Summary

Coloração tridimensional de rim inteiro com CUBIC

Published: July 18, 2022
doi:

Summary

O presente protocolo descreve um método de clareamento tecidual e coloração imunofluorescente de montagem completa para imagens renais tridimensionais (3D). Esta técnica pode oferecer perspectivas macroscópicas na patologia renal, levando a novas descobertas biológicas.

Abstract

Embora a patologia convencional fornecesse inúmeras informações sobre a microestrutura renal, era difícil saber a estrutura precisa dos vasos sanguíneos, túbulos proximais, ductos coletores, glomérulos e nervos simpáticos no rim devido à falta de informações tridimensionais (3D). A limpeza óptica é uma boa estratégia para superar esse grande obstáculo. Múltiplas células em um órgão inteiro podem ser analisadas em resolução de célula única, combinando limpeza de tecido e técnica de imagem 3D. No entanto, os métodos de marcação celular para imagens de órgãos inteiros permanecem subdesenvolvidos. Em particular, a coloração de órgãos de montagem inteira é um desafio devido à dificuldade de penetração de anticorpos. O presente protocolo desenvolveu uma coloração renal de camundongo de montagem completa para imagens 3D com o método de clareamento tecidual CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis). O protocolo possibilitou visualizar a denervação simpática renal após lesão de isquemia-reperfusão e glomerulomegalia no estágio inicial da doença renal diabética de um ponto de vista abrangente. Assim, esta técnica pode levar a novas descobertas na pesquisa renal, fornecendo uma perspectiva macroscópica.

Introduction

O rim é composto por várias populações celulares. Embora a patologia convencional nos dê muita informação sobre o microambiente renal, a imagem tridimensional (3D) é necessária para entender com precisão o crosstalk intercelular durante a progressão da doença renal. No passado, um grande número de cortes seriados e reconstrução de imagens precisava ser realizado para a imagem 3D de todo o órgão1. No entanto, este método exigiu muito esforço e teve problemas em termos de reprodutibilidade.

A limpeza óptica é uma boa estratégia para superar esse obstáculo 2,3. A opacidade tecidual é principalmente devido à dispersão e absorção de luz, porque cada órgão consiste em várias substâncias, incluindo água, proteínas e lipídios. Assim, a estratégia básica de clareamento tecidual é a substituição de água e lipídios nos tecidos por reagentes correspondentes ao índice de refração (IR) que possuem as mesmas propriedades ópticas que as proteínas4. Para observar um espécime transparente, uma microscopia fluorescente de folha de luz é útil5. As folhas de luz iluminam a amostra transparente de lado, e os sinais de excitação são adquiridos através da lente objetiva localizada em uma posição vertical6. Esta microscopia obtém informações de seção transversal em uma única varredura, que é diferente da microscopia fluorescente confocal ou multifóton. Assim, ele pode adquirir rapidamente imagens z-stack com um baixo nível de fotobranqueamento.

Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) é um dos métodos de clareamento tecidual que permite a imagem de órgãos inteiros por microscopia fluorescente de folha de luz 2,7,8. A coloração CUBIC e imunofluorescente de montagem completa são otimizadas no presente estudo para visualizar estruturas 3D renais de camundongos 9,10,11. Utilizando esse método de coloração de montagem completa, a alteração nos nervos simpáticos renais é visualizada após lesão de isquemia-reperfusão 9,10 e glomerulomegalia no estágio inicial da doença renal diabética 11, bem como vasos sanguíneos, túbulos proximais e ductos coletores em um rim inteiro9.

Protocol

Todos os experimentos foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Tóquio. Todos os procedimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes do National Institutes of Health. Camundongos machos C57BL/6NJcl, com 8 semanas de idade, foram utilizados para o presente estudo. Os camundongos foram obtidos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais). 1. Preparação animal e fixação renal Realize a fixação …

Representative Results

Utilizando esse método de coloração, foram visualizados nervos simpáticos [anticorpo antitirosina hidroxilase (TH)] e artérias [anticorpo anti-actina do músculo liso (αSMA) anti-α] em um rim inteiro (Figura 4A,B e Vídeo 1)9. Nervos simpáticos renais anormais também foram visualizados após lesão de isquemia/reperfusão (IRA)9,10 (Figura 4C</str…

Discussion

O presente protocolo permitiu a imagem 3D de todo o rim de várias estruturas, como nervos simpáticos, ductos coletores, artérias, túbulos proximais e glomérulos 9,10,11. Esse método de coloração ofereceu observação macroscópica e levou a novas descobertas biológicas, visualizando a alteração dos nervos simpáticos renais após lesão de isquemia-reperfusão 9,10 e glomerulomegalia…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Parte deste trabalho foi realizado através da colaboração com o Prof. Hiroki R. Ueda (Universidade de Tóquio), Prof. Etsuo A. Susaki (Universidade de Juntendo), Prof. Tetsuhiro Tanaka (Universidade de Tohoku), Prof. Masafumi Fukagawa, Dr. Takehiko Wada e Dr. Hirotaka Komaba (Universidade de Tokai).

Materials

14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube Falcon 352059 Tissue clearing, staining, wash
2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine Tokyo Chemical Industry D1876 CUBIC-R+
37%-Formaldehyde Solution Nacalai Tesque 16223-55 Post fixation
4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution Nacalai Tesque 09154-85 Kidney fixation
Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody Invitrogen A-21436 Secondary antibody (1:100)
Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody Invitrogen A-31573 Secondary antibody (1:200)
Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody Abcam ab199975 Primary antibody (1:100)
Anti-podocin antibody Sigma-Aldrich P0372 Primary antibody (1:100)
Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody Abcam ab85626 Primary antibody (1:100)
Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody Abcam ab113 Primary antibody (1:100)
Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody Abcam ab5694 Primary antibody (1:200)
Blocker Casein in PBS Thermo Fisher Scientific 37528 Staining buffer
Butorphanol Tartrate Meiji 005526 Anesthetic
C57BL/6NJcl Nippon Bio-Supp.Center N/A Mouse strain
Imaris Bitplane N/A Imaging analysis software
Macro-zoom microscope OLYMPUS MVX10 The observation unit of the custom-built microscope
Medetomidine Hydrochloride Kyoritsu-Seiyaku 008656 Anesthetic
Midazolam SANDOZ 27803229 Anesthetic
Mineral oil Sigma-Aldrich M8410 Immersion oil
N-buthyldiethanolamine Tokyo Chemical Industry B0725 CUBIC-L, CUBIC-R+
Nicotinamide Tokyo Chemical Industry N0078 CUBIC-R+
Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100 Nacalai Tesque 12967-45 CUBIC-L, PBST
Silicon oil HIVAC-F4 Shin-Etsu Chemical 50449832 Immersion oil
Sodium azide Wako 195-11092 Staining buffer

Referências

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Citar este artigo
Hasegawa, S., Nangaku, M. Whole-Kidney Three-Dimensional Staining with CUBIC. J. Vis. Exp. (185), e63986, doi:10.3791/63986 (2022).

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