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Artigo de método

Síntese de Nanocompositos de Grafeno-Hidroxiapatita para uso potencial em engenharia de tecido ósseo

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DOI:

10.3791/63985

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27 de julho de 2022

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1Department of Physics, Faculty of Science, Kasetsart University, 2Department of Microbiology, School of Science, RK. University, 3Department of Chemical Engineering, Northeastern University, 4Defence Institute of Advanced Technology Campus, Navyukti Innovations Pvt. Ltd., 5Department of Biomedical Engineering, Hebei University of Technology, 6Department of Chemistry, Saveetha School of Engineering, Institute of Medical and Technical Science, Saveetha University, 7UFPI - Universidade Federal do Piauí

Neste artigo

Resumo

Novos nanocompositos de nanocomibbons de grafeno e nanopartículas de hidroxiapatita foram preparados usando síntese de fase de solução. Esses híbridos quando empregados em andaimes bioativos podem apresentar aplicações potenciais na engenharia de tecidos e regeneração óssea.

Resumo

Desenvolver novos materiais para a engenharia de tecidos ósseos é uma das áreas de impulso mais importantes da nanomedicina. Vários nanocompositos foram fabricados com hidroxiapatita para facilitar a adesão celular, a proliferação e a osteogênese. Neste estudo, nanocompositos híbridos foram desenvolvidos com sucesso usando nanofibons de grafeno (GNRs) e nanopartículas de hidroxiapatita (nHAPs), que quando empregados em andaimes bioativos podem potencialmente melhorar a regeneração tecidual. Essas nanoestruturas podem ser biocompatíveis. Aqui, duas abordagens foram usadas para a preparação dos novos materiais. Em uma abordagem, foi utilizada uma estratégia de co-funcionalização onde o nHAP foi sintetizado e conjugado aos GNRs simultaneamente, resultando em nanoíbridas de nHAP em superfícies GNR (denotadas como nHAP/GNR). A microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução (HRTEM) confirmou que o composto nHAP/GNR é composto por estruturas finas e finas de GNRs (comprimento máximo de 1,8 μm) com manchas discretas (150-250 nm) de nHAP semelhantes a agulhas (40-50 nm de comprimento). Na outra abordagem, o nHAP comercialmente disponível foi conjugado com GNRs formando nHAP revestido de GNR (denotado como GNR/nHAP) (ou seja, com uma orientação oposta em relação ao nanohibrid nHAP/GNR). A nanohíbrida formou-se usando o último método exibiu nanoesferas nHAP com um diâmetro que varia de 50 nm a 70 nm coberto com uma rede de GNRs na superfície. Espectros dispersivos de energia, mapeamento elementar e espectros de infravermelho de transformação Fourier (FTIR) confirmaram a integração bem sucedida de nHAP e GNRs em ambos os nanohibridos. A análise termogravimétrica (TGA) indicou que a perda em temperaturas de aquecimento elevadas devido à presença de GNRs foi de 0,5% e 0,98% para GNR/nHAP e nHAP/GNR, respectivamente. As nanohíbridas nHAP-GNR com orientações opostas representam materiais significativos para uso em andaimes bioativos para potencialmente promover funções celulares para melhorar as aplicações de engenharia de tecidos ósseos.

Introdução

O grafeno possui estruturas bidimensionais semelhantes a folhas compostas de carbono hibridizado sp. Vários outros aotropos podem ser atribuídos à rede estendida de favo de mel de grafeno (por exemplo, o empilhamento de folhas de grafeno forma grafite 3D enquanto rola o mesmo material resulta na formação de nanotubos 1D1). Da mesma forma, fullerenes 0D são formados devido ao embrulho2. O grafeno tem propriedades físico-químicas e optoeletrônicas atraentes que incluem um efeito de campo ambipolar e um efeito hall quântico à temperatura ambiente 3,4. A detecção de eventos de adsorção de molécula única e mobilidade extremamente alta do portador adicionam os atributos atraentes do grafeno 5,6. Além disso, os nanoribbons de grafeno (GNRs) com larguras estreitas e um grande caminho livre médio, baixa resistência com alta densidade atual e alta mobilidade eletrônica são considerados materiais de interconexão promissores7. Assim, os GNRs estão sendo explorados para aplicações em uma miríade de dispositivos, e mais recentemente na nanomedicina, particularmente engenharia de tecidos e entrega de medicamentos8.

Entre várias doenças traumáticas, as lesões ósseas são consideradas uma das mais desafiadoras devido às dificuldades na estabilização da fratura, regeneração e substituição por novos ossos, resistência à infecção e reinlinamento do osso não-uniões 9,10. Os procedimentos cirúrgicos continuam sendo a única alternativa para fraturas no eixo femoral. Deve-se notar que quase US$ 52 milhões são gastos todos os anos no tratamento de lesões ósseas na América Central e na Europa11.

Andaimes bioativos para aplicações de engenharia de tecidos ósseos podem ser mais eficazes incorporando nano-hidroxiapatita (nHAP), pois se assemelham às propriedades micro e nano arquitetônicas do próprio osso12. O HAP, quimicamente representado como Ca10(PO4)6(OH)2 com uma razão molar Ca/P de 1,67, é o mais preferido para aplicações biomédicas, particularmente para o tratamento de defeitos periodontais, a substituição de tecidos duros e a fabricação de implantes para cirurgias ortopédicas13,14. Assim, a fabricação de biomateriais baseados em nHAP reforçados com GNRs pode possuir biocompatibilidade superior e pode ser vantajosa devido à sua capacidade de promover a osseointegração e ser osteocondutiva 15,16. Esses andaimes compostos híbridos podem preservar propriedades biológicas como adesão celular, disseminação, proliferação e diferenciação17. Aqui, relatamos a fabricação de dois novos nanocompositos para a engenharia de tecidos ósseos alterando racionalmente o arranjo espacial de nHAP e GNRs como ilustrado na Figura 1. Foram avaliadas aqui as propriedades químicas e estruturais dos dois diferentes arranjos nHAP-GNRs.

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Protocolo

1. Síntese de nHAP por precipitação

  1. Sintetizar o nHAP imaculado usando 50 mL da mistura de reação contendo 1 M Ca(NO3)2∙4H2O e 0,67 M (NH4)H2PO4 seguido pela adição dropwise de NH4OH (25%) para manter um pH em torno de 1018.
  2. Depois disso, agitar a mistura de reação por irradiação de ultrassom (UI) para 30 min (potência de 500 W e frequência de ultrassom de 20 kHz).
  3. Deixe a solução resultante amadurecer por 120 h à temperatura ambiente até que o precipitado branco do nHAP se instale. Recupere o nHAP por centrifugação a 1398 x g por 5 min a temperatura ambiente.
  4. Lave o precipitado com água deionizada (DI) 3x e liofilize por 48 h. Guarde o pó seco a 4 °C.

2. Preparação de nanocompositos nHAP/GNR

NOTA: Descreve duas abordagens para a fabricação de nanocompagtos nHAP/GNR (i.e., nHAP em superfícies GNR) e nanocompagtos GNR/nHAP (nHAP revestidos de GNR) que representam dois arranjos espaciais diferentes de nHAP e GNRs (Figura 1).

  1. Síntese de nHAP/GNR
    1. Para preparar o nanocomposite nHAP/GNRs, use uma estratégia de co-funcionalização onde o nHAP pode ser sintetizado e conjugado aos GNRs simultaneamente, da seguinte forma.
    2. Dissolva 5 mg de GNRs (Tabela de Materiais) em uma mistura de 1 M de tetrahidrato de nitrato de cálcio [Ca(NO3)2·4H2O] e 0,67 M fosfato de hidrogênio de diamônio [(NH4)2HPO4] a um volume final de 50 mL19.
    3. Durante esta reação, adicione 25% de NH4OH dropwise para manter o pH em ~10. Agitar a mistura resultante por interface do usuário por 30 minutos.
    4. Após a conclusão da reação, deixe a solução imperturbável por 120h em temperatura ambiente até o amadurecimento.
    5. Observe a formação de um precipitado gelatinoso de nHAP que reveste os GNRs, após o qual um precipitado branco de nHAP/GNRs se instala.
    6. Lave o precipitado 3x por centrifugação a 1398 x g por 5 min à temperatura ambiente seguido de re-dispersão em água DI.
    7. Lyophilize o precipitado recuperado por 48 h. Guarde o pó seco a 4 °C.
    8. Use nHAP e GNRs imaculados como amostras de controle.
  2. Síntese de nanocomposite GNR/nHAP
    1. Suspender nHAP comercialmente disponível a uma concentração de 5 mg/mL em 50 mL de água DI suplementada com 5 mg de GNRs.
    2. Agitar a mistura resultante por UI por 30 min e, posteriormente, deixar a mistura intacta por 120 h em temperatura ambiente.
    3. Após a maturação, recupere o precipitado branco da GNR/nHAP resultante por centrifugação a 1398 x g por 5 min a temperatura ambiente.
    4. Lave a amostra 3x usando água DI, liofilize-a por 48 h e armazene o pó seco a 4 °C para uso posterior.

3. Caracterização de nHAP, nHAP/GNR e GNR/nHAP

  1. Use um microscópio eletrônico de transmissão de alta resolução (HRTEM) (ver Tabela de Materiais) para caracterizar a morfologia e o tamanho dos nanocompositos11.
  2. Analise a composição elementar dos nanocompactos que empregam espectroscopia dispersiva de energia (EDS) e realize mapeamento elementar usando o microscópio eletrônico de transmissão de varredura (STEM)11.
  3. Realizar a espectroscopia infravermelha de transformação fourier (FTIR) para as amostras limpas em números de ondas de 500-4000 cm−1 para analisar os grupos químicos no nanocomposite16.
  4. Realize a análise de difração de raios-X em pó (XRD) do nHAP sintetizado como sintetizado utilizando um comprimento de onda de raios-X de 1,5406 Å, configurações de corrente e tensão de 40 mA e 40 kV, respectivamente, e 2φ variando de 20° a 90°.
  5. Avalie a carga percentual de GNR no nanocomposto usando análise termogravimétrica (TGA) aquecendo as amostras da temperatura ambiente a 1000 °C a uma taxa de 10 °C/min sob fluxo de nitrogênio.

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Resultados

Análise hrtem
Individualmente, os GNRs eram estruturas esbeltas semelhantes a bambu com algumas curvas a alguma distância, como observado na Figura 2. O GNR mais longo foi de 1,841 μm, enquanto o menor GNR dobrado foi de 497 nm. Os nanoribbons frequentemente mostravam uma variação visível na largura que poderia ser atribuída à torção para formar configurações helicoidais em muitos lugares. Esse alinhamento unidirecional das GNRs pode ajudar a obter características atraent...

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Discussão

Embora vários metais, polímeros, cerâmicas e suas combinações tenham sido pesquisados como implantes ortopédicos e acessórios de fixação, o HAP é considerado um dos materiais mais preferenciais devido à sua semelhança química com o próprio osso e consequente alta citocompatibilidade 20,21,22. Neste estudo, a orientação do HAP foi variada, o que pode ter um impacto significativo em suas propriedades únicas, como promoção da osteo...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

Dr. Sougata Ghosh reconhece o Departamento de Ciência e Tecnologia (DST), Ministério da Ciência e Tecnologia, Governo da Índia e Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research, Índia, para financiamento sob a Bolsa de Pós-Doutorado no Exterior em Nano Ciência e Tecnologia (Ref. JNC/AO/A.0610.1(4) 2019-2260 de 19 de agosto de 2019). Dr. Sougata Ghosh reconhece a Universidade Kasetsart, Bangkok, Tailândia para uma Bolsa de Pós-Doutorado, e financiamento sob o Programa Universitário reinventante (Ref. 6501.0207/10870 a partir de 9 de novembro de 2021). Os autores gostariam de agradecer ao Kostas Advanced Nano-Characterization Facility (KANCF) pela ajuda com os experimentos de caracterização. KanCF é uma instalação multidisciplinar compartilhada de pesquisa e educação dentro do Kostas Research Institute (KRI) da Northeastern University.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Fosfato de amônio monobásicoSigma-Aldrich216003-100GSíntese
Nitrato de cálcio tetrahidratadoSigma-Aldrich237124
CentrífugaHettichEBA 200S
Recuperação Espectrômetro infravermelho com transformada de FourierBruckerVertex 70Caracterização
Nanofitade grafenoSigma-Aldrich922714Síntese
Microscópio eletrônico de transmissão de alta resoluçãoThermo Fisher ScientificThemis Titan 300Caracterização
Agitador magnéticoIKAC-MAG HS7 S68
Funcionalização MicropipetasTreffLab06H35687Preparação de reagentes
Medidor de pHEutech pH5+ECPH503PLUSKPreparação de reagentes
Analisador termogravimétricoTA InstrumentsSDT Q600Caracterização
Banho ultra-sónicoBandelinDT100Funcionalização
Universal FornoMemmertUF55Funcionalização
Balança de pesagemPrecisaXB220APreparação de reagentes
Difratómetro de raios XBruckerD8-Caracterização Avançada
de síntese

Referências

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