O presente protocolo descreve um método de clareamento tecidual e coloração imunofluorescente de montagem completa para imagens renais tridimensionais (3D). Esta técnica pode oferecer perspectivas macroscópicas na patologia renal, levando a novas descobertas biológicas.
Embora a patologia convencional fornecesse inúmeras informações sobre a microestrutura renal, era difícil saber a estrutura precisa dos vasos sanguíneos, túbulos proximais, ductos coletores, glomérulos e nervos simpáticos no rim devido à falta de informações tridimensionais (3D). A limpeza óptica é uma boa estratégia para superar esse grande obstáculo. Múltiplas células em um órgão inteiro podem ser analisadas em resolução de célula única, combinando limpeza de tecido e técnica de imagem 3D. No entanto, os métodos de marcação celular para imagens de órgãos inteiros permanecem subdesenvolvidos. Em particular, a coloração de órgãos de montagem inteira é um desafio devido à dificuldade de penetração de anticorpos. O presente protocolo desenvolveu uma coloração renal de camundongo de montagem completa para imagens 3D com o método de clareamento tecidual CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis). O protocolo possibilitou visualizar a denervação simpática renal após lesão de isquemia-reperfusão e glomerulomegalia no estágio inicial da doença renal diabética de um ponto de vista abrangente. Assim, esta técnica pode levar a novas descobertas na pesquisa renal, fornecendo uma perspectiva macroscópica.
O rim é composto por várias populações celulares. Embora a patologia convencional nos dê muita informação sobre o microambiente renal, a imagem tridimensional (3D) é necessária para entender com precisão o crosstalk intercelular durante a progressão da doença renal. No passado, um grande número de cortes seriados e reconstrução de imagens precisava ser realizado para a imagem 3D de todo o órgão1. No entanto, este método exigiu muito esforço e teve problemas em termos de reprodutibilidade.
A limpeza óptica é uma boa estratégia para superar esse obstáculo 2,3. A opacidade tecidual é principalmente devido à dispersão e absorção de luz, porque cada órgão consiste em várias substâncias, incluindo água, proteínas e lipídios. Assim, a estratégia básica de clareamento tecidual é a substituição de água e lipídios nos tecidos por reagentes correspondentes ao índice de refração (IR) que possuem as mesmas propriedades ópticas que as proteínas4. Para observar um espécime transparente, uma microscopia fluorescente de folha de luz é útil5. As folhas de luz iluminam a amostra transparente de lado, e os sinais de excitação são adquiridos através da lente objetiva localizada em uma posição vertical6. Esta microscopia obtém informações de seção transversal em uma única varredura, que é diferente da microscopia fluorescente confocal ou multifóton. Assim, ele pode adquirir rapidamente imagens z-stack com um baixo nível de fotobranqueamento.
Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) é um dos métodos de clareamento tecidual que permite a imagem de órgãos inteiros por microscopia fluorescente de folha de luz 2,7,8. A coloração CUBIC e imunofluorescente de montagem completa são otimizadas no presente estudo para visualizar estruturas 3D renais de camundongos 9,10,11. Utilizando esse método de coloração de montagem completa, a alteração nos nervos simpáticos renais é visualizada após lesão de isquemia-reperfusão 9,10 e glomerulomegalia no estágio inicial da doença renal diabética 11, bem como vasos sanguíneos, túbulos proximais e ductos coletores em um rim inteiro9.
O presente protocolo permitiu a imagem 3D de todo o rim de várias estruturas, como nervos simpáticos, ductos coletores, artérias, túbulos proximais e glomérulos 9,10,11. Esse método de coloração ofereceu observação macroscópica e levou a novas descobertas biológicas, visualizando a alteração dos nervos simpáticos renais após lesão de isquemia-reperfusão 9,10 e glomerulomegalia…
The authors have nothing to disclose.
Parte deste trabalho foi realizado através da colaboração com o Prof. Hiroki R. Ueda (Universidade de Tóquio), Prof. Etsuo A. Susaki (Universidade de Juntendo), Prof. Tetsuhiro Tanaka (Universidade de Tohoku), Prof. Masafumi Fukagawa, Dr. Takehiko Wada e Dr. Hirotaka Komaba (Universidade de Tokai).
14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube | Falcon | 352059 | Tissue clearing, staining, wash |
2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine | Tokyo Chemical Industry | D1876 | CUBIC-R+ |
37%-Formaldehyde Solution | Nacalai Tesque | 16223-55 | Post fixation |
4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Nacalai Tesque | 09154-85 | Kidney fixation |
Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody | Invitrogen | A-21436 | Secondary antibody (1:100) |
Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | A-31573 | Secondary antibody (1:200) |
Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody | Abcam | ab199975 | Primary antibody (1:100) |
Anti-podocin antibody | Sigma-Aldrich | P0372 | Primary antibody (1:100) |
Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody | Abcam | ab85626 | Primary antibody (1:100) |
Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody | Abcam | ab113 | Primary antibody (1:100) |
Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody | Abcam | ab5694 | Primary antibody (1:200) |
Blocker Casein in PBS | Thermo Fisher Scientific | 37528 | Staining buffer |
Butorphanol Tartrate | Meiji | 005526 | Anesthetic |
C57BL/6NJcl | Nippon Bio-Supp.Center | N/A | Mouse strain |
Imaris | Bitplane | N/A | Imaging analysis software |
Macro-zoom microscope | OLYMPUS | MVX10 | The observation unit of the custom-built microscope |
Medetomidine Hydrochloride | Kyoritsu-Seiyaku | 008656 | Anesthetic |
Midazolam | SANDOZ | 27803229 | Anesthetic |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Immersion oil |
N-buthyldiethanolamine | Tokyo Chemical Industry | B0725 | CUBIC-L, CUBIC-R+ |
Nicotinamide | Tokyo Chemical Industry | N0078 | CUBIC-R+ |
Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | CUBIC-L, PBST |
Silicon oil HIVAC-F4 | Shin-Etsu Chemical | 50449832 | Immersion oil |
Sodium azide | Wako | 195-11092 | Staining buffer |