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Artigo de método

Facilitando a cultura organoide cerebral através da iluminação lateral da luz suave

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DOI:

10.3791/63989

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6 de junho de 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Major Obstetric Diseases, The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 2Key Laboratory of Reproduction and Genetics of Guangdong Higher Education Institutes, 3School of Biotechnology and Health Sciences, Wuyi University

Neste artigo

Resumo

Organoides cerebrais oferecem oportunidades sem precedentes para estudar o desenvolvimento de órgãos e a patologia da doença humana. Embora tenha sido alcançado grande sucesso com sistemas de cultura organoides cerebrais, ainda há dificuldades operacionais na aplicação dessa tecnologia. O presente protocolo descreve um procedimento organoide cerebral que facilita a mudança média e a transferência organoide.

Resumo

Atualmente, a tecnologia de cultura organoide cerebral ainda é complicada de operar e difícil de aplicar em larga escala. É necessário encontrar uma solução simples e prática. Portanto, um protocolo organoide cerebral mais viável é proposto no presente estudo. Para resolver o inevitável inconveniente na mudança média e na transferência organoide no estágio inicial, a pesquisa atual otimiza a tecnologia de operação aplicando o princípio da engenharia. Uma lâmpada de luz macia foi adotada para iluminar lateralmente as amostras do corpo embrionário (EB), permitindo que os EBs fossem vistos a olho nu através do efeito de reflexão difusa aprimorado. Utilizando o princípio do fluxo secundário gerado pela rotação, os organoides se reúnem em direção ao centro do poço, o que facilita o funcionamento de mudança média ou transferência organoide. Comparado com a célula dispersa, o corpo embrionário se instala mais rápido na pipeta. Usando este fenômeno, a maioria das células livres e fragmentos de células mortas podem ser efetivamente removidos de forma simples, impedindo que os EBs incorram em danos causados por centrifugação. Este estudo facilita o funcionamento da cultura organoide cerebral e ajuda a promover a aplicação de organoides cerebrais.

Introdução

Em comparação com sistemas de cultura bidimensionais (2D), sistemas de cultura tridimensionais (3D) têm várias vantagens, incluindo replicação genuína e reprodução eficiente de estruturas complexas de determinados órgãos1. Portanto, organoides cerebrais são um dos importantes métodos auxiliares para os campos de pesquisa do desenvolvimento cerebral humano e da doença2, rastreamento de drogas e terapia celular.

A colheita de organoides cerebrais pelo método de suspensão rotativa é propícia ao seu desenvolvimento e maturação3. Embora os sistemas de cultura organoide cerebral tenham alcançado grande sucesso, eles ainda enfrentam desafios críticos que limitam sua aplicação. Por exemplo, o cultivo manual envolve etapas complicadas de manipulação e introduz obstáculos para alcançar aplicações em larga escala. Além disso, em cada estágio de desenvolvimento na cultura dos organoides cerebrais, são necessárias mudanças em diferentes mídias e citocinas4. No entanto, no estágio inicial, os organoides ou EBs têm tamanhos minúsculos (aproximadamente 200 μm a 300 μm) e são quase visualmente inacessíveis sem aparelhos apropriados. Inevitavelmente, uma certa quantidade de amostras organoides preciosas são lavadas quando o meio é alterado. Muitas técnicas têm sido exploradas para superar isso em outros tipos de culturas organoides, e alguns exemplos incluem a imersão de chips organoides inteiros em um meio de cultura por 3 dias sem intervenção5; adicionando um meio fresco através do deslizamento de tampas depois que o meio antigo é absorvido usando papel absorvente5; ou aplicar dutos microfluidos complexos para troca de fluidos 6,7,8. Outro obstáculo encontrado no estágio inicial do cultivo organoide é a dificuldade de alcançar observações diretas a olho nu, o que pode causar más operações que levam a danos organoides e perda durante as etapas de transferência organoide. Portanto, é necessário estabelecer um protocolo mais viável que facilite a mudança média e a transferência organoide para gerar organoides.

Propõe-se uma operação otimizada correspondente com base nos princípios da engenharia para superar esses problemas, o que facilita significativa e convenientemente muitos procedimentos organoides. Na natureza, quando o sol brilha em uma casa através de uma abertura de janela, o olho nu pode ver a poeira dançando no feixe de luz. Devido ao reflexo difuso da luz solar sobre a poeira, alguma luz é refratada no globo ocular para produzir uma imagem visual. Inspirado no princípio desse fenômeno 9,10, este estudo fez uma lâmpada de luz macia e iluminou os EBs lateralmente. Verificou-se que os EBs poderiam ser visualmente claros sem afetar o escopo de visualização. Um fluxo secundário apontando para o centro é gerado no líquido girando a placa de cultura devido às correntes de eddy11. EBs originalmente dispersos se acumulam no centro da placa. Com base nisso, e no fenômeno de que a velocidade de sedimentação dos organoides é mais rápida que a das células, propõe-se um método de operação fácil de mudança média e transferência organoide sem centrifugação. Os organoides no meio da cultura podem ser efetivamente separados de células livres e fragmentos de células mortas através desta operação de transferência.

Aqui, um protocolo de fácil funcionamento é proposto para gerar organoides cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes humanas. A tecnologia de operação foi otimizada aplicando o princípio da engenharia, tornando as operações na cultura 3D tão simples e viáveis quanto as da cultura 2D. O método de troca de líquidos melhorado e a operação de transferência organoide também são úteis para outros tipos de cultura organoide e o projeto de máquinas de cultura automática.

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Protocolo

O protocolo foi conduzido após a Declaração de Helsinque. A aprovação foi concedida pelo Comitê de Ética do Terceiro Hospital Afiliado da Universidade Médica de Guangzhou (Revisão Médica e Ética [2021] Nº 022). Antes do experimento, cada meio foi preparado de acordo com a fórmula12 de Juergen A. Knoblich (Tabelas Suplementares 1-4), ou um Kit Organoide Cerebral comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais). Os iPSCs utilizados neste estudo foram previamente estabelecidos pelo nosso laboratório e obtiveram isenção informada. Os SCA3-iPSCs foram gerados a partir de uma ataxia spinocerebellar fêmea de 31 anos de idade genótipo 3 (SCA3) genótipado como abrigando 26/78 CAG repetições no gene ATXN313 (Figura Suplementar 1A). Os iPSCs humanos normais mencionados em artigo anterior foram selecionados como NC-iPSCs14, e o gene ATXN3 foi identificado como tendo repetições de CAG 14/14 (Figura Suplementar 1B).

1. Preparação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs)

  1. Coletar 3 mL de sangue periférico por venipuntura com o consentimento informado de voluntários e pacientes.
  2. Isole as células mononucleares periféricas de acordo com o método Ficoll-Paque15.
  3. Estabelecer iPSCs de acordo com o protocolo do Kit de Reprogramação Sendai (ver Tabela de Materiais).
    1. Cultura os iPSCs com mTeSR1 médio em placas de Petri de 35 mm cobertas com Matrigel (uma matriz de membrana de porão, ver Tabela de Materiais). Mude o meio todos os dias. A densidade de crescimento do IPSC não deve exceder 75%.
    2. Digerir as células com solução de dissociação de PSC (ver Tabela de Materiais) e subcultura-las a uma razão de 1:5 a cada 3-5 dias.
      ATENÇÃO: O vírus Sendai é usado aqui. Deve ser operado no gabinete de biossegurança, e medidas de autoproteção devem ser tomadas. Deve ficar claro se pode ser usado legalmente no país local. As leis e regulamentos locais de biossegurança devem ser rigorosamente seguidos quando utilizados.

2. Preparação do EB (dias 0-1)

  1. Retire o meio mTeSR1 dos iPSCs com uma pipeta e lave-o 2x com 1 mL de 1x PBS.
  2. Remova o PBS com uma pipeta e adicione 300 μL de solução de descolamento celular (ver Tabela de Materiais) para digerir os iPSCs em células únicas por 3-4 min a 37 °C.
  3. Resuspenda as células em 2 mL de meio de formação de EB (Tabela Suplementar 1) e, em seguida, centrifugar a amostra por 5 min a 300 x g (temperatura ambiente).
  4. Pré-tre a placa especializada de 24 poços com solução anti-adesão enxaguante (500 μL/well) por 5 min (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: A solução de lavagem anti-adesão é essencial para a formação ideal de EB e esferoide.
  5. Resuspentive as células em meio de formação de EB contendo Y-27632 (concentração final, 10 μM, ver Tabela de Materiais), com densidade celular de 1,5 x 106 células/mL.
  6. Remova a solução anti-adesão e enxágue cada poço com 2 mL de meio de formação de EB.
  7. Adicione as células às placas especializadas de 24 poços a uma densidade de 3 x 106 células/bem (Figura 1A, à esquerda).
    NOTA: Normalmente, 300 EBs podem ser preparados em cada poço. Este método pode preparar grandes quantidades de EBs do mesmo tamanho.
  8. Centrifugar a placa a 100 x g por 2 min a temperatura ambiente. Distribua uniformemente as células em cada câmara na parte inferior da placa (Figura 1A, à direita).
    NOTA: Se não houver centrífuga adequada, a placa também pode ser diretamente colocada na incubadora para cultura estática, mas o tempo de formação da bola EB será várias horas mais tarde do que o sob centrifugação normal.
  9. Incubar as amostras a 37 °C e 5% de CO2 por 24 h. Se a centrifugação não foi utilizada na etapa anterior, incubar por 36 h. Mantenha a amostra estável e não a tire da incubadora durante esse período.

3. Preparação da lâmpada de luz macia (dia 1)

  1. Use uma placa de acrílico transparente com uma espessura de 0,3-0,5 cm no tamanho do papel A5. Cole almofadas brancas na frente e atrás da placa acrílica.
    1. Instale uma fileira de luzes brancas led na borda da placa para que as luzes possam entrar pelo lado da placa acrílica e, em seguida, disparar em paralelo (Figura Suplementar 2A-F, Figura 1B).
      NOTA: Como os diâmetros dos EBs no estágio inicial são de aproximadamente 200 μm a 300 μm, é difícil observá-los claramente a olho nu sob a lâmpada fluorescente de bancos limpos. Em contraste, devido ao aprimoramento da reflexão difusa, podemos detectar claramente os EBs usando luz suave iluminada lateralmente (Figura 1B, C). Uma placa de 6 poços é recomendada para culturas EB em experimentos subsequentes. No entanto, para mostrar melhor o efeito visual da luz suave, os pratos às vezes são usados para tirar fotos e vídeos neste estudo em vez de pratos, por isso, por favor, não entenda mal. A lâmpada de luz macia iluminada lateralmente também pode ser usada para a placa de 6 poços.

4. Transferência de EB e substituição média (dias 2-5)

  1. Prepare uma nova placa de adesão de 6 poços e adicione 2 mL de meio de formação EB a cada poço.
  2. Remova os EBs junto com o meio com uma ponta de pipeta de 1000 μL (ver Tabela de Materiais) e transfira-os para a placa de adesão de 6 poços (~100 EBs/well).
    NOTA: O processo de operação adota uma lâmpada de luz macia (mencionada na etapa 3.) para tornar os EBs mais fáceis de observar. Desligue outras fontes de luz interior para obter melhor o efeito visual da luz suave.
  3. Substitua pelo mesmo volume de meio de formação de EB fresco todos os dias. Use o fluxo secundário para reunir os EBs para o centro e alterar o meio.
    1. Aspire o velho meio por pipetar até a borda do poço lentamente. Não chupe muito forte; caso contrário, os EBs serão removidos juntos. Em seguida, adicione meio fresco para resuspensar os EBs.
      NOTA: O fluxo secundário de princípio (Figura 1D). Induzir um fluxo de redemoinho girando o prato ao longo de uma órbita circular. Devido ao fluxo de redemoinho, um fluxo secundário é induzido direcionado para o centro. Os EBs ou organoides convergem para o centro do poço devido ao fluxo secundário gerado através da rotação, após o qual a mudança média ou a transferência embrionária podem ser executadas prontamente.

5. Verificar a pluripotência rotulando com marcador de pluripotência OCT4 (dia 4)

NOTA: Quando o diâmetro dos EBs for superior a 300 μm, leve vários EBs para coloração de imunofluorescência marcador OCT4 para detectar sua pluripotência.

  1. Fixar os EBs em 4% de paraformaldeído a 4 °C por 30 min, seguido de lavagem em 1x PBS 3x por 10 min cada vez.
  2. Transfira os EBs para PBS de temperatura ambiente contendo 0,3% Triton X-100 e 3% BSA por 2 h, seguido de lavagem em PBS 3x por 10 min cada vez.
    NOTA: Após serem tratados com o TR X-100, os EBs flutuam na superfície líquida e podem ser facilmente sugados com o líquido durante a limpeza. Recomenda-se a operação sob um estereótipo.
  3. Diluir o anticorpo primário OCT4 (ver Tabela de Materiais) com 1 mL de 1x PBS contendo 1% de BSA a uma proporção de 1:200 e adicionar aos EBs para incubação a 4 °C durante a noite, em seguida, lavar em PBS 3x por 10 minutos cada vez.
  4. Diluir o respectivo anticorpo secundário (ver Tabela de Materiais) com 1x PBS às 1:500 e adicionar 1 mL aos EBs.
  5. Depois de incubar à temperatura ambiente por 2h, lave as células em 1x PBS 3x por 10 minutos cada vez.
  6. Retire o PBS, adicione 2 mL de solução PBS 1x contendo 1 μg/mL DAPI, incubar em temperatura ambiente por 10 minutos e depois lavar em PBS 3x por 10 minutos cada vez.
  7. Mova o EB contendo uma pequena quantidade de líquido no slide, sele o slide com um vidro de cobertura revestido com geleia de petróleo comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) na borda e, em seguida, observe e colete a imagem sob o microscópio confocal de fluorescência.
    NOTA: A expressão OCT4 representa a pluripotência EB12. Quando a expressão de OCT4 for inferior a 90%, os EBs devem ser descartados, e os EBs devem ser preparados novamente.

6. Indução neural (dias 5-7)

  1. Prepare uma nova placa de 6 poços com baixa adesão e adicione 3 mL de meio de indução neural (Tabela Suplementar 2) a cada poço.
  2. Ligue a luz suave lateral (mencionada na etapa 3.) e desligue outras fontes de luz interior.
  3. Transfira os EBs para a placa de 6 poços com meio de indução neural adicionado (~100 EBs/bem). Adicione o mínimo possível do meio original ao novo poço.
    NOTA: Introduza habilidades simples de transferência oforganoid. Naturalmente, sob gravidade e com uma densidade relativamente maior do que o médio, os EBs resuspended afundarão gradualmente aplicando a operação mostrada na Figura 1E. Assim, os EBs podem ser convenientemente transferidos. Uma vez que, em comparação com os EBs, células livres e fragmentos de células mortas afundam mais lentamente, a maioria das células livres e fragmentos de células mortas podem, assim, ser removidos através deste método de sedimentação (Figura 1F).
  4. Incubar as amostras a 37 °C e 5% de CO2 por 24 h.
    NOTA: Sob o microscópio, o diâmetro dos EBs era de aproximadamente 500 μm, e a borda era translúcida, indicando que uma camada neuroepitelial se formou.
  5. Prossiga para o próximo passo.

7. Incorporação na matriz de membrana do porão (dias 7-10)

  1. Coloque a matriz de membrana em uma geladeira de 4 °C com 60 minutos de antecedência para dissolver. Calcule a quantidade da matriz necessária com antecedência. Aproximadamente 100 EBs foram incorporados em 1,5 mL da matriz de membrana.
  2. Ligue a luz lateral e desligue a fonte de luz na parte superior do console.
  3. Mantenha a matriz de membrana no gelo para evitar a solidificação.
  4. Transfira uma pequena quantidade de EBs para um prato de 60 mm contendo meio de expansão fresco (Tabela Suplementar 3) cada vez. Reduza o número de EBs para facilitar a remoção de um único EB.
  5. Em seguida, use uma nova placa de adesão de 6 poços baixos. Chupe um único EB (contendo aproximadamente 10 μL médio) com uma ponta de pipeta de 200 μL (ver Tabela de Materiais) cada vez, e depois adicione-o ao fundo da placa de 6 poços para fazer gotículas. Use cinco gotículas por poço.
    NOTA: A chave é ajustar o alcance da arma pipeta para 50 μL e chupar um EB e, em seguida, referir-se ao funcionamento da Figura 1E. Quando o EB se acomoda ao furo da ponta da pipeta, a ponta toca rapidamente o fundo da placa e empurra aproximadamente 10 μL de líquido para formar uma gota.
  6. Adicione 15 μL da matriz de membrana a cada gota contendo EB e misture-a rapidamente. Incorpore a bola EB no centro da gota.
    NOTA: Os EBs não devem ser aspirados com uma ponta de pipeta padrão, que danifica o EB. A ponta de pipeta de 200 μL precisa ser usada em seu lugar.
  7. Coloque a placa de 6 poços em uma incubadora de 37 °C por 30 minutos e solidifique as gotículas da matriz de membrana que contêm EBs.
  8. Adicione 3 mL do meio de expansão a cada poço e exploda suavemente os EBs incorporados pela matriz para suspendê-los.
  9. Incubar a 37 °C e 5% de CO2 por 3 dias.
    NOTA: Se a brotação na superfície da EB for observada, significa que um neuroepithelium expandido foi formado16.

8. Maturação organoide (dias 10-40)

  1. Retire suavemente o meio original e adicione 3 mL de meio de maturação (Tabela Suplementar 4) a cada poço.
  2. Coloque a placa organoide em um agitador horizontal em uma incubadora de 37 °C.
  3. Continue a girar a cultura horizontalmente. Coloque o agitador na velocidade apropriada.
    NOTA: Ao esculpir organoides cerebrais em uma placa de 6 poços, uma força centrífuga relativa (RCF) de 0,11808 x g é mais apropriada, de acordo com o fabricante do agitador horizontal (ver Tabela de Materiais). De acordo com a conversão entre a força centrífuga relativa e a velocidade rotativa17,18, RCF = 1,118 x 10-5 × R × rpm2, onde RCF = força centrífuga relativa (g), rpm = revoluções por minuto (r/min) e R = raio de rotação (cm), também conhecido como arremesso de tremor. Os parâmetros de arremesso de diferentes shakers podem ser diferentes. Portanto, pode-se estimar que a velocidade rotativa seja rpm = 299 x (RCF/R)1/2.
  4. Mude o meio de maturação fresco a cada 2-3 dias.
  5. Após 20-30 dias, gradualmente cultura os organoides cerebrais até a maturidade.
    NOTA: Durante esse período, os organoides podem ser usados para experimentos e detecção, como detecção de marcadores neurais e sequenciamento de transcriptome 19,20,21.

9. Seções congeladas e imunofluorescência de organoides cerebrais

  1. Fixar os organoides em 4% de paraformaldeído a 4 °C por 16 h e depois lavá-los 3x com 1x PBS por 10 min cada vez.
  2. Remova o PBS e mergulhe os organoides em 30% de sacarose a 4 °C durante a noite.
  3. Incorpore os organoides em 10%/7,5% de gelatina/sacarose a 37 °C por 1h e, em seguida, transfira rapidamente para o molde de incorporação.
  4. Adicione gelo seco a 100% etanol para preparar um chorume seco de gelo/etanol, e coloque as amostras organoides nele para congelamento rápido.
  5. Armazene as amostras congeladas em um congelador de −80 °C. Quando necessário, faça seções congeladas com uma espessura de 20 μm.
  6. Consulte as etapas 5.3.-5.5. para imunofluorescência. Use o anticorpo PAX6 para rotular células progenitoras apical, o anticorpo TUJ1 (ver Tabela de Materiais) para rotular células neuronais 22,23,24 e DAPI para coloração de DNA nuclear.

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Resultados

O presente estudo induziu iPSCs (Figura 2B) em organoides cerebrais (Figura 2C). Os EBs cultivados na fase inicial expressaram o marcador OCT4 (Figura 2A), que indicava boa pluripotência. No estágio posterior, os EBs desenvolveram-se em organoides cerebrais maduros (Figura 2D). A pesquisa cultivou iPSCs de indivíduos saudáveis normais e pacientes SCA3 em organoides cerebrais (Figura...

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Discussão

Organoides cerebrais abrem novos caminhos para a pesquisa médica. Muitas aplicações úteis desta tecnologia estão apenas começando a ser exploradas28. Esta pesquisa constatou que os resultados de sequenciamento de transcritos de organoides cerebrais geneticamente doentes e organoides cerebrais normais podem refletir as diferenças entre doença e saúde. Por exemplo, os resultados da análise de dados do RNA-seq (Figura 3B) são consistentes com muitos estudos relatados sob...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pela Fundação de Ciência Natural da Província de Guangdong (Grant No. 2020A0505100062), o Projeto de Temas-Chave de Ciência e Tecnologia da Cidade de Guangzhou (Grant No. 201904020025), a Fundação Nacional de Ciência Natural da China (Grant No. 31872800, 32070582, 82101937) e o projeto Guangzhou City Postdoctor Research Grant (para Bangzhu Chen).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,2 μ m FiltroNEST Biotechnology, China331001
1000 μ Ponteira de pipeta de diâmetro largo LThermo Fisher Scientific, EUA9405163
200 μ Ponta de pipeta de calibre largo LThermo Fisher Scientific, EUA9405020
2-mercaptoetanolMerck, Alemanha8057400005
4% ParaformaldeídoServicebio, ChinaG1101
Placa de baixa adesão de 6 poçosNEST Biotechnology, China703011É usado para culturas de suspensão de EBs
Solução de desprendimento celularSTEMCELL Technologies, Canadá07920É usado para digerir iPSC em células únicas.
AggreWell800 STEMCELL Technologies de 24 poços, Canadá34811Placa de cultura microporosa para preparação de EBs.
Solução de enxágue antiaderenteSTEMCELL Technologies, Canadá07010Solução de enxágue para cultura para evitar a adesão celular
B27-vit. Um suplementoThermo Fisher Scientific, EUA12587010
bFGFPeprotech, EUAGMP100-18B
BSABeyotime Biotechnology, ChinaST025
CentrífugaEppendorf, Alemanha5810 RPode ser usado para centrifugação de vários tipos de tubos de centrífuga, frascos de reagentes e placas de trabalho.
Equipamento de laboratório Shitaide vidro de cobertura10212020C
DAPIBeyotime Biotechnology, ChinaC1002Usado para coloração nuclear. Depois que o DAPI foi combinado com DNA de fita dupla, o comprimento de onda máximo de excitação foi de 364 nm e o comprimento de onda máximo de emissão foi de 454 nm.
DMEM-F12Thermo Fisher Scientific, EUA11330032
ES-quality FBSThermo Fisher Scientific, EUA10270106
Ficoll PaqueGeneral Electric Company, EUA17-5442-02Isole as células mononucleares do sangue periférico de acordo com o método Ficoll-Paque.
GelatinaSangon Bioteach, ChinaA609764
Suplemento GlutamaxThermo Fisher Scientific, EUA35050061
Suplemento GlutamaxThermo Fisher Scientific, EUA17504044
Cabra anti-Frango IgY  anticorpo secundárioAbcam, Reino Unidoab150171Cabra anti-Frango IgG. Conjugação: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use na diluição de 1:500.
Anticorpo secundário IgG anti-rato de cabraAbcam, Reino Unidoab150120IgG anti-rato de cabra. Conjugação: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use na diluição de 1:500.
Anticorpo secundário anti-coelho IgG de cabraAbcam, Reino Unidoab150077IgG anti-coelho de cabra. Conjugação: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use na diluição de 1:500.
HeparinaMerck, AlemanhaH3149
Agitador horizontalServicebio, ChinaDS-H200A força centrífuga relativa (RCF) de 0,11808 x g é mais adequada, de acordo com o fabricante INFORS HT (Suíça).
InsulinaMerck, AlemanhaI9278-5ML
KOSRThermo Fisher Scientific, EUA10828028
MatrigelCorning, EUA354277Matrigel solidificará no ambiente superior a 4 ° C, por isso deve ser subembalado em baixa temperatura.
MEM-NEAAThermo Fisher Scientific, EUA11140050
mTeSR1STEMCELL Technologies, Canadá85850suplemento de N2 do meio de cultura iPSC
Thermo Fisher Scientific, EUA17502048
NeurobasalThermo Fisher Scientific, EUA21103049
anticorpo primário OCT4Abcam, Reino Unidoab19857Anfitrião: Coelho. Dissolva com 500 μ L PBS. Use na diluição de 1:200.
Fatiador patológico congeladoLeica, AlemanhaAnticorpo primário Leica CM1860
PAX6Abcam, Reino Unidoab78545Hospedeiro: Mouse. Use na diluição de 1:100.
PBSSTEMCELL Technologies, Canadá37350
Penicilina-estreptomicinaThermo Fisher Scientific, EUA15140122
dissociação PSCBeijing Saibei Biotechnology, ChinaCA3001500A solução de dissociação sem enzimas pode ser usada para digestão e passagem de iPSC.
Kit de Reprogramação SendaiThermo Fisher Scientific, EUAA16518Estabeleça o iPSC de acordo com o protocolo do Kit de Reprogramação Sendai.
Equipamento de laboratório de Shitai de vidro deslizante, China188105W
Lâmpada de luz suaveNUTNUTUm dispositivo simples feito por si mesmo, consulte a figura suplementar 2 para preparação.
Kit de Organoides Cerebrais STEMdiff STEMCELLTechnologies, Canadá8570Contém: 1. Meio de Formação EB; 2. Meio de Indução; 3. Meio de expansão; 4. Meio de maturação.
Kit de Maturação Organoide Cerebral STEMdiffSTEMCELL Technologies, Canadá8571Meio de Maturação
SacaroseSangon Bioteach, ChinaA502792
Triton X-100Merck, AlemanhaX100
TUJ1 anticorpo primárioAbcam, Reino Unidoab41489Anfitrião: Frango. Use na diluição de 1:1000.
VaselinaSangon Bioteach, ChinaA510146
Y-27632STEMCELL Technologies, Canadá72302Prepare uma solução estoque de 5 mM em PBS, ressuspenda 1 mg em 624 µ L da PBS.
Weblink
Dados brutos de sequenciamento Arquivo desequência do genoma (genômica, proteômica e Bioinformática 2021) no Centro Nacional de Dados de Genômica (Ácidos Nucleicos Res 2022), Centro Nacional de Bioinformação da China / Instituto de Genômica de Pequim, Academia Chinesa de CiênciasGSA-Human: HRA002430https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/
, China Solução de

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