante quando si ha a che fare con proteine fluorescenti luminose come GFP e coloranti indiretti come il complesso VCAM-1-biotina / Stretpavidin-PE-Cy7.
Inoltre, prima di eseguire questo esperimento per la prima volta, è buona norma eseguire una titolazione degli anticorpi utilizzati per rilevare le popolazioni di interesse. Determinare la concentrazione ottimale degli anticorpi è un passo fondamentale per garantire il segnale più luminoso della popolazione positiva ed evitare l'aumento della colorazione di fondo.
Una volta completata la selezione, è importante eseguire un'analisi post-ordinamento sulle celle ordinate per determinarne la purezza e la vitalità. La resa e la vitalità delle cellule selezionate sono fortemente influenzate dalla quantità di tempo necessaria per elaborare il campione e dovrebbero essere prese in considerazione quando si pianifica di elaborare più topi. Inoltre, mantenere le cellule selezionate sul ghiaccio in 2x mezzi arricchiti di siero può aiutare il recupero cellulare e migliorare la loro vitalità.
In questo protocollo, FAP e MuSC sono stati isolati dai muscoli tibiali anteriori di topi illesi e 7 giorni dopo l'iniezione di Notexin. A seguito di una lesione acuta, diverse sottopopolazioni di FAP e MuSC sono state riportate per essere espresse transitoriamente nel tessuto muscolare rigenerante. Malecova e colleghi hanno riportato la presenza di una sottopopolazione di VCAM-1 che esprime FAP che è assente nel muscolo non danneggiato, ha raggiunto il picco tra i giorni 2 e 3 post-infortunio nell'infiammazione acuta e persiste nei topi distrofici murini13. Allo stesso modo, Kafadar e colleghi hanno riportato un aumento transitorio dell'espressione di Sca1 su un piccolo sottogruppo di progenitori miogenici 2 giorni dopo l'infortunio25. Tuttavia, le cellule miogeniche Sca1+ sono diminuite notevolmente 3 giorni dopo l'infortunio25. La presenza di queste sottopopolazioni dovrebbe essere riconosciuta e considerata quando si utilizza questo protocollo per isolare FAP e MuSC nelle fasi precedenti.
In sintesi, questo protocollo descrive un metodo per l'isolamento e la coltura di una popolazione pura di FAP e MuSC isolati da muscoli di topo adulti sani o feriti. L'elevata purezza e vitalità delle celle rendono questo protocollo adatto per ulteriori applicazioni a valle.
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Disclosures
Nessuno.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Tom Cheung (The Hong Kong University of Science & Technology) per i consigli sull'isolamento MuSC. Questo lavoro è stato finanziato dal NIAMS-IRP attraverso le sovvenzioni NIH AR041126 e AR041164.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 20 G BD Needle 1 in. single use, sterile | BD Biosciences | 305175 | |
| anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b) | The University of British Columbia | 53-0010-01 | |
| APC anti-mouse CD31 Antibody | BioLegend | 102510 | |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL | BD Biosciences | 309604 | |
| Biotin anti-mouse CD106 Antibody | BioLegend | 105703 | |
| C57BL/6J mouse (Female and Male) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | 007669 | |
| Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356400 | |
| Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356500 | |
| Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356408 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile | VWR | 414004-265 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11055 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile | Corning | 352340 | |
| Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile | Corning | 353002 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL | VWR | 352196 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning | VWR | 60819-728 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning | VWR | 21008-948 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic) | Promega | G5071 | |
| FlowJo 10.8.1 | |||
| Gibco Collagenase, Type II, powder | ThermoFisher Scientific | 17101015 | |
| Gibco Dispase, powder | ThermoFisher Scientific | 17105041 | |
| Gibco DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher Scientific | 12430054 | |
| Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States | ThermoFisher Scientific | 16000044 | |
| Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix | ThermoFisher Scientific | 11550043 | |
| Gibco Horse Serum, New Zealand origin | ThermoFisher Scientific | 16050122 | |
| Gibco PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Gibco PBS (10x), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | ThermoFisher Scientific | 10378016 | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21127 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools Inc | 14090-09 | |
| Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | ThermoFisher Scientific | A1310 | |
| Mouse PDGF R alpha Antibody | R&D Systems | AF1062 | |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | NC9624464 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher Scientific | 31872 | |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody | BioLegend | 108120 | |
| Paraformaldehyde, 16% | Fisher Scientific | NCC0528893 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| PE/Cyanine7 Streptavidin | BioLegend | 405206 | |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools Inc | 91500-09 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools Inc | 91150-20 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. Muscle as a "mediator" of systemic metabolism. Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite cells and skeletal muscle regeneration. Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers. Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).
- Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
- Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
- Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging. Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).
- Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
- Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
- Eisner, C., et al. Murine tissue-resident PDGFRα+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).
- Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).
- Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
- Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9, 3670 (2018).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).
- Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture. Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).
- Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle. Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
- Contreras, O., et al. Cross-talk between TGF-β and PDGFRα signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors. Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).
- Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma. Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).
- Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert. Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).
- García-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Walls, P. L. L., et al. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
- Kafadar, K. A., et al. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).
