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Neuroscience

Traçage de la lignée des cellules souches inductibles marquées par fluorescence dans le cerveau de souris adulte

Published: May 20, 2022 doi: 10.3791/63998
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 1,2
1Graduate School of Biomedical Science and Engineering, University of Maine, 2Department of Neurosurgery, Ohio State University Wexner Medical Center, 3Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School

Summary

La capacité de marquer de façon permanente les cellules souches et leur descendance avec un fluorophore à l’aide d’une lignée transgénique inductible traçant la lignée de souris permet une analyse spatiale et temporelle de l’activation, de la prolifération, de la migration et / ou de la différenciation in vivo. Le traçage de la lignée peut révéler de nouvelles informations sur l’engagement de la lignée, la réponse aux interventions et la multipotence.

Abstract

Une lignée de souris traçant la transcriptase inverse de la télomérase (Tert) a été développée pour étudier le comportement et le devenir des cellules souches tissulaires adultes, en croisant le système « Tet-On » oTet-Cre souris avec un nouveau transgène de transactivateur de tétracycline inverse (rtTA) lié au promoteur Tert, dont nous avons démontré qu’il marque une nouvelle population de cellules souches cérébrales adultes. Ici, l’administration du dérivé de la tétracycline doxycycline à des souris mTert-rtTA::oTet-Cre marquera de manière indélébile une population de cellules qui expriment un fragment de 4,4 kb de la région promotrice du gène Tert. Lorsqu’elles sont combinées avec le rapporteur Rosa-mTmG, les souris mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG exprimeront le tdTomato membranaire (mTomato) jusqu’à ce que le traitement à la doxycycline induise le remplacement de l’expression de mTomato par l’EGFP membranaire (mGFP) dans les cellules qui expriment également Tert. Par conséquent, lorsque ces souris traçant la lignée triple transgénique reçoivent de la doxycycline (la période de « pouls » pendant laquelle les cellules exprimant le TERT sont marquées), ces cellules deviendront des cellules mGFP+ marquées de manière indélébile, qui peuvent être suivies pendant n’importe quelle période souhaitable après l’élimination de la doxycycline (la période de « chasse »), même si l’expression de Tert est ensuite perdue. Les cerveaux sont ensuite fixés par perfusion et traités pour l’immunofluorescence et d’autres applications en aval afin d’interpréter les changements dans l’activation des cellules souches, la prolifération, l’engagement de la lignée, la migration vers diverses niches cérébrales et la différenciation vers les types de cellules matures. Grâce à ce système, n’importe quelle souris rtTA peut être accouplée à oTet-Cre et à un rapporteur Rosa pour mener des expériences de traçage de lignée « pulse-chase » inductibles à la doxycycline à l’aide de marqueurs de cellules souches.

Introduction

Valeur d’une ligne de souris de traçage de lignée
L’analyse des cellules souches in vivo peut être difficile car de nombreux essais qui examinent ces cellules ne se concentrent que sur la caractérisation de ces cellules au moment de la mort de l’animal, ce qui représente un instantané terminal dans le temps. Pour mieux comprendre les processus de prolifération, de différenciation et de migration des progéniteurs, des types de cellules intermédiaires/de transition et des cellules matures au fil du temps, une approche d’analyse longitudinale est nécessaire. Ceci peut être réalisé avec des études de traçage de lignée dans lesquelles les cellules souches / progénitrices sont marquées de manière indélébile et peuvent être suivies pendant toute la durée après1.

Dans le cerveau des mammifères adultes, le processus de neurogenèse par lequel les neurones nés à l’âge adulte sont créés à partir de cellules souches et progénitrices a d’abord été analysé par rétention d’étiquette avec la thymidine-H3 2,3,4 ou la 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdU)5,6,7,8 . Dans ces études, les cellules prolifératives ont été marquées avec l’analogue de la thymine, qui a été incorporé dans l’ADN des cellules pendant la réplication et la division / prolifération cellulaire. La cellule marquée, ainsi que leur progéniture, contenaient donc cet analogue, qui ont ensuite été identifiés post-mortem. Cependant, alors que la thymidine-H3 et BrdU ont permis le marquage des cellules prolifératives et de leur descendance dans les régions du cerveau où les cellules souches étaient mal comprises, ces études ont été entravées par les inconvénients de ces outils. La thymidine-H3 induit l’arrêt du cycle cellulaire, l’apoptose et l’inhibition de la synthèse de l’ADN dose-dépendante9, tandis que BrdU marque les cellules à des niveaux variables selon la voie d’administration10 et est absorbé par les cellules pendant la réparation ou l’apoptose, ainsi que pendant la division cellulaire11. Des méthodes de marquage plus efficaces ont été utilisées récemment, telles que le marquage avec la 5-éthynyyl-2'-désoxyuridine (EdU), mais bon nombre des mêmes problèmes que BrdU restent12. Ces approches sont également limitatives en ce sens qu’elles marquent toute cellule proliférative, pas seulement les cellules souches, et donc l’interprétation des résultats peut être confondue. Dans la lignée neurogène, toutes les cellules souches et progénitrices conservent la capacité mitotique, et seuls les neurones terminaux / matures ne sont pas prolifératifs. Pour les astrocytes et les microglies, mais pas pour les oligodendrocytes, la prolifération est maintenue indéfiniment 13,14,15.

Les souris transgéniques utilisées pour tracer uniquement les cellules qui expriment une protéine d’intérêt, telle que celle confirmée pour identifier les cellules souches adultes que nous utilisons ici, sont donc devenues plus courantes lors de l’étude des cellules souches et de leur progéniture. Bien qu’il soit difficile de générer des approches transgéniques de souris, les lignées de souris traçant la lignée permettent de tracer des cellules spécifiquement marquées dans le cerveau et ne dépendent pas uniquement de la prolifération. Dans le système de souris transgénique Tet-On, l’administration de tétracycline ou de doxycycline (un dérivé de la tétracycline) induit l’expression de la Cre-recombinase dans les cellules qui ont été conçues avec un transactivateur de tétracycline inverse (rtTA), qui est transcrit par un promoteur d’intérêt. La recombinaison induite par Le Tet et le Cre activera alors l’expression d’une protéine fluorescente ou luminescente indélébile dans les cellules d’intérêt, selon la souris Rosa-reporter employée. Ces cellules marquées de manière indélébile continuent d’exprimer ce rapporteur après division, différenciation ou migration, permettant le suivi de ces cellules et de leur progéniture au fil du temps ou après différentes interventions16. Les avantages des approches transgéniques de traçage de la lignée comprennent : 1) la spécificité du traçage à une lignée cellulaire particulière ou à un progéniteur/cellule souche marquée par le rtTA, 2) l’expression indélébile de la protéine fluorescente ou luminescente malgré le renouvellement ou la différenciation cellulaire, 3) une faible toxicité, 4) une activation conditionnelle à tout moment du cycle de vie de l’animal et 5) une facilité d’utilisation avec des essais courants, y compris l’immunocoloration/immunofluorescence16.

D’autres méthodes d’outils rapporteurs inductibles temporellement chez la souris comprennent l’utilisation de souris Cre-ERT2, qui peuvent être associées à ROSA-GFP, ROSA-mTmG ou à d’autres transgènes rapporteurs fluorescents. Chez ces animaux, un élément régulateur spécifique à la cellule, tel qu’un promoteur ou une région d’intérêt amplificateur, entraîne la production de Cre recombinase, qui ne peut être activée que par l’administration de tamoxifène. Alors que les lignées de souris Cre-ERT2 permettent l’induction de Cre dans des lignées cellulaires spécifiques, il existe une mine de connaissances détaillant les effets du tamoxifène sur la neurogenèse adulte17,18. De plus, il existe de nombreux gènes rapporteurs fluorescents pilotés par ROSA qui peuvent être utilisés à la place de GFP ou mTmG, y compris YFP ou CFP, ce qui permettrait un marquage fluorescent alternatif dans d’autres longueurs d’onde fluorescentes. Ces gènes rapporteurs fluorescents peuvent être utilisés avec les systèmes Tet-On ou Cre-ERT2.

La transcriptase inverse de la télomérase (TERT) est le composant limitant le taux de l’holoenzyme télomérase, qui agit pour étendre les télomères après leur raccourcissement pendant la division cellulaire19,20. TerT a été identifié comme un marqueur des cellules souches tissulaires adultes dans l’intestin21,22, la moelle osseuse21, le foie23, adipeux24, l’endomètre25,26 et l’os1. On ne sait toujours pas si l’expression de TERT dans ces cellules souches adultes est uniquement destinée à l’activité d’extension de la télomérase ou à l’exécution de rôles TERT non canoniques27. Des cellules souches adultes quiescentes exprimant le TERT (qASC) ont été identifiées et tracées dans tout le corps avec des souris traçant la lignée transgénique pour étudier la multipotence et la capacité d’auto-renouvellement de ces cellules souches, ainsi que leur potentiel d’activation, de prolifération, de différenciation et de migration 1,22,23,28. La création du transgène Tert-rtTA a été réalisée précédemment1. Dans cet article, nous décrirons l’utilisation d’une lignée traçant la lignée TERT pour étudier les TERT + qASC que nous avons identifiés comme une nouvelle population ASC dans le cerveau de souris adultes.

Génération d’une lignée transgénique traçant la lignée de souris
Pour générer une lignée de souris traçant la lignée à l’aide du système Tet-On, trois transgènes doivent être combinés au sein d’un seul animal par accouplement de souris. Le premier est un rtTA, exprimé sous le contrôle du promoteur du gène d’intérêt (le nôtre est TERT-rtTA). Dans une cellule qui exprime ce gène d’intérêt, le rtTA sera donc exprimé. Le second est un gène oTet-Cre, qui contient un élément de réponse à la tétracycline (TRE) qui permettra la transcription de la Cre recombinase en présence à la fois d’un transcrit de fusion rtTA et de tétracycline ou d’une doxycycline. La tétracycline ou la doxycycline peut être administrée à un animal via de l’eau potable ou du chow29. Enfin, il doit y avoir un gène qui sera activé par le clivage de la Cre recombinase. Dans ce manuscrit, le gène de marquage que nous décrirons est le gène Rosa26-mTmG, qui, jusqu’à la recombinaison Cre, transcrira de manière omniprésente mTomato (fluorescence rouge membranaire dans toutes les cellules). Cependant, si une cellule exprime le transcrit rtTA et contient de la tétracycline ou de la doxycycline, la recombinaison Cre d’un ensemble de sites lox P entre les sites mTomato et mGFP modifiera le site R26 et amènera la cellule à produire de l’EGFP membranaire (mGFP, ou fluorescence verte membranaire) au lieu de la tomate membranaire. La nature indélébile de ce signal mGFP permettra le marquage et le traçage in vivo des cellules à mesure qu’elles prolifèrent, migrent et se différencient. Après la trace, les cellules peuvent être analysées pour l’expression de GFP via l’immunofluorescence dans des cryosections standard ou des cerveaux optiquement plus épais.

Dans cet article, nous décrirons l’utilisation de la ligne de souris spécifique, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. Pour créer cette triple lignée de souris transgéniques, nous avons d’abord accouplé des animaux oTet-Cre (souche Jackson Lab #006234) à des animaux Rosa-mTmG (souche Jackson Lab #007676) pour créer des souris transgéniques doubles oTet-Cre::Rosa-mTmG. Ces animaux ont été génotypés à l’aide d’amorces et de modèles de PCR indiqués dans les tableaux supplémentaires 1 et 2. Des souris mTert-rtTA (créées par David Breault1) ont été accouplées à des animaux oTet-Cre::Rosa-mTmG pour créer des souris mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG (Figure 1A)1,30. Le mécanisme d’action de la ligne de souris mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG est illustré à la figure 1B.

Induction de la doxycycline et conception de la chasse aux impulsions
Lors de la planification d’expériences, il est important de prendre en compte plusieurs facteurs qui affecteront le résultat des expériences de traçage de lignée, y compris l’âge de l’animal à l’induction de la doxycycline, la durée de l’administration de la doxycycline (la période « pouls »), la durée après l’élimination de la doxycycline avant le prélèvement de tissus (la période de « poursuite ») et le moment de toute intervention au cours de ces processus. Ces considérations de conception d’étude sont essentielles pour comprendre les cellules étiquetées et leur progéniture à la fin de l’expérience. La première étape du processus consiste à identifier l’âge d’intérêt de l’animal et la durée de l’administration de doxycycline. Des périodes d’impulsion plus longues permettront d’exprimer le promoteur lié à la rtTA et de marquer de manière indélébile davantage de cellules d’intérêt. Un type de cellule qui présente une expression transitoire du gène d’intérêt peut nécessiter une période d’impulsion plus longue que les cellules qui expriment continuellement le gène d’intérêt. Cependant, si l’objectif de l’étude est de comprendre les effets à court terme de la cellule d’intérêt ou d’une intervention aiguë, la période de pouls ne peut pas être trop longue, car une fois qu’une cellule est marquée, elle sera tracée à travers un certain nombre de changements pendant le reste de la période de pouls. Dans certaines de nos études, un pouls de 2 jours sans période de poursuite a été utilisé pour imiter plus étroitement un rapporteur direct pour TERT. En effet, la durée minimale de recombinaison du gène Rosa-mTmG est de 2 jours31.

La prochaine période essentielle dans une expérience de chasse au pouls est la longueur entre l’élimination de la doxycycline et la perfusion de l’animal, également connue sous le nom de « poursuite ». La demi-vie de la doxycycline chez la souris est d’environ 170 minutes, quelle que soit la voie d’administration, ce qui permet de conclure que l’induction de la doxycycline ne se produit probablement plus plusieurs heures après l’ablation32. Cependant, il est important de noter que le métabolisme de la doxycycline est plus lent chez les souris âgées, ce qui peut entraîner des périodes de « pouls » efficaces plus longues que les jeunes animaux33.

Pendant la période de chasse, les cellules marquées continueront d’être marquées, même après prolifération, différenciation ou migration. La descendance de ces cellules sera également marquée. L’objectif de l’étude façonnera la longueur du paradigme de la chasse au pouls. Si l’objectif de l’étude est de comprendre la régénération d’un tissu sur une longue période de temps avec les cellules d’intérêt, une longue période de poursuite peut être nécessaire. Enfin, le calendrier des interventions ou des traitements doit être décidé. L’administration pendant la période de pouls affectera les cellules exprimant le gène d’intérêt ainsi que toute progéniture créée pendant cette période, tandis que l’administration pendant la période de chasse peut affecter principalement la progéniture des cellules d’intérêt, bien que cela dépende de la rapidité avec laquelle les cellules marquées se divisent ou se différencient. Des exemples de plans expérimentaux de chasse aux impulsions que nous avons utilisés sont décrits à la figure 2A.

Il est également important d’être conscient de la possibilité d’un signal GFP de fond en raison d’une expression qui fuit. L’expression perméable se produit en raison du potentiel de liaison inhérent entre le rtTA et les séquences d’Otet en l’absence de doxycycline, et de l’activité résiduelle du transgène d’Otet en l’absence de rtTA (revue en34). L’expression perméable représente une faiblesse des systèmes Tet, et bien que la fuite soit souvent un inconvénient acceptable du système, les situations où l’expression perméable peut entraîner une toxicité et une mortalité, comme avec la toxine diphtérique (DTA) chez les animaux Otet-DTA peuvent limiter l’utilisation de ces systèmes35.

Traitement du cerveau, sectionnement et immunofluorescence de sections minces pour la microscopie
Pour analyser le cerveau de souris après une expérience de traçage de lignée, les souris doivent d’abord être perfusées par perfusion transcardique pour éliminer le sang et le LCR qui peuvent conduire à une autofluorescence élevée dans le cerveau. Il existe deux fixateurs couramment utilisés avec lesquels l’animal peut être perfusé: le fixateur tissulaire histochoice, un fixateur glyoxal (GF) ou le paraformaldéhyde à 4% (PFA). Les fixateurs de glyoxal permettent un processus de fixation relativement doux avec moins de réticulation que le PFA. Cela réduit la rigidité des tissus, réduit le besoin de récupération de l’antigène et permet des solutions d’anticorps moins concentrées pendant l’immunocoloration. Cependant, s’ils contiennent du méthanol, cela peut servir à augmenter l’autofluorescence36. D’autre part, le PFA permettra souvent une fixation plus robuste, et bien que la récupération de l’antigène soit nécessaire pendant l’immunocoloration, il existe des anticorps qui ne fonctionneront qu’avec des tissus fixés au PFA, et une perfusion avec 4% de PFA est nécessaire pour la technique de nettoyage optique décrite plus loin.

Après la perfusion est une étape post-fixation, dans laquelle les cerveaux sont immergés dans le même type de fixateur utilisé pendant la perfusion pendant la nuit. Cela permet à toutes les régions du cerveau qui n’ont peut-être pas été complètement fixées pendant la perfusion de continuer à se réparer. Ensuite, les cerveaux seront incubés dans du saccharose dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour éliminer autant d’eau que possible avant l’étape de congélation afin d’empêcher la formation de glace dans le tissu (« cryo-préservation »). Les cerveaux peuvent ensuite être coupés en un certain nombre de coupes de tissus sagittaux, coronaires ou transversaux pour traitement. Pour la précision et la reproductibilité, les blocs cérébraux calibrés doivent être utilisés de manière à assurer des coupes de bregma cohérentes entre les animaux. Le facteur le plus important qui peut affecter la façon dont les cerveaux sont sectionnés est la ou les régions du cerveau d’intérêt. Par exemple, alors qu’une coupure sagittale peut permettre d’analyser plus de régions du cerveau dans une section de tissu, cette coupure ne permettra pas d’analyser les régions neuro/gliogéniques de la zone ventriculaire-sous-ventriculaire (V-SVZ) car les côtés latéraux et médians du ventricule latéral seront impossibles à discerner dans cette dimension et sont mieux observés dans le plan coronal. Cela peut être une distinction importante à faire dans les études de neurogenèse adulte, car le côté latéral du ventricule latéral contient le V-SVZ neurogène, tandis que la paroi médiale du ventricule latéral est une niche plus gliogénique37.

Une fois que les tissus ont été divisés en sections coronales, sagittales ou transversales, ils seront congelés en blocs à l’aide de la solution d’incorporation à température de refroidissement optimale (OCT). Ici, les cerveaux sont congelés dans ce matériau d’intégration, avec l’utilisation d’un mélange de glace carbonique et d’éthanol. Si une analyse de section mince est nécessaire, les blocs seront tranchés sur un cryostat et, en fonction de l’analyse en aval requise, peuvent être collés à des lames de verre chargées positivement sous forme de sections minces (<20 μm). Les lames de verre qui ne sont pas chargées peuvent également être utilisées, mais l’utilisation de lames non chargées peut entraîner le déblocage des tissus des lames38. Si des coupes de tissu flottant libre d’épaisseur moyenne (>20 μm) sont nécessaires, les tissus seront prélevés sous forme de sections flottantes. Si des sections épaisses (0,5-4 mm) sont nécessaires, il est nécessaire de trancher des sections cérébrales non congelées avec un vibratome. Il est important de noter les différences de stockage entre les sections sur les lames, qui nécessitent une congélation à -20 à -80 ° C et les sections flottantes, qui seront stockées à 4 ° C.

Nettoyage du cerveau et microscopie confocale immunofluorescente à montage entier
Si une analyse plus large, mais moins détaillée, des cellules tracées par la lignée dans le cerveau de la souris est souhaitée, une analyse complète des segments plus épais du tissu cérébral est possible avec iDISCO brain clearing39 suivi d’une immunocoloration et d’une microscopie confocale z-stack carrelée ou d’une microscopie à feuille de lumière. Ici, de grandes sections du cerveau de la souris seront optiquement nettoyées (un processus de délipidation39), ce qui permet mieux l’imagerie du signal fluorescent sur une section de tissu de 1 mm. Les inconvénients de ce processus sont une autofluorescence élevée et une capacité réduite à obtenir des images haute résolution de la morphologie cellulaire et une analyse détaillée de la cocoloration en raison des distances de travail accrues requises par rapport aux méthodes plus traditionnelles (cryosections minces ou sections flottantes). Pour cette raison, nous recommandons l’éclaircissement du cerveau pour analyser les résultats du traçage de la lignée à grande échelle dans plusieurs zones du cerveau, au lieu d’essayer de caractériser ou d’analyser des cellules individuelles.

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Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Ohio State University.

1. Création d’une lignée traçant la lignée de souris Tet-On, stratégies de reproduction et génotypage pour les souris de cohorte expérimentales

REMARQUE: Ici, nous décrivons la création d’un système de souris Tet-On avec Rosa-mTmG comme gène rapporteur fluorescent qui subit la recombinaison Cre, mais diverses autres lignes de rapporteur pilotées par cre-recombinaison peuvent également être utilisées avec le système Tet-On.

  1. Installer une cage d’accouplement d’un mâle oTet-Cre (+/-) avec une ou plusieurs femelles R26 (mTmG) (+/+). Reportez-vous à la Figure 1 pour une vue d’ensemble de la configuration expérimentale de l’accouplement de la souris.
  2. Les chiots résultants (F1) seront oTet-Cre (+/-) ou oTet-Cre (-/-) et R26 (mTmG) (+/-). Effectuer le génotypage selon les amorces du tableau supplémentaire 1 et les protocoles du tableau supplémentaire 2.
  3. Au sevrage, effectuez des tests de la lignée germinale en prenant un coup de poing dans l’oreille à chaque sevrage. Examiner le poinçon de l’oreille sous un microscope épifluorescent dans le spectre GFP/FITC pour déterminer si l’animal avait subi une recombinaison germinale en cours de développement. Si c’est le cas, l’animal exprimera la GFP dans chaque cellule et le poinçon de l’oreille sera fluorescent avec le signal mGFP. Ces animaux ne peuvent pas être utilisés pour des accouplements ou des expériences.
    REMARQUE: Les clips d’oreille de souris qui ne sont pas germinales ne montrent qu’une fluorescence endogène au microscope (Figure 1C), tandis que les animaux de la lignée germinale montrent un signal GFP lumineux (Figure 1D). Les oreilles de contrôle peuvent provenir de souris qui ne contiennent pas de transgènes fluorescents. À noter que les poils de l’oreille ont une fluorescence endogène élevée et ne doivent pas être utilisés comme facteur déterminant (Figure 1C). De plus, des différences de fluorescence endogène sont observées entre les souris de couleur de pelage blanc par rapport à la couleur du pelage noir, et les témoins de souris de la même couleur de pelage que les souris testées devront être utilisés dans cette analyse.
  4. Accoupler un mâle oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/-) avec une ou plusieurs souris femelles oTet-Cre (-/-) x R26 (mTmG).
  5. La génération résultante (F2) sera de 1/4 R26 (mTmG) (+/+) et 1/2 Cre (+/-). Croisez ces animaux avec des animaux mTert-rtTA (+/+) en accoupleant un oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/+) avec un ou plusieurs animaux mTert-rtTA (+/+).
    REMARQUE: Nous avons utilisé des animaux mTert-rtTA (+/+), mais ce processus peut être effectué avec n’importe quelle souris rtTA ligne30.
  6. Pour les animaux de laboratoire, mettre en place des élevages pour générer mTert-rtTA (+/+) ou (+/-) x oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/+) ou (+/-).

2. Induction de la doxycycline de Cre et conception de la chasse par impulsions

  1. Lorsque les animaux sont à l’âge correct pour commencer l’étude, remplacez leur eau potable par de l’eau dox : de l’eau potable contenant 5 % de saccharose et 2 mg/mL d’hyclate de doxycycline. Utilisez des animaux Cre-négatifs qui reçoivent la même chasse au pouls de doxycycline que les animaux de laboratoire comme groupe témoin pour les modèles d’expression fluorescente résultants.
    1. Après préparation, conserver l’eau dox à 4 °C jusqu’à 1 mois. Voir le tableau 1 pour plus d’informations. L’eau Dox peut être administrée aux animaux dans des bouteilles à boire jusqu’à 5 jours avant d’être changée, car une croissance fongique peut se produire si l’eau dox est laissée à température ambiante pendant de plus longues périodes.
      REMARQUE: Une impulsion de doxycycline d’au moins 2 jours est nécessaire pour l’induction du signal mGFP lors de l’utilisation du transgène mTmG (papier mTmG initial).
      REMARQUE: Nous n’avons pas testé les concentrations de doxycycline autres que 2 mg / mL. La littérature antérieure a identifié que cette concentration a les effets les plus élevés lorsqu’elle est administrée dans l’eau potable29. La quantité de doxycycline délivrée peut varier en fonction de la quantité de boisson consommée par chaque animal. L’injection de doxycycline ou le gavage peuvent également être effectués afin d’être cohérent entre les animaux40.
  2. Une fois la période de pouls terminée, retirez l’eau dox des cages et remplacez-la par de l’eau potable normale. Les animaux seront maintenant dans la période de « poursuite » jusqu’à la mort.

3. Perfusion transcardique et dissection cérébrale

  1. Retirez une souris de sa cage et retenez l’animal à l’aide du pouce gauche et de l’index. Injecter à l’animal par injection intrapéritonéale (i.p.) une solution de 100 mg/mL de kétamine et de 20 mg/mL de xylazine dans une solution saline stérile à 0,9 % pour une concentration finale de 200 mg/kg de kétamine et de 20 mg/kg de xylazine. Voir le tableau 1 pour plus d’informations.
    ATTENTION : Les protocoles d’anesthésie peuvent différer selon les pays. En outre, il existe des effets des anesthésiques sur le cerveau, y compris des changements dans la morphologie et l’action microgliales et les niveaux de corticostérone qui doivent être compris lors de la réalisation de perfusions à des fins de collecte et d’analyse du cerveau41,42.
  2. Après environ 1-2 minutes, l’animal perdra son réflexe de redressement. Pour tester cela, il suffit de rouler l’animal sur le dos et s’il ne peut pas se retourner sur ses pieds, il a perdu le réflexe de redressement.
  3. Après environ 5-10 minutes, l’animal perdra son réflexe de pédale. Pour vérifier le réflexe de pédale, utilisez le pouce et l’index pour pincer chacun des pieds de l’animal. S’il n’y a pas de réponse, sous la forme d’un saut ou d’un spasme musculaire, utilisez les ongles du pouce et de l’index pour pincer chacun des pieds de l’animal. S’il n’y a pas de réponse, l’animal a perdu le réflexe de pédale.
    REMARQUE: Si l’animal répond au réflexe de pédale pendant plus de 15 minutes après l’injection, une injection supplémentaire de 1/2 de l’injection initiale de kétamine / xylazine peut être nécessaire. L’âge, le sexe, le génotype, le phénotype et le traitement peuvent affecter la réponse de l’animal à ce cocktail de médicaments.
  4. Une fois les réflexes de redressement et de pédale perdus, testez le réflexe oculaire en contactant légèrement le globe oculaire de la souris avec un doigt ganté. Un manque de réponse indique que le réflexe oculaire a été perdu.
  5. Fixez la souris en position couchée avec les pattes épinglées à une surface de travail épinglable.
  6. Faites une incision à travers la peau avec des ciseaux chirurgicaux le long de la ligne médiane thoracique à environ 1-2 cm en dessous du processus xiphoïde. Couper supérieur jusqu’au processus xiphoïde.
  7. Saisissez le cartilage du processus xiphoïde avec une pince. Insérez des ciseaux et coupez à travers la musculature et la cage thoracique en diagonale le long du côté droit de la souris jusqu’au niveau des clavicules.
    1. Soulevez la musculature thoracique avec une pince et coupez à travers le diaphragme jusqu’à ce que le cœur puisse être visualisé. Ensuite, faites une coupe diagonale identique le long du côté gauche de la souris, en veillant à éviter tout contact avec le cœur. Utilisez un hémostat pour garder la musculature thoracique loin de la cavité.
      REMARQUE: À ce stade, la souris ne pourra plus respirer, alors travaillez rapidement pour éviter la mort avant les étapes suivantes.
  8. Fixez le cœur battant avec une pince émoussée et insérez une aiguille de distribution dans le ventricule gauche à travers la base de l’arc aortique.
  9. Serrez la base de l’aiguille au ventricule gauche juste au-dessus du site d’insertion.
  10. Faites une incision dans l’oreillette droite et, dès les premiers signes de flux sanguin, commencez à infuser l’animal avec 20 mL de 1x PBS à 8,11 mL / minute.
  11. Une fois que le PBS 1x a perfusé le corps, passez au fixateur approprié pour l’application en aval et perfusez la souris avec 20 mL de fixateur.
    1. Pour la coupe congelée et l’immunocoloration, perfuser l’animal avec le fixateur de glyoxal pour l’éclaircissement du cerveau, perfuser l’animal avec 4% de PFA dans 1x PBS (pH 7,4).
      REMARQUE: Les signes d’une perfusion réussie comprennent une raideur animale (légère raideur avec le glyoxal, raideur intense avec pfa) et un manque de vaisseaux sanguins visibles dans les tissus.
  12. Décapitez la souris et retirez le cerveau en insérant des ciseaux dans le tronc cérébral et en coupant le long de la suture squamosale jusqu’à la suture frontomaxillaire de chaque côté. Ensuite, coupez à travers la suture fontonasale pour retirer la calotte crânienne, en faisant attention à ne pas endommager le bulbe olfactif. De là, tournez le crâne à l’envers et utilisez une pince incurvée pour retirer le cerveau, en vous assurant de couper le nerf optique.
  13. Placez le cerveau perfusé dans une cartouche de tissu et immergez-vous dans le fixateur utilisé pour perfuser l’animal pendant la nuit à 4 °C.

4. Traitement du cerveau, tranchage et immunocoloration

  1. Traitement du cerveau et tranchage
    1. Retirer les cartouches cérébrales du fixateur de glyoxal et incuber dans 15% de saccharose dans 1x PBS pendant 2 jours à 4 ° C ou jusqu’à ce que le cerveau coule.
    2. Retirer les cartouches cérébrales de 15 % de saccharose et incuber dans 30 % de saccharose dans 1x PBS pendant 2 jours à 4 °C ou jusqu’à ce que le cerveau coule.
      REMARQUE : Voir le tableau 1 pour plus d’informations.
    3. Retirez les cerveaux de 30% de saccharose dans 1x PBS et séparez le cerveau en divers « blocs » à l’aide d’un bloc cérébral coronal ou d’un bloc cérébral sagittal.
    4. Incorporer des sections cérébrales coronales ou sagittales dans le composé OCT en plaçant des sections cérébrales sur un mélange de glace carbonique et d’éthanol (EtOH). Une fois que l’OCT est devenu blanc et solide, retirer du mélange glace carbonique-EtOH et conserver enveloppé dans un parafilm, à l’intérieur d’un sac hermétique à -20 ° C.
    5. Retirer les blocs congelés du congélateur et les placer à l’intérieur d’un cryostat dont la température interne est réglée sur -20 °C. Utilisez l’OCT pour attacher le bloc à un mandrin métallique afin que le tissu soit solidement attaché. Laissez ~5 min pour que le tissu gèle jusqu’au mandrin. Trancher le tissu à 7 μm, en plaçant chaque tranche de tissu sur une lame de verre chargée.
    6. Laisser cuire les lames pendant la nuit à 37 °C, puis placer à -20 °C jusqu’à ce qu’elles soient utilisées pour l’immunocoloration.
  2. Immunocoloration
    1. Gouttes chaudes à température ambiante (RT) et post-fixation avec de l’acétone glacée pendant 15 min.
    2. Lavez les glissières pendant 5 minutes dans un tampon de rinçage 1x (par exemple, tampon de rinçage IHC Select TBS), en agitant à 60 tr/min à RT entre chaque étape.
    3. Perméabiliser pour la coloration des antigènes nucléaires avec 0,3% triton X-100 pendant 10 min à RT. Perméabiliser pour la coloration des antigènes cytoplasmiques avec 0,3% Tween-20 pendant 10 min à RT.
    4. Effectuer la récupération de l’antigène par micro-ondes de lames dans 50-100 mL de 1x DAKO Antigen Retrieval Solution à faible intensité pendant 10 min, deux fois. Rincez ensuite avec un tampon de rinçage pendant 5 min à TA.
    5. Incuber les lames dans 0,3% Typogen Black dans 70% EtOH pendant 20 min à RT puis laver avec un tampon de rinçage.
    6. Dessinez une barrière hydrophobe autour de chaque tissu sans laisser sécher les tissus. Ensuite, bloquez pendant 20 minutes à 37 °C avec 1 goutte de réactif bloquant Millipore par tissu. Ajoutez ensuite 100 μL d’anticorps primaire dilué dans un diluant d’anticorps à chaque tissu et incubez pendant la nuit à 4 °C.
    7. Le lendemain, incuber des sections dans des anticorps secondaires Alexa Fluor pendant 10 min à TA. Ensuite, lavez les lames dans un tampon de rinçage.
    8. Couvrir les sections cérébrales dans 100 μL d’anticorps anti-GFP 1:500 conjugué à AlexaFluor 488 pour augmenter le signal GFP endogène marquant les cellules tracées et incuber pendant la nuit à 4 ° C.
    9. Le lendemain, laver avec un tampon de rinçage 2x, puis laver à l’eau courante DI pendant 5 min.
      REMARQUE: Assurez-vous de laver doucement avec de l’eau DI, en prenant soin d’éviter toute eau courante sur les toboggans eux-mêmes qui pourrait enlever les sections du cerveau des diapositives.
    10. Contre-tache avec 100 ng/mL 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 5 min. Ensuite, laver à l’eau courante DI pendant 5 min.
    11. Ajoutez une goutte de support de montage sur le dessus de chaque section de tissu et scellez avec un couvercle de 22 mm x 22 mm. L’imagerie est recommandée le jour du montage pour assurer un signal optimal.

5. Nettoyage du cerveau iDISCO (adapté de39)

  1. Fixation et sectionnement
    1. Post-fixer les cerveaux dans 4% pfa pendant la nuit à 4 ° C, puis à nouveau pendant 1 h à RT.
    2. Laver les cerveaux dans 1x PBS pendant une heure, deux fois, à RT. Ensuite, coupez en sections de 1 mm d’épaisseur à l’aide du bloc cérébral nécessaire et placez-les dans des tubes de microcentrifugation de 5 mL contenant 1x PBS.
  2. Prétraitement au méthanol (avec du méthanol)
    REMARQUE: En raison de la possibilité que le méthanol ait un impact sur l’immunocoloration de certaines protéines, les auteurs aimeraient diriger le lecteur vers Renier et al. 2014 pour un protocole à une alternative de protocole iDISCO sans méthanol39. Reportez-vous au tableau 1 pour plus d’informations sur les solutions suivantes de cette section.
    1. Laver avec 1x PBS pendant 1 h deux fois (agitation) à RT.
    2. Laver à 50% de méthanol (en PBS) pendant 1 h (agitation) à TA.
    3. Laver à 80% de méthanol pendant 1 h (agitation) à RT.
    4. Laver à 100% méthanol pendant 1 h deux fois (agitation) à TA.
    5. Échantillons d’eau de Javel contenant 5 % deperoxyde d’hydrogène (H2 O 2) dans 20 % de diméthylsulfoxyde (DMSO)/méthanol (1 volume 30 % H2O2/1 volume DMSO/4 volume méthanol, froid) à 4 °C pendant la nuit (agitation).
    6. Après blanchiment, laver les échantillons dans du méthanol pendant 1 h deux fois (agitation) à TA.
    7. Laver à 20 % de DMSO/méthanol pendant 1 h deux fois (agitation) à TA.
    8. Laver à 80% de méthanol pendant 1 h (agitation) à RT.
    9. Laver à 50% de méthanol pendant 1 h (agitation) à RT.
    10. Laver dans PBS pendant 1 h deux fois (agitation) à RT.
    11. Laver à PBS/0,2 % Triton X-100 pendant 1 h deux fois (agitation) à TA.
  3. Immunocoloration des cerveaux clairsemés
    1. Incuber des échantillons dans 1x PBS/0,2 % Triton X-100/20 % DMSO/0,3 M glycine pendant la nuit sur un agitateur orbital.
    2. Bloquer 1x PBS/0,2% Triton X-100/10% DMSO/6% sérum de chèvre à 37 °C pendant 3 jours sur un agitateur orbital.
    3. Laver les échantillons dans 1x PBS/0,2 % Tween-20/10 μg/mL de sel d’héparine sodique de la muqueuse porcine pendant 1 h deux fois à 37 °C, puis incuber dans 1x PBS/0,2 % Tween-20/10 μg/mL d’héparine/5 % de DMSO/3 % de sérum de chèvre contenant 1:500 concentration d’anti-GFP de lapin AlexaFluor 488 à 37 °C sur un agitateur orbital pendant 2 jours.
    4. Laver les échantillons dans 1x PBS/0,2 % Tween-20 avec 10 μg/mL d’héparine pendant 1 h à 37 °C sur agitateur orbital, trois fois, puis une fois par jour pendant 2 jours.
    5. Incuber des échantillons pendant la nuit dans 10 mL de tétrahydrofurane (THF)/H2Oà 50 % v/v dans un tube conique de 15 mL.
    6. Incuber des échantillons pendant 1 h dans 10 mL de 80 % THF/H2O.
    7. Incuber les échantillons deux fois pendant 1 h dans du THF à 100 %.
    8. Sécher les échantillons avec une lingette stérile et incuber dans du dichlorométhane jusqu’à ce qu’ils coulent au fond du flacon (environ 40 min). Ne pas incuber >60 min.
      REMARQUE: Assurez-vous de manipuler le dichlorométhane sous une hotte aspirante.
    9. Incuber des échantillons dans 18 mL d’éther dibenzylique (DBE) jusqu’à ce qu’ils soient clairs (>2 h).
    10. Stockez les échantillons dans DBE à RT jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être photographiés.
      REMARQUE: Pour de meilleurs résultats, il est important d’imager les échantillons dès que possible une fois l’effacement terminé.

6. Imagerie de lames tachées ou de cerveaux dégagés

  1. Pour imager des sections du cerveau immunocolorées, analysez les lames par microscopie confocale, où la co-expression de plusieurs anticorps peut être confirmée. Nous utilisons un microscope Leica Stellaris 5 avec des détecteurs hybrides HyD S, mais n’importe quel microscope confocal à balayage ponctuel fonctionnera. Les objectifs comprennent HC PL APO 10x/0.40 CS2, HC PL APO 40x/1.30 OIL CS2 et HC PL APO 63x/1.40.
    1. Configurez les lignes laser et les filtres d’émission appropriés. Les lasers requis et les intensités laser correspondantes sont soumis aux combinaisons de microscope et de fluorophore utilisées.
      REMARQUE: Nous utilisons une combinaison de lasers à diode 405 nm et à lumière blanche pour affiner les spectres d’excitation et d’émission pour chaque fluorophore, ou groupes de fluorophores, utilisés pour réduire et éliminer la diaphonie. Des résultats similaires peuvent également être obtenus en utilisant des combinaisons laser / filtre traditionnelles, mais portez une attention particulière au saignement des canaux. Le saignement peut être identifié en allumant une seule ligne laser en conjonction avec chacune des combinaisons de filtres d’émission souhaitées pour voir quels canaux sont affectés par chaque laser spécifique. Par exemple, si le laser à diode 405 nm produit une fluorescence visible dans le filtre d’émission GFP, il y a un saignement qui se produit. Assurez-vous que plusieurs canaux sont imagés séquentiellement image par image pour réduire considérablement tout saignement qui ne se produit pas.
    2. Pour les cerveaux Tet-On co-colorés avec un rapporteur mTmG, sélectionnez DAPI (ex. 405 nm, em. 450 nm), GFP (ex. 488 nm, em. 509 nm), tdTomato (ex. 555 nm, em. 582 nm) et le fluorophore rouge lointain correspondant pour correspondre au fluorophore utilisé sur l’anticorps secondaire. Nous recommandons Alexa Fluor 647 (ex. 651 nm, em. 667 nm).
    3. Établissez d’abord les paramètres avec un cerveau de contrôle Cre coloré avec GFP et le secondaire fluorescent. Ces tranches de cerveau contrôleront la fluorescence de fond des anticorps fluorescents et ne montreront aucun signal GFP réel.
    4. Analysez chaque section du cerveau de haut en bas, de gauche à droite, pour vérifier qu’aucun signal n’a été manqué dans l’analyse. Si vous imagez la même section du cerveau à différents grossissements, il est recommandé d’utiliser d’abord les grossissements inférieurs, car le grossissement plus élevé blanchira plus rapidement le signal mTomato.
  2. Pour imager les cerveaux nettoyés, utilisez un microscope confocal inversé avec une scène automatisée et une fonction de carrelage automatisée. Nous utilisons le microscope Leica Stellaris 5. Parce que les échantillons sont si épais (>500 μm), des distances de travail plus grandes sont nécessaires, ce qui limite le grossissement qui peut être efficacement atteint. Nous utilisons l’objectif HC PL APO 10x/0.40 CS2 pour toutes les imageries cérébrales autorisées.
    1. Commencez par poser une section de cerveau dégagée à plat contre un plat à fond de verre et immergez-vous dans de l’éther dibenzylique.
      REMARQUE: L’éther dibenzylique est corrosif pour la plupart des objectifs et la plupart des plastiques. Pour cette raison, tout plastique intérieur dans le plat inférieur en verre doit être recouvert d’élastomère de silicone à séchage rapide.
    2. Configurez les lignes laser et les filtres d’émission appropriés. Pour les cerveaux Tet-On co-colorés avec un rapporteur mTmG, sélectionnez DAPI, GFP, tdTomato et le fluorophore rouge lointain correspondant pour correspondre au fluorophore utilisé sur l’anticorps secondaire. Définissez la résolution souhaitée, nous recommandons au moins 1024 x 1024. Réglez le sténopé sur 1 UA.
    3. Établissez d’abord l’intensité du laser et le gain du détecteur avec un cerveau de contrôle Cre coloré à la fois avec GFP et le secondaire fluorescent. Ces tranches de cerveau contrôleront la fluorescence de fond des anticorps fluorescents et ne montreront aucun signal GFP réel.
    4. Une fois que les intensités laser et le gain du détecteur ont été optimisés, cartographiez le cerveau pour l’imagerie. Commencez par localiser tout le périmètre de la section cérébrale pour définir les axes X et Y de l’acquisition d’image. Ensuite, identifiez l’axe Z en réglant le point focal à environ la profondeur centrale du tissu et utilisez les commandes de positionnement Z pour localiser le point « le plus élevé » du tissu (valeur Z la plus positive). Scannez diverses régions du tissu en augmentant la hauteur maximale de l’axe Z si nécessaire.
      1. Répétez l’opération pour le point « le plus bas » (valeur Z la plus négative) requis pour obtenir toute l’épaisseur du tissu. Le Stellaris 5 a une limite de ± 250 um du point focal. Cela limite les sections optiques à 500 μm d’épaisseur dans l’axe Z. La zone 3D de la section du cerveau est maintenant connue.
    5. Définissez la taille du pas Z sur 6 μm et commencez à acquérir l’image. Le temps d’acquisition dépend de plusieurs facteurs et peut varier de quelques heures à plusieurs jours en fonction des paramètres souhaités. Pour réduire le temps d’acquisition d’image, essayez de diminuer les résolutions, d’augmenter la vitesse de numérisation laser ou d’augmenter la taille des étapes.
    6. Une fois que l’image carrelée de toute la section du cerveau nettoyée a été capturée, analysez comme vous le souhaitez.

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Representative Results

Bien que le signal fluorescent résultant d’un système Tet-On avec un rapporteur fluorescent varie en fonction du promoteur d’intérêt et du ou des fluorophores utilisés, nous décrirons comment les résultats ont été analysés avec les animaux mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. L’analyse des cerveaux adultes après une chasse au pouls a abouti à des cellules membranaires exprimant la GFP dans diverses niches anatomiques. La différence d’intensité fluorescente entre les différents types de cellules doit être notée. Une variable concernant l’intensité fluorescente est la taille de la membrane cellulaire. Par exemple, les cellules épithéliales choroïdes (PCIC) dans le plexus choroïde ont une membrane cellulaire épaisse et un signal fluorescent fort qui a été facilement distingué des cellules environnantes (Figure 4A, B). Cependant, d’autres types de cellules plus petites et actuellement non identifiées dans le stroma du plexus choroïde avaient un signal GFP plus faible (Figure 4C). Dans le cervelet, les cellules gliales de Bergmann ont exprimé des niveaux plus élevés de mGFP que les cellules du panier, et une variation dans l’expression de la mGFP existait même entre les cellules du panier individuel (Figure 4D). Les axones sensoriels olfactifs dans la couche glomérulaire du bulbe olfactif ont également exprimé des niveaux élevés de MPMe (Figure 4A,E). Pour s’assurer que toutes les cellules mGFP+ sont identifiées, il est donc important d’identifier les cellules GFP+ brillantes et faibles dans le cerveau des animaux mTmG. Chez les animaux mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG, nous avons observé une faible expression de la MPME de fond dans les régions du cerveau, y compris le cortex cérébral (Figure 4A). Fait intéressant, le cervelet et le tronc cérébral ont montré une expression de la MPME de fond plus faible de cette manière (Figure 4A).

Au cours de l’analyse du tissu cérébral après une trace de lignée, il y aura des différences dans les modèles d’expression mGFP et mTomato à travers les régions du cerveau et les types de cellules. Les axones sensoriels olfactifs qui remplissent la couche glomérulaire du bulbe olfactif ont exprimé des niveaux élevés de tomate membranaire par rapport à la plupart des autres régions du cerveau, même lorsque les mêmes neurones sont mGFP+, ce qui indique que certaines cellules semblaient perdre le signal mTomato plus lentement (Figure 4D). En revanche, dans le plexus choroïde, les cellules mGFP+ ont exprimé un mTomato faible (Figure 4B,C). Dans la plupart des autres régions du cerveau, le signal de la tomate est réparti uniformément entre les types de cellules, les cellules endothéliales étant parmi les seules cellules dont le signal fluorescent était suffisamment lumineux pour se démarquer du fond fluorescent rouge (Figure 4B). L’activation de l’expression de la mGFP et le clivage de mTomato du génome lors de la recombinaison entraînent une perte de l’expression de mTomato, mais les fluorophores mTomato qui sont exprimés sur la membrane sont conservés jusqu’à ce qu’ils se dégradent. Pour cette raison, les cellules mGFP+ exprimeront souvent un signal mTomato variable, qui dépendra de la récence de la recombinaison, du type de cellule et de la taille de la membrane cellulaire. Par conséquent, il est important d’analyser les cellules en fonction de l’expression de la MPFM et de ne pas les exclure de l’analyse si elles expriment à la fois la MPME et mTomato.

Des rapporteurs alternatifs peuvent également être utilisés conjointement avec le système Tet-On. La recombinaison de cre peut agir pour induire l’expression de GFP ou de RFP dans des cellules qui n’exprimeront normalement aucune étiquette fluorescente chez les animaux Rosa-GFP ou Rosa-RFP. Ici, l’analyse de la GFP ou de la RFP indiquera l’expression du promoteur d’intérêt, et aucun signal de fluorophore ne sera supprimé comme avec les animaux mTmG. Les rapporteurs à fluorophore unique permettent une immunocoloration avec plus de combinaisons d’anticorps fluorescents, car la tomate membranaire chez les animaux mTmG empêche la coloration dans la longueur d’onde rouge.

Figure 1
Graphique 1. Génération d’une ligne de souris Tet-On. (A) Aperçu du schéma de sélection pour la création de souris mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG à partir de lignées de souris individuelles. (B) Schéma du système Tet-On dans la ligne de souris mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. (C-D) Images représentatives de clips d’oreilles imagés avec le canal FITC d’un microscope épifluorescent provenant de souris mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG non germinales (C) et germinales (D). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Graphique 2. Conceptions expérimentales avec traçage de lignée de souris Tet-On. Illustrations d’expériences possibles avec des souris Tet-On de la prolifération basale, de la migration et de la différenciation (1) aux traitements pendant le pouls dox sans poursuite de la régénération ou du rééquilibrage (2), interventions pendant le pouls avec une possibilité de visualiser les effets à long terme (3). Une courte impulsion de 2 jours sans poursuite ultérieure donnera un aperçu d’un état quasi basal des cellules TERT+, car ces cellules auront peu de temps pour s’activer, proliférer, migrer ou se différencier (4). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Graphique 3. Nettoyage cérébral des cerveaux de souris mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. (A) Section sagittale de sections cérébrales de 1 mm après fixation. (B) Les sections individuelles du cerveau sont placées dans des tubes de 5 mL pour la clairance cérébrale iDISCO39. (C) Les cerveaux nettoyés sont placés dans des boîtes à fond de verre et immergés dans du DBE pour l’appariement de l’indice de réfraction lors de l’acquisition de l’image. (D) Capturez toute la zone du cerveau sous la forme d’une série de piles Z qui seront carrelées ensemble pour former une image 3D complète du cerveau. Il peut ensuite s’agir d’une intensité maximale Z projetée pour créer une image 2D à partir du jeu de données 3D. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Graphique 4. Traçage de la lignée des cerveaux de souris adultes mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG après un pouls de 3 semaines et une poursuite de 11 jours de doxycycline. (A) Section cérébrale effacée de la souris adulte mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG avec des zones spécifiques du signal mGFP montrées avec des inserts (N = 3 souris mâles). (B-C) Image représentative du plexus choroïde mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG identifiant les SPFC mGFP+ (B) et les types de cellules mGFP+ plus petits et plus faibles (C; N = 4 mâles, N = 6 femelles). (D) Image représentative de mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG célia de Bergmann cérébelleux (brillant) et de cellules panier dans la couche moléculaire du cervelet (dim; N = 4 mâles, N = 6 femelles). (E) Image représentative de la couche glomérulaire olfactive des cerveaux mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. Les lignes pointillées indiquent des compartiments glomérulaires (N = 4 mâles, N = 6 femelles). Les barres d’échelle sont de 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire 1. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire 2. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

Une méthode pour la création, l’utilisation et l’analyse d’une triple lignée transgénique traçant la lignée de souris marquant les cellules souches dans le cerveau de la souris adulte in vivo est décrite. Lorsqu’il est combiné avec l’immunocoloration ou la clairance cérébrale, l’identification et la caractérisation des cellules fluorescentes tracées à travers le cerveau peuvent être réalisées. Cette technique offre la capacité de comprendre le potentiel plastique/régénératif/remodelant des cellules souches marquées lorsqu’elles s’activent, migrent, se différencient ou prolifèrent. Alors que les données antérieures obtenues par rétention d’étiquettes avec la thymidine-H3 et BrdU ont conclu que le V-SVZ, le bulbe olfactif et la zone sous-solulaire du gyrus denté étaient les seules régions cérébrales neurogènes chez les mammifères adultes 2,3,4,5,6,7,8,43, il est maintenant entendu que la neurogenèse adulte se produit également dans le cortex 44, hypothalamus45,46 et striatum 47,48,49, ainsi que d’autres niches potentiellement nouvelles qui n’ont pas été bien étudiées. La gliogenèse adulte, le processus par lequel les cellules précurseurs gliales créent des astrocytes et des oligodendrocytes nouveau-nés, se produit également dans tout le cerveau37, et la glie et les neurones sont supposés dériver de la même cellule souche multipotente. Pour ces raisons, les études de traçage de lignée ont joué un rôle essentiel dans la compréhension du rôle de divers types de cellules souches qui contribuent à reconstituer et à régénérer les neurones et la glie dans le cerveau des mammifères adultes (examinés dans50).

Pour les études sur la plasticité cérébrale adulte, l’âge optimal est de 12 semaines, lorsque le cerveau murin a terminé son développement51. Lors de la planification de la longueur de l’impulsion de doxycycline et de la poursuite ultérieure, une compréhension du processus d’intérêt est cruciale, de sorte que le moment de la poursuite de l’impulsion soit suffisamment long pour permettre aux processus d’intérêt de se produire. Par exemple, la création de neurones nouveau-nés dans le bulbe olfactif à partir de cellules souches neurales adultes (ANSC) dans la V-SVZ est d’environ 4 semaines, comme déterminé par des études de traçage de lignée précédentes52. Une étude de chasse au pouls qui étiquetera les ANSC dans la V-SVZ doit donc se situer dans ce délai pour permettre aux ANSC de la V-SVZ de se diviser, pour que ces ANSC se différencient en types de cellules intermédiaires et pour que ces types de cellules intermédiaires migrent vers le bulbe olfactif et se différencient en neurones nés adultes. La durée de la poursuite déterminera la durée pendant laquelle les cellules marquées et leur progéniture doivent poursuivre leur migration et leur différenciation, bien que ces processus se produisent également pendant le pouls. Dans l’ensemble, il est important de comprendre les processus impliqués, car la chronologie de chaque expérience de traçage de lignée doit permettre aux processus appropriés de se produire.

Bien que ce manuscrit détaille le système Tet-On, il existe d’autres transgènes traçant la lignée qui peuvent être utilisés. Le transgène CreERT2 permet l’expression d’une Cre recombinase qui n’est active qu’en présence de tamoxifène ou de 4-OHT, un dérivé du tamoxifène. Lorsque ce Cre est régulé par un promoteur d’intérêt, l’administration de 4-OHT ou de tamoxifène ne produira la recombinaison du Cre que dans les cellules qui expriment ce promoteur. Lorsqu’elle est associée à un gène rapporteur tel que Rosa-LSL-GFP ou Rosa-mTmG, la recombinaison Cre-lox marquera de manière indélébile les cellules qui expriment Cre pendant l’administration de tamoxifène. Un inconvénient de ce système est l’utilisation du tamoxifène, qui a des effets indésirables durables sur la neurogenèse dans le cerveau prénatal et adulte17. Pour cette raison, les études de traçage de lignée avec des lignées CreERT2 devront tenir compte des mises en garde impliquées.

Les études de traçage de lignée dans le cerveau adulte sont souvent réalisées avec des marqueurs de cellules souches telles que Nestin ou des marqueurs de cellules précurseurs gliales, y compris NG253,54. Bien que les données résultantes indiquent le renouvellement et la différenciation de ces cellules en types de cellules matures nouveau-nées, l’expression de ces marqueurs par divers autres types de cellules dans le cerveau adulte peut être confondante. Par exemple, Nestin, une protéine de filament intermédiaire impliquée dans la mitose55, est également exprimée par les neurones matures56 et les cellules méningéesde type 57. D’autres marqueurs de cellules souches comprennent la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP)58,59 et le transporteur d’aspartate de glutamate 1 (GLAST)60, qui sont exprimés par les astrocytes dans tout le cerveau adulteainsi que 61. Pour cette raison, des études de traçage de lignée avec des marqueurs supplémentaires sont nécessaires. Alors que nous en apprenons davantage sur l’impact général de la plasticité adulte dans le cerveau, la caractérisation et l’analyse des cellules qui jouent un rôle dans ces processus et leur progéniture restent d’une importance vitale pour notre compréhension des voies neurogènes et gliogéniques impliquées dans la santé neurodégénérative et plus encore.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier la Dre Diana Carlone (Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School) et le Dr Matthew Lynes (Joslin Diabetes Center; Maine Medical Center Research Institute) pour des conseils utilisant des animaux mTert-rtTA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody diluent Agilent S080983-2
Antigen Retrieval Solution Agilent S2367
anti-GFP antibody Invitrogen A2311 Use at 1:500-1:000
Acetone Fisher Scientific A18-4
B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J The Jackson Laboratory JAX:006234
B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J The Jackson Laboratory JAX:007676
Blocking Solution (IHC) Millipore Sigma 20773
Blunt needle BSTEAN X0012SYHIV
Coronal brain block Braintree BS-2000C
Cover slip Corning 2850-22
Cryostat Leica CM1900
DAPI Sigma-Aldrich D564
Dibenzyl ether Millipore Sigma 33630
Dichloromethane Sigma-Aldrich 270997
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
Donkey Serum Sigma-Aldrich D9663
Doxycycline Hyclate Sigma-Aldrich D9891
Glycine Bio-Rad 161-0718
Heparin Sodium Salt from Porcine Mucosa Sigma-Aldrich H3393
Histochoice Molecular Biology Tissue Fixative Amresco H120 This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)
Hydrogen Peroxide Solution Sigma-Aldrich 516813
IHC Select TBS Rinse Buffer Millipore Sigma 20845
Ketamine Westward 0143-95095-10 This product requires a DEA license for storage and use.
Methanol Fisher Scientific A452-4
Microscope Slides Fisherbrand 12-550-15
Milipore Block Millipore 20773
Mounting medium Millipore Sigma 5013
Optimal Cutting Temperature Solution Sakura 4583
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
PBS Solution (10X) Teknova P0496
Sagittal brain block Braintree RBM-2000S
Saline Braun S8004-5264
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Sudan (Typogen) Black Millipore Sigma 199664
Tetrahydrofuran Sigma-Aldrich 186562
Tissue cartridge Simport M512
Triton X-100 Bio-Rad 1610407
Tween-20 Millipore Sigma 655205
Xylazine AnaSed sc-362950Rx

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carlone, D. L., et al. Telomerase expression marks transitional growth-associated skeletal progenitor/stem cells. Stem Cells. 39 (3), 296-305 (2021).
  2. Altman, J., Das, G. D. Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats. Journal of Comparative Neurology. 124 (3), 319-335 (1965).
  3. Cameron, H. A., Gould, E. Adult neurogenesis is regulated by adrenal steroids in the dentate gyrus. Neuroscience. 61 (2), 203-209 (1994).
  4. Kaplan, M. S., Hinds, J. W. Neurogenesis in the adult rat: electron microscopic analysis of light radioautographs. Science. 197 (4308), 1092-1094 (1977).
  5. Gould, E., et al. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult tree shrew is regulated by psychosocial stress and NMDA receptor activation. Journal of Neuroscience. 17 (7), 2492-2498 (1997).
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Neurosciences numéro 183
Traçage de la lignée des cellules souches inductibles marquées par fluorescence dans le cerveau de souris adulte
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Jensen, G. S., Willows, J. W.,… More

Jensen, G. S., Willows, J. W., Breault, D. T., Townsend, K. L. Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain. J. Vis. Exp. (183), e63998, doi:10.3791/63998 (2022).

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